혼합영양 조건하에서 Haematococcus sp.의 배지 최적화 및 대사산물 생산 Medium Optimization for Cell Growth and Metabolite Formation from Haematococcus sp. under Mixotrophic Cultivation원문보기
Haematococcus sp.를 대상으로 mixotroph 형태에서 배양을 위한 배지 최적화 연구를 수행하였다. 기본 배지로는 modified MS 배지가 적절했으며, 탄소원으로는 glucose가, 그리고 농도는 10 g/l가 적합하였다. 질소원으로는 KNO3를 선정하였으며, 농도는 1.9 g/l이 최적이었다. 최적의 배지조건에서 Haematococcus sp.를 초기 접종량(0.18 g/l)로 접종하여 14일 후에 5.58 ± 0.25 g/l로 성장하였으며, 이는 건조 세포중량 기준으로 약 31배의 성장한 것이다. 이때 생성된 클로로필은 172.16 ± 7.79 mg/l였으며, 카로티노이드는 42.33 ± 1.91 mg/l이었다. 본 연구의 결과는 추후 미세조류 대량 배양과 대사산물의 생산에 이용가능한 기초자료가 될 수 있을 것이라 판단된다.
Haematococcus sp.를 대상으로 mixotroph 형태에서 배양을 위한 배지 최적화 연구를 수행하였다. 기본 배지로는 modified MS 배지가 적절했으며, 탄소원으로는 glucose가, 그리고 농도는 10 g/l가 적합하였다. 질소원으로는 KNO3를 선정하였으며, 농도는 1.9 g/l이 최적이었다. 최적의 배지조건에서 Haematococcus sp.를 초기 접종량(0.18 g/l)로 접종하여 14일 후에 5.58 ± 0.25 g/l로 성장하였으며, 이는 건조 세포중량 기준으로 약 31배의 성장한 것이다. 이때 생성된 클로로필은 172.16 ± 7.79 mg/l였으며, 카로티노이드는 42.33 ± 1.91 mg/l이었다. 본 연구의 결과는 추후 미세조류 대량 배양과 대사산물의 생산에 이용가능한 기초자료가 될 수 있을 것이라 판단된다.
In this study, the medium optimization for cell growth and metabolite formation of Haematococcus sp. under mixotrophic cultivation was investigated. As a result, modified MS medium was selected as the basal medium; glucose was selected as the carbon source, with an optimum concentration of 10 g/l, a...
In this study, the medium optimization for cell growth and metabolite formation of Haematococcus sp. under mixotrophic cultivation was investigated. As a result, modified MS medium was selected as the basal medium; glucose was selected as the carbon source, with an optimum concentration of 10 g/l, and potassium nitrate was chosen as the nitrogen source, with an optimum concentration of 1.9 g/l. Under optimum conditions, Haematococcus sp. demonstrated an increase in biomass concentration from 0.18 gDW/l to 5.58 gDW/l in 14 days, after which there was a 31-fold increase in its growth. At the same time, the concentrations of chlorophyll and carotenoids were 172.16 mg/l and 42.33 mg/l, respectively. This work will contribute to the basic data for mass cultivation of microalgae.
In this study, the medium optimization for cell growth and metabolite formation of Haematococcus sp. under mixotrophic cultivation was investigated. As a result, modified MS medium was selected as the basal medium; glucose was selected as the carbon source, with an optimum concentration of 10 g/l, and potassium nitrate was chosen as the nitrogen source, with an optimum concentration of 1.9 g/l. Under optimum conditions, Haematococcus sp. demonstrated an increase in biomass concentration from 0.18 gDW/l to 5.58 gDW/l in 14 days, after which there was a 31-fold increase in its growth. At the same time, the concentrations of chlorophyll and carotenoids were 172.16 mg/l and 42.33 mg/l, respectively. This work will contribute to the basic data for mass cultivation of microalgae.
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제안 방법
L/D cycle의 영향. L/D cycle에 따른 미세조류의 성장을 비교하기 위해 L/D cycle을 16:8, 12:12, 8:16의 3가지 형태로 배양을 진행하였다. 형광등을 사용하여 100 µmol/m2/s의 광도로 조사하였다.
01 day-1를 나타내었다. NaNO3에서 growth rate가 더 높았지만, product 생산에 큰 영향을 주지 않을 것으로 생각되어 KNO3를 최적 질소원으로 결정하였다.
를 대상으로 mixotroph 배양 조건에서 기본 배지를 선정하고, L/D cycle, 탄소원과 질소원의 종류 및 농도의 최적화를 통하여 미세조류의 대량배양에 적합한 배지 조성을 조사하였다. 또한, 미세조류의 성장과 더불어 대사산물(클로로필, 카로티노이드)의 생성을 조사하였다.
