[논문]섬유화 진행 간경변 조직 모델에서 Thymosin β4와 C-myc mRNA 융합 발현 연구

김진수; 박운규

doi:10.15207/jkcs.2019.10.6.065

섬유화 진행 간경변 조직 모델에서 Thymosin β4와 C-myc mRNA 융합 발현 연구
A Study on the Expression of Thymosin-β4 and c-Myc mRNA in the Model of liver cirrhosis with fibrosis 원문보기

한국융합학회논문지 = Journal of the Korea Convergence Society, v.10 no.6, 2019년, pp.65 - 71

초록
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이 연구의 목적은 간 섬유화로 인한 간경변 모델에서 c-Myc과, Thymosin-${\beta}4$ 유전자의 발현을 알아 보고자 실시하였으며 연구 방법은 2군으로 나누어 섬유화로 인한 간경변 모델 실험군과 증류수를 이용한 대조군으로 분류 한 후 실험을 하였다. 본 연구를 통한 결과는 간경변 모델 실험군은 대조군에 비하여 c-Myc과 Thymosin-${\beta}4$의 발현이 증가 되는 것을 뚜렷하게 알 수 있었고, 전자현미경적 검경 외에 여러 특수 염색을 통하여 간조직의 변화를 관찰 할 수 있었다. 결론적으로 기존 간기능 검사 관련 임상검사에서 질환 예방과 질환 판정 시 혈청학적 변화와 조직학적인 검사와 더불어 c-Myc과 Thymosin-${\beta}4$의 분자 기법을 통한 유전자의 발현 상태를 확인함으로써 간 질환 판정에 기여 할 수 있을 것으로 사료 되며, 향후 이 연구를 기반으로 실험군의 종류와 관련 유전자를 추가 하여 심도 있는 연구를 진행할 예정이다.

Abstract ▼ AI-Helper

The propose of this study has been conducted to examine expression of c-Myc and Thymosin-${\beta}4$ in liver cirrhosis model from liver fibrosis and For the method of study, the experiment was conducted in 2 groups; liver cirrhosis model experiment group due to liver fibrosis and control group with distilled water. This study outcome showed that liver cirrhosis model experiment group had significantly higher expression of c-Myc and Thymosin-${\beta}4$. with changes to hepatic tissue of special staining and electron microscopy. In conclusion, in clinical tests regarding liver function, molecular evaluation of c-Myc and Thymosin-${\beta}4$ and their expression along with serological change and histological assessment can be utilized as a reference for diagnosing liver disease for prevention and diagnosis of the disease, Based on this research in the future, we will carry out an in-depth study by adding the types of experimental groups and related genes.

주제어

표/그림 (11)

표 Table 1. Method of Hematoxylin & Eosin stain
표 Table 2. Transmission Electron Microscope : Method of TEM stain
표 Table 3. Method of Masson's Trichrom stain
표 Table 4. Method of Gomori Reticulum stain
그림 Fig. 1. Shapes of liver tissue in the TransmissionElectron Microscope.
그림 Fig. 2. H & E stain of liver tissue.
그림 Fig .3. Masson's Trichrom stain of liver tissue.
그림 Fig. 4. Reticular fiber stain of liver tissue.
표 Table 5. Primers used for the detection of gene expression
표 Table 6. Relative expression of β-actin, c-Myc and Thymosin-β₄ gene expression
표 Table 7. Cq values of gene expression in groups administered with CCl₄

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구는 간경변시 전자현미경적변화와 각종 특수 염색을 통한 광학 현미경적 조직학적인 변화를 알아보고 간 경변시 정상 조직에 비해 간세포내의 Thymosin-β4, c-Myc, 1의 mRNA 발현의 차이를 관찰함으로써 임상 진단 관련 참고 자료로 활용하고자 실시하였다.
본 연구는 암 전이나 혈관 재생에 관여 하는 Thymosinβ4 유전자와 c-Myc,종양 관련 유전자를 이용하여 간경변 모델을 통한 섬유화 된 간 조직 내에 조직학적 변화와 c-Myc,및 Thymosin-β4 발현 정도를 분석하고자 연구하였다.
이 연구에 보고자 하는 Thymosin-β4 와 c-Myc 유전자의 간 질환이 있을 때 발현 관련성을 보고자 하는 것이다.

