[논문]옥돔과 옥두어 판별을 위한 PCR 검사법 개발과 검증

김나예슬; 양지영; 김중범

doi:10.9721/kjfst.2019.51.3.295

옥돔과 옥두어 판별을 위한 PCR 검사법 개발과 검증
Development and validation of a PCR method to discriminate between Branchiostegus japonicus and Branchiostegus albus 원문보기

한국식품과학회지 = Korean journal of food science and technology, v.51 no.3, 2019년, pp.295 - 299

김나예슬 (순천대학교 식품공학과) , 양지영 (부경대학교 식품공학과) , 김중범 (순천대학교 식품공학과)

초록
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본 연구에서는 형태학적으로 판별이 어려운 옥돔과 옥두어의 종 특이 primer를 개발, 검증한 후 모니터링을 통해 위변조 된 옥돔의 유통을 예방하고자 하였다. 옥돔과 옥두어 염기서열은 clustal omega 프로그램을 이용하여 정리하였고, primer3 프로그램을 이용하여 primer를 설계하였다. Multiplex PCR 결과는 옥돔과 옥두어에 대한 종 특이적 증폭이 확인되었고, PCR 반응을 확인하기 위한 공통 유전자에 대한 증폭이 확인되었다. 옥돔을 288 bp, 옥두어를 159 bp, 공통 유전자를 502 bp로 증폭되어 각각 PCR product 사이에 100 bp 이상 차이가 나타나 정확하게 판별이 가능하였다. Multiplex PCR 민감도 실험결과 옥돔 primer가 1 ng, 옥두어 primer가 1 ng, 공통 유전자 primer가 1 ng까지 밴드가 확인되었다. 모니터링 실험결과, 옥돔 38건, 옥두어 13건으로 판정되어 시료의 어종과 실험결과가 100% 일치함을 확인하였고, 위변조 사례는 나타나지 않았다. 본 실험에서 개발된 multiplex PCR 방법은 특이도와 민감도가 확보되었고 모니터링을 통해 유통, 판매되고 있는 옥돔과 옥두어의 판별에 적합함을 확인하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

We developed and validated species-specific primers for Branchiostegus japonicus and Branchiostegus albus to prevent the sale of B. albus as B. japonicus. Primers for B. japonicus and B. albus were designed against the cytochrome b gene. Multiplex PCR showed a 288 bp amplicon for B. japonicus, a 159 bp amplicon for B. albus, and a 502 bp amplicon for the internal control. The PCR product bands for B. japonicus, B. albus, and the internal control were present at 1 ng each. The specificity and sensitivity of the primers developed in this study were validated by testing 38 B. japonicus strains and 13 B. albus strains. Using this monitoring method, fake fish did not appear due to the agreement between the experimental results and the species. Therefore, the developed multiplex PCR method was suitable for differentiating B. japonicus and B. albus.

주제어

표/그림 (4)

표 Table 1. Primer sequence designed in this study
그림 Fig. 1. Multiplex PCR specificity of B. japonicus and B. albus.
그림 Fig. 2. Multiplex PCR sensitivity of B. japonicus and B. albus.
표 Table 2. Monitoring results of B. japonicus and B. albus on the market

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 형태학적으로 유사하여 가짜식품으로 판매, 유통 될 수 있는 옥돔과 옥두어의 종 특이 primer를 개발하고 개발된 판별법의 검증과 모니터링을 통해 위변조 된 옥돔의 유통을 사전에 예방하고자 하였다.
본 연구에서는 형태학적으로 판별이 어려운 옥돔과 옥두어의 종 특이 primer를 개발, 검증한 후 모니터링을 통해 위변조 된 옥돔의 유통을 예방하고자 하였다. 옥돔과 옥두어 염기서열은 clustal omega 프로그램을 이용하여 정리하였고, primer3 프로그램을 이용하여 primer를 설계하였다.