또한, 접종에 사용한 미세조류는 배양 전 4일 동안 전배양 후 접종에 사용하였으며, 초기 미세조류의 농도(OD) 값은 0.2−0.3 사이가 되도록 하였다.
본 연구에서는 미세조류 Haematococcus sp.를 대상으로 mixotroph 배양 조건에서 기본 배지를 선정하고, L/D cycle, 탄소원과 질소원의 종류 및 농도의 최적화를 통하여 미세조류의 대량배양에 적합한 배지 조성을 조사하였다. 또한, 미세조류의 성장과 더불어 대사산물(클로로필, 카로티노이드)의 생성을 조사하였다.
Haematococcus sp.를 대상으로 mixotroph 형태에서 배양을 위한 배지 최적화 연구를 수행하였다. 기본 배지로는 modified MS 배지가 적절했으며, 탄소원으로는 glucose가, 그리고 농도는 10 g/l가 적합하였다.
미세조류의 성장은 분광광도계(Ultrospec® 3000)를 사용하여 660 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 건조세포중량과 흡광도 값과의 관계식을 이용하여 환산하여 사용하였다.
배양에 알맞은 탄소원 종류를 알아보기 위해 glucose, galactose, fructose, xylose, cellobiose, sucrose를 대상으로 10 g/l씩 첨가하여 14일 동안 배양한 결과를 Fig. 3에 나타내었다.
건조세포중량 측정. 배양한 미세조류는 원심분리기를 사용 하여 분리한 후 동결건조기(-80℃, SFDSM 24L, Samwon Freeze Engineering Co., Korea)를 이용하여 3일 동안 동결건조하여 미세조류 건조중량을 측정하였다. 미세조류의 성장은 분광광도계(Ultrospec®3000)를 사용하여 660 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 건조세포중량과 흡광도 값과의 관계식을 이용하여 환산하여 사용하였다.
클로로필과 카로티노이드 생산에 적절한 탄소원 농도는 10 g/l로 충분할 것으로 판단되었다. 세포성장과 대사산물의 생산량을 고려하여 10 g/l의 glucose를 최적 농도로 결정하였다.
27 mg/l가 생산되었다. 실험에는 가장 세포성장이 높았던 16:8 L/D cycle을 최적 조건으로 확립하고 모든 조건에서 L/D cycle을 16:8로 고정하고 실험을 진행하였다.
의 성장을 비교하기 위하여 modified MS, BG11, JM, F/2 배지를 대상[16−18]으로 배지의 pH를 7로 조절하여 121℃에서 15분간 멸균하여 사용하였다.
질소원의 영향. 질소원에 따른 미세조류의 성장과 대사산물의 생산을 비교하기 위하여 NaNO3, KNO3, NH4NO3, NH4Cl, (NH4)2SO4를 1.5 g/l씩 배지에 첨가한 후 최적 질소원을 선정하였다. 최적 질소원의 농도는 선정된 질소원의 농도를 0.
27 g/l의 세포성장으로 나머지 탄소원에 비해 비교적 낮은 값을 나타내었다. 최적 탄소원으로 세포성장과 경제적인 면을 고려하여 glucose를 선택하였다.
클로로필, 카로티노이드 추출 및 측정. 배양한 미세조류는 원심분리를 사용하여 분리한 후 동결건조한 시료를 대상으로 대사산물의 추출에 사용하였다.
탄소원의 영향. 탄소원에 따른 미세조류의 성장과 대사산물의 비교를 위하여 glucose, galactose, sucrose, xylose, fructose, cellobiose를 대상으로 10 g/l씩 첨가하여 배양하였다. 최적 탄소원의 농도는 5−30 g/l의 농도로 배양하였다.
형광등을 사용하여 100 µmol/m2/s의 광도로 조사하였다.
대상 데이터
본 실험에서 사용한 Haematococcus sp. (KMMCC 1464)는 한국해양미세조류은행에서 분양받아 사용하였다. 실험에 사용한 시약들은 시약급을 사용하였다.
클로로필, 카로티노이드 추출 및 측정. 배양한 미세조류는 원심분리를 사용하여 분리한 후 동결건조한 시료를 대상으로 대사산물의 추출에 사용하였다. 동결 건조한 미세조류 분말 10 mg에 메탄올 10 ml를 첨가하여 60℃에서 30분 동안 추출 후, 0℃에서 5분간 냉각시킨 뒤 상등액을 분리하였다.
기본 배지로는 modified MS 배지가 적절했으며, 탄소원으로는 glucose가, 그리고 농도는 10 g/l가 적합하였다. 질소원으로는 KNO3를 선정하였으며, 농도는 1.9 g/l이 최적이었다. 최적의 배지조건에서 Haematococcus sp.
