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문제 정의
- 핑크왐피의 다양한 활용 가능성에도 불구하고 핑크왐피의 독성이나 부작용을 확인하는 과학적인 시험법은 찾아보기 어려운 실정이다. 따라서 본 독성 연구는 핑크왐피 추출물의 독성반응과 그 안전성을 수컷 ICR 마우스에 3주 간 반복 경구투여 후, 기간 내에 발현되는 독성적 특성을 양적, 질적으로 평가하여 안전성을 확인하였다.
- 핑크왐피 추출물의 다양한 활성은 많이 보고가 되었으나, 독성 및 안전성에 관한 연구 결과는 비교적 찾아보기 어렵다. 따라서 본 연구는 3주간 핑크왐피 추출물의 반복 경구투여로 독성시험이 진행되었다. 독성시험은 대조군을 포함하여 100, 250,500, 1000, 및 2000 MPK 투여군으로 설정하였다.
제안 방법
- 3주간 핑크왐피 추출물을 반복 투여한 후, 복대정맥에서 채혈한 혈액에서 분리한 혈청을 이용하여 간기능(GOT, GPT, LDH,ALB, TP, T-BIL, D-BIL), 신장기능(BUN, CRE), 지질영양 관련(TCHO, TG), 전해질(I.P) 관련 지표들을 분석하였다(Table 2). 대조군과 농도별 핑크왐피 추출물을 투여한 모든 군의 결과는 대부분의 항목들에서 통계적 유의성을 관찰 할 수 없었다(Table 2).
- 3주간 핑크왐피 추출물을 반복 투여한 후, 복대정맥에서 채혈한 혈액으로 WBC, RBC, HGB, HCT, MCV, MCH, MCHC,PLT를 분석하였다(Table 1). 핑크왐피 추출물 1000 MPK과2000 MPK 투여군에서 대조군과 비교하여 WBC가 감소하는 경향을 보였다.
- 따라서 본 연구는 3주간 핑크왐피 추출물의 반복 경구투여로 독성시험이 진행되었다. 독성시험은 대조군을 포함하여 100, 250,500, 1000, 및 2000 MPK 투여군으로 설정하였다. 핑크왐피 추출물의 3주 반복 경구투여 후, 일반증상, 무게변화, 혈액학적 및 혈액생화학적 검사를 하였다.
- 모든 실험동물은 매일 1회 이상 일반 상태의 변화, 독성증상 및 사망 동물의 유무를 전 실험 기간 동안 관찰하였다. 체중 측정은 투여 개시 직전에 1회, 투여 후 주 2회씩 3주간 측정하였으며, 3주 마지막 체중 측정은 부검 전일에 측정하였다.
- 시험 종료 후 모든 생존동물을 흡입마취제 아이소플로란 (Isoflurane)으로 호흡 마취 후 복대정맥에서 혈액을 채취한 후, 복대정맥을 절단하여 방혈시켜 육안으로 외부소견, 피하, 복강 장기, 흉강장기 및 뇌에 대하여 검사하였다[14].
- 시험 종료 후 생존한 모든 동물에 대하여 부검 전에 3시간 절식시키고, 흡입마취제 아이소플로란(Isoflurane)으로 호흡 마취 후 복대정맥으로부터 채혈하여 항응고제인 EDTA가 포함된 채혈튜브(BD Vacutainer K2E, BD Diagnostics, Franklin Lakes,NJ, USA)에 넣고 30분간 교반 후, CBC 분석기(BECKMANCOULTER AcT diff, Fullerton, CA, USA)를 이용하여 white blood cell count (WBC), red blood cell count (RBC),hemoglobin concentration (HGB), hematocrit (HCT), mean corpuscular volume (MCV), mean corpuscular hemoglobin(MCH), mean corpuscular hemoglobin concentration (MCHC),platelet (PLT)를 검사하였다[12].
- 시험물질 보관 냉장고에 보관된 시험물질은 순도에 대한 보정 없이 전자저울로 칭량하여 중량 그대로를 조제에 사용하였고, 정량의 시험물질을 멸균주사용수(중외주사용수, JW중외제약, 서울, 한국)를 사용하여 교반기로 현탁시켜 100, 250, 500, 1000,2000 mg/kg (MPK)을 규정 농도로 설정하여 조제하였다. 경구투여 한계용량으로 가장 많이 사용되는 2000 MPK로 설정한 후, 핑크왐피 추출물을 멸균주사용수에 균일하게 용해시켜 조제하였다.
