[논문]가는갯능쟁이(Atriplex gmelinii) 추출물과 용매분획물의 MMP-2와 MMP-9 활성 저해효과

박민정; 김준세; 공창숙; 서영완

doi:10.4217/opr.2019.41.2.079

가는갯능쟁이(Atriplex gmelinii) 추출물과 용매분획물의 MMP-2와 MMP-9 활성 저해효과
Inhibition of MMP-2 and -9 by Crude Extracts and Their Solvent-partitioned Fractions from the Halophyte Atriplex gmelinii 원문보기

Ocean and polar research, v.41 no.2, 2019년, pp.79 - 88

박민정 (한국해양대학교 해양생명과학부) , 김준세 (한국해양대학교 해양과학기술전문대학원) , 공창숙 (신라대학교 식품영양학과) , 서영완 (한국해양대학교 해양생명과학부)

Abstract ▼ AI-Helper

In this study, the inhibitory effect of Atriplex gmelinii C. A. Mey. against the activity of MMP-2 and MMP-9 secreted from phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA)-stimulated HT-1080 cells was evaluated by gelatin zymography and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), reverse transcription polymerase-chain reaction (RT-PCR), and Western blot assay. Specimens of the halophyte A. gmelinii were extracted twice for 24 hr with methylene chloride ($CH_2Cl_2$), and then twice with methanol (MeOH), in turn. Each extract significantly inhibited the enzymatic activities in gelatin zymography and MMP ELISA kit, and expression of MMP-2 and 9 in mRNA and protein levels. Two crude extracts were combined and then the combined crude extracts were fractionated into n-hexane, 85% aqueous methanol (85% aq.MeOH), n-butanol (n-BuOH), and water ($H_2O$) fractions, according to solvent polarity. Among solvent-partitioned fractions, the 85% aq.MeOH fraction showed the strongest inhibitory effect against MMP-2 and -9 in gelatin zymography and MMP ELISA kit. In RT-PCR, all solvent-partitioned fractions significantly suppressed mRNA expression of MMP-2 and -9. On the other hand, in Western blot assay, all solvent-partitioned fractions except $H_2O$ significantly reduced expression levels of protein. HT 1080 cell migration was most significantly inhibited by the n-BuOH fraction followed by the 85% aq.MeOH and $H_2O$ fractions. These results suggest that A. gmelinii could be used as a potential source to inhibit tumor cell metastasis.

주제어

표/그림 (6)

$Fig. 1. Preparation of crude extracts and their solvent-patitioned fractions from A. gmelinii$ 그림 Fig. 1. Preparation of crude extracts and their solvent-patitioned fractions from A. gmelinii
표 Table 1. Sequences of primers used for RT-PCR
$Fig. 2. Effect of A. gmelinii crude extracts (A) and their solvent fractions (B) on cell viability observed by MTT assay.$ 그림 Fig. 2. Effect of A. gmelinii crude extracts (A) and their solvent fractions (B) on cell viability observed by MTT assay.
$Fig. 3. Inhibitory effects of A. gmelinii crude extracts and their solvent-partitioned fractions on secretion levels of MMP-2 (A and C) and MMP-9 (B and D) were observed by ELISA kit.$ 그림 Fig. 3. Inhibitory effects of A. gmelinii crude extracts and their solvent-partitioned fractions on secretion levels of MMP-2 (A and C) and MMP-9 (B and D) were observed by ELISA kit.
그림 Fig. 4. Inhibitory effects of the combined crude extracts (C.E) of A. gmelinii on enzymatic activity (A), mRNA expression (B), and protein (C) expression of MMP-2 and MMP-9 were observed by gelatin zymography, RTPCR, and Western blot assay, respectively.
$Fig. 5. Inhibitory effects of solvent-partitioned fractions from A. gmelinii crude extracts were observed in enzymatic activity (A), mRNA expression (B), and protein expression (C) of MMP-2 and MMP-9 by gelatin zymography, RT-PCR and Western blot assay, respectively, and in HT-1080 cell migration (D)$ 그림 Fig. 5. Inhibitory effects of solvent-partitioned fractions from A. gmelinii crude extracts were observed in enzymatic activity (A), mRNA expression (B), and protein expression (C) of MMP-2 and MMP-9 by gelatin zymography, RT-PCR and Western blot assay, respectively, and in HT-1080 cell migration (D)

AI 본문요약
AI-Helper

* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.