데이터처리
결과의 통계적 유의성은 SPSS 소프트웨어(버전 23.0; SPSS Inc., USA)를 사용하여 분산 분석(ANOVA)과 Duncan의 다중 범위 테스트(p < 0.05)를 통하여 평가하였었다.
모든 실험은 2회 이상 반복하여 각 항목에 따라 평균값±표준편차를 구하여 결과를 평가하였다.
성능/효과
48 g/l)를 보였다. 3.8 g/l 이상의 질소원 농도에서는 거의 일정한 세포성장을 보여, 성장에 오히려 방해가 되는 것으로 판단된다. Growth rate 또한 1.
7 mg/l), 이후부터 14일까지 거의 일정한 생성량을 나타내었다. Growth rate가 떨어짐에 따라 클로로필과 카로티노이드 값이 증가한 것으로 보아 생장을 다 끝낸 후 클로로필과 카로티노이드가 많이 생성되는 것으로 판단된다.
NaNO3를 질소원으로 배지에 첨가하였을 경우 생성되는 클로로필은 215.78 ± 4.69 mg/l이었으며, 카로티노이드는 41.68 mg/l로 가장 높은 생산량을 나타내었다.
그 결과 30 g/l의 glucose를 첨가하였을 경우 9.3 ± 0.11 g/l로 가장 높은 성장을 나타냈으며, 10 g/l와 20 g/l에서 각각 7.35 ± 0.31 g/l, 7.83 ± 0.09 g/l로 그 뒤를 이었다.
그 결과 glucose, galactose, cellobiose, sucrose를 첨가한 배지에서 각각 5.58 ± 0.25 g/l, 5.82 ± 0.13 g/l, 5.82 ± 0.30 g/l, 5.99 ± 0.21 g/l로 통계적으로 유의한 비슷한 세포성장을 보였으며, fructose와 xylose에서는 각각 4.6 ± 0.25 g/l, 4.9 ± 0.27 g/l의 세포성장으로 나머지 탄소원에 비해 비교적 낮은 값을 나타내었다.
를 대상으로 mixotroph 형태에서 배양을 위한 배지 최적화 연구를 수행하였다. 기본 배지로는 modified MS 배지가 적절했으며, 탄소원으로는 glucose가, 그리고 농도는 10 g/l가 적합하였다. 질소원으로는 KNO3를 선정하였으며, 농도는 1.
7 mg/l의 카로티노이드가 추출되었다. 또한, NH4가 함유된 배지에서는 성장도 많이 일어나지 않았으며, 클로로필과 카로티노이드 생산량 또한 매우 적었음을 확인하였다. 클로로필과 카로티노이드 추출량은 생산량(Fig.
생산된 클로로필은 94.54 ± 2.46 mg/l로 나타났고, 카로티노이드는 21.04 ± 0.06 mg/l가 생산되어 가장 많은 양이 생산 됨을 볼 수 있었다.
2C에 나타내었다. 생산량으로 볼 때 세포성장이 높았던 16:8 L/D cycle에서 가장 높은 값을 보였다. 이때 각각 162.
실험 결과, 1.9 g/l의 농도에서 가장 높은 세포성장(4.65 ± 0.48 g/l)를 보였다.
60 mg/l로 비슷한 값을 나타냄을알 수 있었다. 위 결과로 보아 클로로필과 카로티노이드 생산에는 xylose나 sucrose가 적절한 탄소원이라고 판단된다.
클로로필과 카로티노이드 추출량에 건조세포중량을 곱한 총 생산량 결과(Fig. 6C), 총 생산량은 1.9 g/l에서 가장 높았으며, 그 값은 각각 153.85 ± 6.56 mg/l, 36.18 ± 1.14 mg/l로 나타났다.
클로로필과 카로티노이드 추출량을 비교한 결과(Fig. 5B), NaNO3를 질소원으로 사용한 경우에서 클로로필 47.70 ± 1.58 mg/l, 카로티노이드 9.21 ± 0.25 mg/l가 추출되어 가장 많은 양이 추출되었다.
클로로필과 카로티노이드 추출을 한 결과(Fig. 4B), 전체적으로 glucose 농도가 증가할수록 클로로필과 카로티노이드 함량이 감소함을 확인하였다. 5 g/l에서 23.
63 mg/l의 카로티노이드가 추출되 었다. 클로로필과 카로티노이드의 생산량을 비교한 결과(Fig. 4C), 10 g/l의 glucose에서 가장 높은 생산량을 나타내었다. 생산된 클로로필은 94.
후속연구
91 mg/l이었다. 본 연구의 결과는 추후 미세조류 대량 배양과 대사산물의 생산에 이용가능한 기초자료가 될수 있을 것이라 판단된다.
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