- 모든 실험동물은 매일 1회 이상 일반 상태의 변화, 독성증상 및 사망 동물의 유무를 전 실험 기간 동안 관찰하였다. 체중 측정은 투여 개시 직전에 1회, 투여 후 주 2회씩 3주간 측정하였으며, 3주 마지막 체중 측정은 부검 전일에 측정하였다. 사료섭취량은 투여 개시 전, 투여 개시 후 주 2회 특정하였으며 공급과동일한 시간대에 잔량을 측정하여 섭취량을 산출하였다[1].
- 나머지 시험군(1000, 500, 250 및 100 MPK)은 2배수 간격으로 단계별 희석을 통하여 설정하였다. 핑크왐피 추출물은 경구투여 방법으로 1회/일, 6일/주, 3주간 진행하였고, 조제 후 바로 투여되기 때문에 안정성 시험은 수행하지 않았다[11].
- 독성시험은 대조군을 포함하여 100, 250,500, 1000, 및 2000 MPK 투여군으로 설정하였다. 핑크왐피 추출물의 3주 반복 경구투여 후, 일반증상, 무게변화, 혈액학적 및 혈액생화학적 검사를 하였다. 혈액생화학적 검사 중 일부 평가항목(GOT, TG, GLU, T-BIL, D-BIL, I.
- 핑크왐피(Clausena excavata)는 2017년 6월 환경부 국립생물자원관으로부터 분양 받았으며, 표본은 (재)경기도경제과학진흥원바이오센터 천연물연구팀에 보관중이다. 핑크왐피 추출물의 제조는 상온에서 50% 에탄올(95% 발효주정, Samchun chemical) 30 L를 건조된 핑크왐피 50 kg에 가하여 3일씩 2회 반복 추출 후 여과하였다. 핑크왐피 추출물은 여과된 50% 에탄올 여액을 감압 농축(Rotavapor N-1000, Eyela, Tokyo, Japan) 후 동결 건조(FD8508, Ilshin Lab CO.
대상 데이터
- 실험동물은 5주령의 특정병원균 부재(Specific Pathogen Free) 수컷 Crl: CD1 (ICR) mouse 를 3주 반복 투여 독성시험을 위해(주)오리엔트바이오(경기도 성남시 중원구 상대원동 143-1번지)에서 구입하였다. 실험실에서 1주일 순화기간 동안 실험동물의 일반증상을 관찰하여 이상이 없는 실험동물을 선택하여 본 실험에 사용하였다.
- 실험동물은 5주령의 특정병원균 부재(Specific Pathogen Free) 수컷 Crl: CD1 (ICR) mouse 를 3주 반복 투여 독성시험을 위해(주)오리엔트바이오(경기도 성남시 중원구 상대원동 143-1번지)에서 구입하였다. 실험실에서 1주일 순화기간 동안 실험동물의 일반증상을 관찰하여 이상이 없는 실험동물을 선택하여 본 실험에 사용하였다. 모든 실험동물은 군당 10마리씩 배치하였다.
- 핑크왐피(Clausena excavata)는 2017년 6월 환경부 국립생물자원관으로부터 분양 받았으며, 표본은 (재)경기도경제과학진흥원바이오센터 천연물연구팀에 보관중이다. 핑크왐피 추출물의 제조는 상온에서 50% 에탄올(95% 발효주정, Samchun chemical) 30 L를 건조된 핑크왐피 50 kg에 가하여 3일씩 2회 반복 추출 후 여과하였다.
데이터처리
- 시험에서 확인된 결과는 one-way analysis of variance (ANOVA) 분석을 통하여 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 유의성이 인정될 경우 Student’s t-test (Microsoft Excel)를 실시하여 대조군과 시험군 간의 통계학적 유의성을 검정하였다(p <0.
- 시험에서 확인된 결과는 one-way analysis of variance (ANOVA) 분석을 통하여 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 유의성이 인정될 경우 Student’s t-test (Microsoft Excel)를 실시하여 대조군과 시험군 간의 통계학적 유의성을 검정하였다(p <0.01와 p <0.05).
성능/효과
- 3주간의 핑크왐피 추출물 투여기간 동안 체중측정결과 대조군과 비교하여 모든 실험동물에서 대조군과 유사한 정상적인 체중증가가 관찰되었다(Fig. 1).
- 그러나 대조군과 비교하여 GOT 수치가 100 MPK에서 유의하게 증가하였고, TG 수치가 핑크왐피 추출물 250MPK 에서 유의하게 증가하였다. GLU 수치는 핑크왐피 추출물 1000 MPK를 제외하고 통계적으로 유의하게 증가하였다. 간 기능 지표인 T-BIL과 D-BIL 그리고 전해질 지표인 I.