제안 방법

National center for biotechnology information (NCBI, http:// www.ncbi.nlm.nih.gov)에 등록되어 있는 옥돔과 옥두어 미토콘드리아 유전자 전체 염기서열 중 cytochrome b gene을 대상으로 옥돔과 옥두어 종 특이적 primer와 공통 유전자 primer를 설계하였다. 염기서열의 정렬은 clustal omega (EMBL, http://www.
PCR 반응액은 각각 genomic DNA 5 µL (10 ng), primer 4 µL (10 pmol), 멸균증류수(distilled water) 11 µL를 혼합하여 반응액의 총 용량이 20 µL가 되도록 하였다.
PCR 반응은 AccuPower® PCR PreMix (Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하였고 AllInOneCyclerTM Fast 96 well PCR system (Bioneer, Daejeon, Korea) 기기를 이용하여 실험하였다.
PCR 반응조건은 initial denaturation을 95°C에 서 5분 실시한 후, denaturation을 95°C에서 20초, annealing을 52°C에서 20초, extension을 72°C에서 30초로 25 cycle을 반복하고 마지막으로 extension을 72°C에서 5분간 실시하여 PCR을 종료하였다.
본 연구에서는 형태학적으로 판별이 어려운 옥돔과 옥두어의 종 특이 primer를 개발, 검증한 후 모니터링을 통해 위변조 된 옥돔의 유통을 예방하고자 하였다. 옥돔과 옥두어 염기서열은 clustal omega 프로그램을 이용하여 정리하였고, primer3 프로그램을 이용하여 primer를 설계하였다. Multiplex PCR 결과는 옥돔과 옥두어에 대한 종 특이적 증폭이 확인되었고, PCR 반응을 확인하기 위한 공통 유전자에 대한 증폭이 확인되었다.
옥두어를 옥돔으로 유통, 판매되는 현황을 파악하기 위하여 옥돔, 옥두어 시료 51건을 개발된 multiplex PCR로 실험하였다.
종 특이 primer 및 공통 유전자 primer 설계를 위하여 clustal omega 프로그램을 이용하여 염기서열을 정리하고, primer3 프로그램으로 primer 설계를 진행하였다(Table 1).
종 특이 primer의 특이도는 옥돔, 옥두어 표준시료 각각 2건과 negative control (멸균증류수), 그 외에 어종 20건(참다랑어, 황다랑어, 눈다랑어, 새치, 녹새치, 황새치, 낙지, 오징어, 참조기, 명태, 꽁치, 갈치, 숭어, 삼치, 대구, 광어, 고등어, 부세, 가자미, 연어)을 사용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA 농도가 10ng이 되도록 희석하여 multiplex PCR의 template DNA로 사용하였으며 3반복 실험하였다.
민감도란 “분석 대상물질의 농도 변화에 따른 측정값의 변화에 대한 비율”을 말한다(CAC, 2019; MFDS, 2019). 주형으로 사용된 옥돔과 옥두어 genomic DNA의 농도는 100, 10, 5, 1, 0.1 ng으로 희석하여 multiplex PCR의 template DNA로 사용하였다. Multiplex PCR 결과 옥돔 primer가 1 ng, 옥두어 primer가 1 ng, 공통 유전자 primer가 1 ng까지 밴드가 확인되었다(Fig.
증폭산물 확인을 위하여 1.5% 아가로즈겔에 PCR product 3 µL를 로딩하고 110 V에서 30분간 전기영동을 하였다.
종 특이 primer의 특이도는 옥돔, 옥두어 표준시료 각각 2건과 negative control (멸균증류수), 그 외에 어종 20건(참다랑어, 황다랑어, 눈다랑어, 새치, 녹새치, 황새치, 낙지, 오징어, 참조기, 명태, 꽁치, 갈치, 숭어, 삼치, 대구, 광어, 고등어, 부세, 가자미, 연어)을 사용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA 농도가 10ng이 되도록 희석하여 multiplex PCR의 template DNA로 사용하였으며 3반복 실험하였다.
각 시료의 genomic DNA는 PowerPrepTM DNA Extraction from Food and Feed Kit (Kogenebiotech, Seoul, Korea)를 이용하여 제조사의 권장 방법에 따라 추출하였다. 추출한 genomic DNA의 농도는 PICO 200 UV/Vis Spectrophotometer (Picodrop, Hinxton, UK)를 이용하여 측정하였다.
1 ng의 농도가 되도록 희석하였다. 희석된 DNA를 single PCR과 multiplex PCR의 template DNA로 하였으며 3반복 실험하였다.