제안 방법

10% 포르말린을 이용하여 실험모델에서 적출한 간 조직을 24시간 고정 하고 조직표본을 제작과정을 통하여 4~6μm 박절 하였다.
20~25g, 10주령 BALB/c를 공급받아 1주일간 최적 환경에 적응 적응시킨 후 실험모델 이주영 방법[25]을 채택하여 CCl4 (Aldrich, USA) 및 Olive oil (Extra Virgin, ITali)의 혼합물 (2 volume : 1 volume,1ml/kg)을 2회/주, 8주 동안 투여하여 간경변 실험 모델을 만들었다. 실험은 대조군(5), 실험군(5) 나누어 진행하였으며 구강 위관 영양법으로 투여한 후.
RNA추출 과정은 조직 파쇄 후 RNA Prep Kit를 사용하였으며 RNA 20 μl을 이용 42°C 60 분 역전사 시킨 후 Accupower GreenstarqPCR preMix Kit로 cDNA 만들었으며 Primers를 Table 5와 같이 이용 하여 95°C에서 20초, 56°C에서 45초 과정으로 40번 증폭을 실시하였다.
Real time PCR을 이용하여 케니스[26] 분석 방법을 통한 대조군과 실험군의 c-Myc및 Thymosin-β4 발현을 비교 하였다.
간 조직을 세절 한 후 1차 고정액 Glutaraldehyde, 2차 고정액 사산화 오스뮴 이용하여 고정 하였으며 탈수, 치환, 중합과정 등을 거쳐 전자현미경용 표본을 제작하고 투과 전자 현미경을 통하여 미세 구조를 관찰 하였다. Table 2
박절하여 제작한 절편에 매염제로 Bouin 용액을 이용 하였으며 Weigert iron hematoxylin에 10분, Biebrich scarlet-acid fuchsin 15분, aniline blue에 섬유질(아교섬유)를 염색 하였다. Table 3
박절한 절편을 산화, 표백, 감작, 은 침투, 환원, 조색, 정착 순서대로 관련 시약을 사용하여 세망섬유를 염색하였다. Table 4
20~25g, 10주령 BALB/c를 공급받아 1주일간 최적 환경에 적응 적응시킨 후 실험모델 이주영 방법[25]을 채택하여 CCl4 (Aldrich, USA) 및 Olive oil (Extra Virgin, ITali)의 혼합물 (2 volume : 1 volume,1ml/kg)을 2회/주, 8주 동안 투여하여 간경변 실험 모델을 만들었다. 실험은 대조군(5), 실험군(5) 나누어 진행하였으며 구강 위관 영양법으로 투여한 후. 8주 경과 후 Ether로 마취하여 희생시켰다.

대상 데이터

10% 포르말린을 이용하여 실험모델에서 적출한 간 조직을 24시간 고정 하고 조직표본을 제작과정을 통하여 4~6μm 박절 하였다. 핵 염색은 Harris- Hematoxylin(영동제약, 한국), 세포질은 eosin Y (YD Diagnostics,korea)을 이용하여 염색을 하였다. Table 1

이론/모형

적출한 간 조직을 –70℃에 냉동 보관 후 Real time PCR를 실시하였으며 케니스 방법[26]을 이용하여 유전자 결과를 분석하였다.