문제 정의

그러므로 본 연구에서는 염생식물로부터 효과적인 MMP 억제제를 탐색하는 과정중에 가는갯능쟁이 시료의 MMP-2와 MMP-9에 대한 억제활성을 조사하였다. 먼저 gelatin zymography, ELISA assay, RT-PCR, Western blot등의 실험을 진행하여 가는갯능쟁이 추출물이 젤라틴 분해 활성 및 mRNA와 단백질의 발현에 대한 유의적인 억제활성이 있음을 확인하였다.
본 연구팀에서는 우리나라의 다양한 연안 습지식물 시료로부터 MMP 억제활성을 스크리닝하는 과정에서 가는갯능쟁이의 추출물이 MMP 생성 저해효과가 있음을 확인하였다. 따라서 본 연구에서는 PMA로 유도시킨 HT-1080 세포에서 MMP-2와 MMP-9에 유의적인 활성억제 효과를 나타낸 가는갯능쟁이 추출물로부터 용매분획물을 제조하고 이 분획물들이 MMP 발현조절에 미치는 효과를 측정하여 MMP 저해제로서의 개발 가능성과 나아가 효소적 저해활성을 활용한 표적 항암제로서의 잠재적 이용 가능성에 대해서 알아보고자 하였다(Jeong et al. 2016, 2017; Kim et al. 2017, 2018; Son et al. 2018; 김 2018).