대상 데이터

본 실험에서 개발된 multiplex PCR을 이용하여 시중에서 유통, 판매되고 있는 옥돔과 옥두어 시료 51건을 모니터링 하였다(Table 2). 실험결과는 옥돔 38건, 옥두어 13건으로 판정되어 시료의 어종과 실험결과가 100% 일치함을 확인하였고, 옥돔과 옥두어의 위변조 사례는 나타나지 않았다.
본 연구에 사용된 옥돔(B. japonicus), 옥두어(B. albus) 등 표준 시료는 부경대학교 식품공학과에서 제공 받아 사용하였고, 모니터링은 시중 유통 중인 총 51건의 어류를 구입하여 사용하였다.
gov)에 등록되어 있는 옥돔과 옥두어 미토콘드리아 유전자 전체 염기서열 중 cytochrome b gene을 대상으로 옥돔과 옥두어 종 특이적 primer와 공통 유전자 primer를 설계하였다. 염기서열의 정렬은 clustal omega (EMBL, http://www.ebi.ac.uk/ Tools/msa/clustalo)를 이용하였다. primer는 product size 150~500 bp, GC percent 30-60%로 primer 3 (http://primer3.
옥돔과 옥두어 판별을 위한 종 특이 primer 개발은 NCBI에 등록되어 있는 cytochrome b 유전자 영역을 대상으로 하였다. cytochrome b 유전자는 cytochrome c, 16S rRNA 등과 함께 염기서열이 널리 알려져 있는 유전자영역이다(Irwin 등, 1991).

이론/모형

각 시료의 genomic DNA는 PowerPrepTM DNA Extraction from Food and Feed Kit (Kogenebiotech, Seoul, Korea)를 이용하여 제조사의 권장 방법에 따라 추출하였다. 추출한 genomic DNA의 농도는 PICO 200 UV/Vis Spectrophotometer (Picodrop, Hinxton, UK)를 이용하여 측정하였다.