성능/효과

Hematoxylin& Eosin 염색은 실험군에서 간세포내의 핵 농축과 반응성 핵, 그리고 세포질내 액포 변성등 이상 세포들이 많이 분포하는 것을 알수 있었다.
Hematoxylin& Eosin 염색은 실험군에서 간세포내의 핵 농축과 반응성 핵, 그리고 세포질내 액포 변성등 이상 세포들이 많이 분포하는 것을 알수 있었다. M.T염색은 대조군과 실험군을 비교하였을 때 아교섬유 증식에 따른 섬유화로 실험군에서 간 소엽주위와 중심정맥 부위에 교원섬유가 다량분포하고 있는 것을 알 수 있었다. 세망섬유(GomoriReticulum) 염색은 세망섬유 변화를 관찰할 수 없었으나 간세둥이, 중심정맥 주위에 교원섬유가 실험군에서 다량분포하고 있는 것을 알 수 있었다.
M.T염색을 통하여 대조군과 실험군을 비교하였을 때 아교섬유 증식에 따른 섬유화로 실험군에서 간 소엽주위와 중심정맥 부위에 교원섬유가 다량 분포하고 있는 것을 알 수 있었다. Fig.
c-Myc및 Thymosin-β4 발현은 housekeeping gene인 β-actin 유전자 발현을 1로 기준하였을 때 CCl4를 투여한 실험군의 발현 양은 c-Myc 12.9, Thymosin-β4 85.3으로 실험군에서 뚜렷하게 유전자의 발현이 증가 됨을 알 수 있었다.
결과에 대하여 살펴보면 간조직 표면은 대조군에서는 외형적인 표면이 매끄러운 반면 섬유조직의 재생 결절로 실험군에서는 표면이 울퉁 불퉁 간경변 증상이 나타났다. 전자현미경적 조직관찰은 대조군에 비해 실험군에서는 핵주위에 각종 소기관들의 분포가 적었으며 미토콘드리아의 수도 적은 것을 알 수 있었다.
대조군에 비하여 실험군에서는 간세포내의 핵 농축과 반응성 핵, 그리고 세포질내 액포 변성등 이상 세포들이 많이 분포하는 것을 알 수 있었다. Fig.
대조군에서는 핵 주위에 과립 내형질 세망, 능선이 뚜렷한 미토콘드리아등 소기관들이 정상적으로 분포하고 있으나 실험군에서는 핵주위에 각종 소기관들의 분포가 적었으며 미토콘드리아의 수도 적은 것을 알 수 있었다. 특히 용해소체의 증가와 남아 있는 미토콘드리아 내막의 능선도 손상으로 인하여 뚜렷하지 못한 것을 알 수 있었다.
T염색은 대조군과 실험군을 비교하였을 때 아교섬유 증식에 따른 섬유화로 실험군에서 간 소엽주위와 중심정맥 부위에 교원섬유가 다량분포하고 있는 것을 알 수 있었다. 세망섬유(GomoriReticulum) 염색은 세망섬유 변화를 관찰할 수 없었으나 간세둥이, 중심정맥 주위에 교원섬유가 실험군에서 다량분포하고 있는 것을 알 수 있었다. c-Myc및 Thymosin-β₄ 발현은 housekeeping gene인 β-actin 유전자 발현을 1로 기준하였을 때 CCl₄를 투여한 실험군의 발현 양은 c-Myc 12.
결과에 대하여 살펴보면 간조직 표면은 대조군에서는 외형적인 표면이 매끄러운 반면 섬유조직의 재생 결절로 실험군에서는 표면이 울퉁 불퉁 간경변 증상이 나타났다. 전자현미경적 조직관찰은 대조군에 비해 실험군에서는 핵주위에 각종 소기관들의 분포가 적었으며 미토콘드리아의 수도 적은 것을 알 수 있었다. 특히 용해소체의 증가와 남아 있는 미토콘드리아 내막의 능선도 손상으로 인하여 뚜렷하지 못한 것을 알 수 있었다.
즉 정상적인 간에서 어떤 이유에 의한 손상으로 간경변 간경화 간암등 간 질환이 발생 하였을 때 일부 혈청학적 검사와 조직학적 변화와 더불어 c-Myc과 Thymosin-β4 유전자의 발현을 관찰하였을 때 차이가 있다는 것을 알 수 있었다.

후속연구

결론적으로 기존 간기능 검사 관련 임상검사에서 질환 예방과 판정 시 혈청학적 변화와 조직학적인 검사 외에 c-Myc 과 Thymosin-β₄의 분자 기법에 의한 유전자의 발현 상태를 확인함으로써 간 질환 판정 시 참고 자료로 활용 될 수 있을 것으로 사료 된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Thymosin-β4의 특징은 무엇인가?	이 연구에 보고자 하는 Thymosin-β4 와 c-Myc 유전자의 간 질환이 있을 때 발현 관련성을 보고자 하는 것이다. Thymosin-β4 는 성장인자[4-7]이며 4.9 kDa[8], G액틴의 분리과정[9,10],조직 손상 시 또는 암생성시 혈관의 생성 과정에 관여 하며[11,12] 배아세포 [13-15], 모낭 [16], 신생 혈관 초기[17] 종양 또는 종양전이 [18.19], 특히 전이에서도 흑색종 [20]과 섬유육종[21] 관련 전이 에서는 발현 양이 현저히 증가 된다고 알려져 있다. c-Myc (c- Myelocytomatosis oncogene)은 염색체 8번 장완 24번에 있으며 세포증식, Telomerase 발현, 그리고 leukemia, 폐암 등에서 발현이 높다고 알려져 있다[22].
	본 연구에서 간질환과 Thymosin-β4 와 c-Myc 유전자의 발현 관련성을 연구하는 것은 어떤 배경에 의한 것인가?	그러나 간 질환 관련 검사는 대부분이 AST, AFP, ALP등 혈청학적 검사나 고비용의 CT 검사, 초음파 검사를 통하여 진단이 대부분 이루어지고 있다. 따라서 간질환이 시작되었을 때 변화되는 관련 유전자를 검사함으로써 상대적으로 간장기의 상태를 더 정확히 알 수 있다면 진단하는데 많은 도움이 있을 것으로 예측이 된다. 이 연구에 보고자 하는 Thymosin-β4 와 c-Myc 유전자의 간 질환이 있을 때 발현 관련성을 보고자 하는 것이다.
	간경변은 무엇인가?	최근 현대인들의 각종 스트레스와 과도한 업무로 인한 피로 누적과 지나친 음주로 인하여 간 질환에 많이 노출되어 있으며 그 정도가 심한 즉, 간조직의 섬유화[1,2]로인한 재생 결절로 간 표면이 불규칙하고 굳어지는 간경변 환자도 상당히 많이 존재 한다[3]. 간경변은 그대로 방치시 간경화를 통해 간암으로 진행하게 된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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