- P)에서 대조군과 비교하여 증가와 감소하는 경향을 보였다. GLU의 증가는 용량의존성이 없었으며, 간기능과 관련된 GOT, GPT, T-BIL, D-BIL이용량의 존적으로 증가하지 않았으므로 간독성과 같은 독성학적 의미는 없는 것으로 판단된다. T-BIL, D-BIL, I.
- GLU 수치는 핑크왐피 추출물 1000 MPK를 제외하고 통계적으로 유의하게 증가하였다. 간 기능 지표인 T-BIL과 D-BIL 그리고 전해질 지표인 I.P에서 통계적으로 유의하게 감소하였다. 일부 항목에서 통계적으로 유의하게 증가하고 감소하는 결과가 나타났지만, 정상 범위 내에서의 증가와 감소로 핑크왐피 추출물의 투여에 의한 변화는 아닌 것으로 판단된다.
- 대조군과 농도별 핑크왐피 추출물을 투여한 모든 군의 결과는 대부분의 항목들에서 통계적 유의성을 관찰 할 수 없었다(Table 2). 그러나 대조군과 비교하여 GOT 수치가 100 MPK에서 유의하게 증가하였고, TG 수치가 핑크왐피 추출물 250MPK 에서 유의하게 증가하였다. GLU 수치는 핑크왐피 추출물 1000 MPK를 제외하고 통계적으로 유의하게 증가하였다.
- 이러한 변화는 핑크왐피추출물의 투여로 인한 영향이 아닌 경미한 변동으로서 정상 범위 내에서의 변화로 간주되어진다. 대조군을 포함한 모든 투여군에서 특별한 이상증상은 나타나지 않았고, 2000 MPK 이상에서 최대무독성용량이 판단된다. 본 연구 결과는 핑크왐피의과학적 안전성의 기초자료로 사용될 수 있을 것이다.
- P에서 통계적으로 유의하게 감소하였다. 일부 항목에서 통계적으로 유의하게 증가하고 감소하는 결과가 나타났지만, 정상 범위 내에서의 증가와 감소로 핑크왐피 추출물의 투여에 의한 변화는 아닌 것으로 판단된다.
- 3주간 핑크왐피 추출물을 반복 투여한 후, 복대정맥에서 채혈한 혈액으로 WBC, RBC, HGB, HCT, MCV, MCH, MCHC,PLT를 분석하였다(Table 1). 핑크왐피 추출물 1000 MPK과2000 MPK 투여군에서 대조군과 비교하여 WBC가 감소하는 경향을 보였다. 그러나 백혈구의 감소하는 범위가 크지 않았고 일반증상과 다른 임상병리학적 검사에서 백혈구의 감소와 연관지을 수 있는 소견이 발견되지 않았다.
- 핑크왐피 추출물의 3주간 투여기간 동안 시험물질의 영향으로 보이는 일반증상은 관찰되지 않았다. 또한 대조군을 포함한 모든 시험군에서 유의할 만한 이상증상과 사망동물은 없었다.
- 1). 핑크왐피 추출물의 투여로 체중의 유의성 있는 변화는 관찰되지 않았다. 시험기간 동안 핑크왐피추출물 투여로 인한 사료섭취량은 유의성 있는 변화는 관찰되지 않았다(Fig.
후속연구
- 대조군을 포함한 모든 투여군에서 특별한 이상증상은 나타나지 않았고, 2000 MPK 이상에서 최대무독성용량이 판단된다. 본 연구 결과는 핑크왐피의과학적 안전성의 기초자료로 사용될 수 있을 것이다. 이후에 추가적인 독성시험에 관한 연구가 진행된다면, 건강 기능성 식품 및 의약품과 같은 다양한 소재로 핑크왐피의 활용이 있을 것으로 사료된다.
- 핑크왐피 추출물은 항염증, 항균, 항침착, 면역 조절 및 항산화 작용과 같은 다양한 생물학적 활성이 보고되었다[8-10]. 이와 같은 핑크왐피의 다양한 활성은 건강기능성식품 및 의약품 개발에 이용될 것으로 예상된다. 핑크왐피의 다양한 활용 가능성에도 불구하고 핑크왐피의 독성이나 부작용을 확인하는 과학적인 시험법은 찾아보기 어려운 실정이다.
- 본 연구 결과는 핑크왐피의과학적 안전성의 기초자료로 사용될 수 있을 것이다. 이후에 추가적인 독성시험에 관한 연구가 진행된다면, 건강 기능성 식품 및 의약품과 같은 다양한 소재로 핑크왐피의 활용이 있을 것으로 사료된다.
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