성능/효과

1 ng으로 희석하여 multiplex PCR의 template DNA로 사용하였다. Multiplex PCR 결과 옥돔 primer가 1 ng, 옥두어 primer가 1 ng, 공통 유전자 primer가 1 ng까지 밴드가 확인되었다(Fig. 2). 이러한 결과를 종합하여 가장 낮은 민감도인 1 ng을 multiplex PCR primer의 민감도로 판정하였으며 PCR 분석법에서 template DNA 농도를 100 ng 이하로 설정한다는 일반적 규칙을 만족하였다(Kim 등, 2014; Kim 등, 2015a; Kim 등, 2015b; Lee 등, 2004; Park 등, 2013; Song 등, 2008).
특이도란 “목적하는 대상만을 선택적으로 검출하는 능력 및 목적하지 않는 대상을 구별할 수 있는 능력”을 말한다(CAC, 2019; MFDS, 2019). Multiplex PCR 결과는 옥돔과 옥두어 종특이적 primer가 각각 옥돔과 옥두어 template DNA만을 증폭하여 각각 primer의 목적에 적합한 종특이적 증폭이 확인되었다. 공통 유전자 primer는 옥돔과 옥두어를 포함하여 눈다랑어, 새치, 녹새치, 참조기, 삼치, 연어의 template DNA만을 증폭하여 나머지 12종의 어류에 대한 DNA 증폭을 확인할 수 없었다.
그러나 본 연구의 목적인 옥돔과 옥두어에 대해 DNA 증폭을 나타내 PCR 반응 여부를 확인하기 위한 공통 유전자 primer로서 적합함을 확인하였다. Multiplex PCR 결과는 옥돔과 옥두어에 대한 종 특이적 증폭이 확인되었고, PCR 반응을 확인하기 위한 공통 유전자에 대한 증폭이 확인되었다(Fig. 1). 또한 옥돔을 288 bp, 옥두어를 159 bp, 공통 유전자를 502 bp로 증폭되어 각각 PCR product 사이에 100 bp 이상 차이가 나타나 육안으로 정확하게 판별이 가능하였다(Noh 등, 2016)
그러나 본 연구의 목적인 옥돔과 옥두어에 대해 DNA 증폭을 나타내 PCR 반응 여부를 확인하기 위한 공통 유전자 primer로서 적합함을 확인하였다. Multiplex PCR 결과는 옥돔과 옥두어에 대한 종 특이적 증폭이 확인되었고, PCR 반응을 확인하기 위한 공통 유전자에 대한 증폭이 확인되었다(Fig. 1).
옥돔을 288 bp, 옥두어를 159 bp, 공통 유전자를 502 bp로 증폭되어 각각 PCR product 사이에 100 bp 이상 차이가 나타나 정확하게 판별이 가능하였다. Multiplex PCR 민감도 실험결과 옥돔 primer가 1 ng, 옥두어 primer가 1 ng, 공통 유전자 primer가 1 ng까지 밴드가 확인되었다. 모니터링 실험결과, 옥돔 38건, 옥두어 13건으로 판정되어 시료의 어종과 실험결과가 100% 일치함을 확인하였고, 위변조 사례는 나타나지 않았다.
primer3 프로그램의 조건은 product size 150- 500 bp, GC percent 30-60%로 하였다. PCR 실험결과 옥돔 primer는 288 bp, 옥두어 primer는 159 bp, 공통 유전자 primer는 502 bp에서 증폭이 확인되었다.
Multiplex PCR 결과는 옥돔과 옥두어 종특이적 primer가 각각 옥돔과 옥두어 template DNA만을 증폭하여 각각 primer의 목적에 적합한 종특이적 증폭이 확인되었다. 공통 유전자 primer는 옥돔과 옥두어를 포함하여 눈다랑어, 새치, 녹새치, 참조기, 삼치, 연어의 template DNA만을 증폭하여 나머지 12종의 어류에 대한 DNA 증폭을 확인할 수 없었다. 그러나 본 연구의 목적인 옥돔과 옥두어에 대해 DNA 증폭을 나타내 PCR 반응 여부를 확인하기 위한 공통 유전자 primer로서 적합함을 확인하였다.
공통 유전자 primer는 옥돔과 옥두어를 포함하여 눈다랑어, 새치, 녹새치, 참조기, 삼치, 연어의 template DNA만을 증폭하여 나머지 12종의 어류에 대한 DNA 증폭을 확인할 수 없었다. 그러나 본 연구의 목적인 옥돔과 옥두어에 대해 DNA 증폭을 나타내 PCR 반응 여부를 확인하기 위한 공통 유전자 primer로서 적합함을 확인하였다. Multiplex PCR 결과는 옥돔과 옥두어에 대한 종 특이적 증폭이 확인되었고, PCR 반응을 확인하기 위한 공통 유전자에 대한 증폭이 확인되었다(Fig.
Multiplex PCR 민감도 실험결과 옥돔 primer가 1 ng, 옥두어 primer가 1 ng, 공통 유전자 primer가 1 ng까지 밴드가 확인되었다. 모니터링 실험결과, 옥돔 38건, 옥두어 13건으로 판정되어 시료의 어종과 실험결과가 100% 일치함을 확인하였고, 위변조 사례는 나타나지 않았다. 본 실험에서 개발된 multiplex PCR 방법은 특이도와 민감도가 확보되었고 모니터링을 통해 유통, 판매되고 있는 옥돔과 옥두어의 판별에 적합함을 확인하였다.
모니터링 실험결과, 옥돔 38건, 옥두어 13건으로 판정되어 시료의 어종과 실험결과가 100% 일치함을 확인하였고, 위변조 사례는 나타나지 않았다. 본 실험에서 개발된 multiplex PCR 방법은 특이도와 민감도가 확보되었고 모니터링을 통해 유통, 판매되고 있는 옥돔과 옥두어의 판별에 적합함을 확인하였다.
이러한 결과를 종합하여 가장 낮은 민감도인 1 ng을 multiplex PCR primer의 민감도로 판정하였으며 PCR 분석법에서 template DNA 농도를 100 ng 이하로 설정한다는 일반적 규칙을 만족하였다(Kim 등, 2014; Kim 등, 2015a; Kim 등, 2015b; Lee 등, 2004; Park 등, 2013; Song 등, 2008). 본 실험에서 개발된 multiplex PCR 방법은 특이도와 민감도가 확보되었으며 한 번의 실험으로 옥돔과 옥두어 모두를 검출할 수 있어 비용과 노동력을 절감할 수 있었다.
본 실험에서 개발된 multiplex PCR을 이용하여 시중에서 유통, 판매되고 있는 옥돔과 옥두어 시료 51건을 모니터링 하였다(Table 2). 실험결과는 옥돔 38건, 옥두어 13건으로 판정되어 시료의 어종과 실험결과가 100% 일치함을 확인하였고, 옥돔과 옥두어의 위변조 사례는 나타나지 않았다. 가공식품은 열, 건조 등의 처리에 의해 단백질 변성이 일어날 수 있어 최근 단백질에 비해 안정한 유전자를 분석하여 원재료를 판별한다(Aida 등, 2005).
Multiplex PCR 결과는 옥돔과 옥두어에 대한 종 특이적 증폭이 확인되었고, PCR 반응을 확인하기 위한 공통 유전자에 대한 증폭이 확인되었다. 옥돔을 288 bp, 옥두어를 159 bp, 공통 유전자를 502 bp로 증폭되어 각각 PCR product 사이에 100 bp 이상 차이가 나타나 정확하게 판별이 가능하였다. Multiplex PCR 민감도 실험결과 옥돔 primer가 1 ng, 옥두어 primer가 1 ng, 공통 유전자 primer가 1 ng까지 밴드가 확인되었다.
2). 이러한 결과를 종합하여 가장 낮은 민감도인 1 ng을 multiplex PCR primer의 민감도로 판정하였으며 PCR 분석법에서 template DNA 농도를 100 ng 이하로 설정한다는 일반적 규칙을 만족하였다(Kim 등, 2014; Kim 등, 2015a; Kim 등, 2015b; Lee 등, 2004; Park 등, 2013; Song 등, 2008). 본 실험에서 개발된 multiplex PCR 방법은 특이도와 민감도가 확보되었으며 한 번의 실험으로 옥돔과 옥두어 모두를 검출할 수 있어 비용과 노동력을 절감할 수 있었다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	가공식품 분석에 유용한 유전자 분석법의 PCR에 대해 설명하시오.	최근 원재료 판별법은 유전자를 기초로 하는 유전자 분석법을 사용하며 가공식품의 분석에 유용하다 (Axayacatl와 Juan, 2008). 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)은 대표적인 유전자 분석법으로 특정 유전자 부위를 반복 합성하여 증폭된 유전자를 분석하는 방법이다. PCR은 높은 특이도와 민감도를 가지고, 단시간에 다수 시료를 분석할 수 있어(Hebert 등, 2003; Michael 등, 2005; Park 등, 2013) 단 백질 분석법이나 크로마토그래피법에 비해 간편하게 실험 할 수 있다.
	단백질 분석법의 한계점은 무엇인가?	원재료 판별법은 단백질 분석법이 있으며 대표적으로 등전점 전기영동 법(Isoelectric focusing, IEF), 모세관 전기영동법(capillary electrophoresis, CE), 면역효소측정법 등이 있다(Civera, 2003; Moretti 등, 2003). 단백질 분석법은 열, 건조 등의 가공 처리시 단백질 및 특이적항원의 변성에 의해 감수성이 떨어지고, 같은 종일 경우 단백질 발현이 유사하여 판별이 불가능한 문제점이 있다(Chung 등, 2017; Fabric 등, 2005; Folmer 등, 1994; Hebert 등, 2003; Kim 등, 2014; Michael 등, 2005). 이화학적 분석법을 바탕으로 하는 크로마토그래피에는 liquid chromatography, gas chromatography 등이 있으며 원재료에 포함된 특정 물질의 정성 및 정량이 가능하나 복잡한 실험 방법과 고가의 장비를 사용하는 단점이 있다(Schellenberg 등, 2010).
	가짜식품이란?	가짜식품(economically motivated adulteration, EMA)은 원재료를 속이고, 비교적 저렴한 원재료를 사용하여 부당한 방법으로 경제 적 이득을 취하기 위해 제조된 식품이다(Kim 등, 2014). 이종 혼합식품이나 가짜식품은 형태학적으로 유사하거나 가공처리 되어 시각, 미각 등의 관능적인 방법으로 판별하는데 한계를 가지고 있다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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