제안 방법

Blocking한 membrane를 세척한 뒤, 1차 antibody (MMP-2 / MMP-9 / β-actin)를 이용해 특이적 항원-항체 반응을 유도했다. 24시간 후 세척하고 2차 antibody를 상온에서 1시간 동안 반응시켜 detection시킨 뒤, Western blotting detection reagent kit(GE healthcare, UK)를 membrane 위에 도포하여 UV(Davinch-Chemi imager^TM, CAS-400SM, Davinch-K, Korea)를 통해 단백질 발현 정도를 관찰하였다.
CH2Cl2와 MeOH 추출물은 각각 100, 200 μg/mL 농도로 처리하여 세포생존율을 측정한 결과, 각 추출물이 200 μg/mL 처리농도에서는 75% 미만의 생존율을 보여 세포를 이용하는 실험에 적합하지 않았으나, 100 μg/mL 농도에서는 75% 이상의 생존율을 보여 세포에 미치는 독성이 미미하였으므로 100 μg/mL 이하의 농도에서 추출물의 MMPs에 대한 억제활성을 확인하는 실험을 진행하였다.
MeOH, n-BuOH, H₂O로 분획하였다. HT-1080 세포사멸효과를 MTT assay를 이용해 확인하였다(Fig. 2B). n-Hexane, 85% aq.
와 MeOH 추출물을 합한 혼합추출물 시료를 이용하여 MMPs 억제 활성 실험을 추가적으로 진행하였다. MMP-2와 9은 gelatinase이므로 HT-1080 세포에서 가는갯능쟁이 혼합추출물이 PMA에 의한 MMP-2와 MMP-9 의 분비에 미치는 효과를 효소 기질 분해능을 이용하여 측정하는 gelatin zymography에 의해서 확인하였다(Fig. 4A). PMA를 단독으로 처리한 세포에서는 PMA와 시료를 모두 처리하지 않은 세포에 비해 MMP-2와 MMP-9의 발현 정도가 크게 증가하였으며 PMA와 추출물(100 μg/mL) 을 함께 처리한 경우 PMA를 단독 처리한 세포에 비해 MMP-2와 MMP-9의 발현 수준이 각각 47.
5)로 30분씩 2회 세척 후, 10 mM CaCl₂, 50 mM Tris -HCl 및 150 mM NaCl를 함유한 developing buffer를 이용하여 37℃에서 48시간 배양하여 MMP에 의한 gelatin 가수분해를 유도하였다. MMP에 의해 가수분해되어 나타난 gelatin의 영역은 0.5% Coomassie brilliant blue 250(LPS solution, Korea)으로 gel을 30분간 염색한 뒤 탈색용액(methanol : acetic acid : water = 50 : 10 : 40)으로 탈색하여 관찰하였으며 gelatin이 분해되어 투명하게 나타나는 band intensity는 Quantity One (Bioneer, Korea) 프로그램을 사용하여 면적을 측정하였으며 그래프로 나타내었다.
MeOH, n-BuOH, H2O 분획물은 각각 10, 50, 100, 200 μg/mL 농도로 처리하여 세포생존율을 측정한 결과, 200 μg/mL를 제외한 모든 농도에서 77% 이상의 생존율을 보여 세포에 대한 독성이 실험에 영향을 끼치지 않을 수준이므로 100 μg/mL 이하의 농도에서MMPs 억제활성을 확인하는 실험을 진행하였다.
또한 MMP 억제활성을 갖는 성분들의 성질을 확인하기 위해 CH₂Cl₂와 MeOH 추출물을 합한 후에 용매극성도에 따라 n-hexane, 85% aq.MeOH, n-BuOH, H₂O 층으로 분획하여 추출물과 동일한 실험을 진행하였으며 HT 1080 세포이동에 끼치는 영향도 cell migration법으로 확인하였다. 85% aq.
PBS buffer로 세척한 뒤, serum free medium를 채우고 well의 시료농도가 100 μg/mL가 되도록 처리하여 0 hr, 24 hr 후 cell migration을 inverted microscope(Nikon Eclipse TS100, Nikon instruments Inc., USA)로 관찰하고 사진을 촬영하였다.
PCR Premix(Bioneer, Korea)에 합성된 cDNA와 MMP-2 / MMP-9 /β-actin primer를 반응시킨 다음(Table 1), T100 Thermal cycler(Bio-Rad, USA)를 이용하여 95℃에서 5분간 predenature, 95℃에서 45초간 denature, 60℃에서 1분간 annealing cycle, 72℃에서 45초간 extension 과정을 30번 반복함으로써 증폭시킨 뒤, 72℃에서 10분 동안 finalextension을 시키고 4℃에서 반응을 종결, 보관하였다.
5% agarose gel을 이용하여 100 V에서 30분간 전기영동시킨 후 ethidium bromide(Bioneer, Korea) 용액에서 30분간 반응시킨 후 UV(Davinch-Chemi imager TM , CAS-400SM, Davinch-K, Korea)하에서 mRNA 발현 정도를 관찰하였다. PCR 산물들을 이용한 전기영동의 band intensity도 Quantity One(Bioneer, Korea) 프로그램을 사용하여 면적을 측정하였으며 그래프로 나타내었다.
가는갯능쟁이 CH₂Cl₂ 추출물과 MeOH 추출물의 농도별 처리에 따른 MMP-2와 MMP-9의 생성량을 PMA로 유도된 HT-1080 세포 상등액을 추출하여 효소면역측정법으로 측정하였다. Duoset ELISA kit (R&D Systems Inc, USA)의 96 well plate의 각 well에 100 μL의 capture antibody를 처리하여 상온에서 overnight 시켰다.
가는갯능쟁이 분획물의 MMP 발현 억제효과와 암세포 전이관련 인자와의 관련성을 알아보기 위해 RT-PCR과Western blot assay를 이용해 MMP-2와 MMP-9의 mRNA 발현과 단백질 발현수준을 분석하였다(Fig. 5B, 5C). RTPCR의 분석 결과, PMA를 단독 처리한 세포에서는 아무것도 처리하지 않은 세포에 비해 MMP-2 및 MMP-9의mRNA 발현량이 모두 뚜렷하게 증가한 것을 볼 수 있었다.
가는갯능쟁이 용매분획물이 HT-1080세포에서 PMA로 유도된 MMP-2와 MMP-9의 발현 정도에 끼치는 영향을 gelatin zymography를 이용해 관찰하였다(Fig. 5A). 용매 분획물 100 μg/mL의 농도와 PMA를 동시에 처리한 HT-1080 세포에서 85% aq.
가는갯능쟁이 추출물이 HT-1080 섬유육종세포에 미치는 세포독성 여부를 MTT assay를 이용해 확인하였다(Fig. 2A). CH₂Cl₂와 MeOH 추출물은 각각 100, 200 μg/mL 농도로 처리하여 세포생존율을 측정한 결과, 각 추출물이 200 μg/mL 처리농도에서는 75% 미만의 생존율을 보여 세포를 이용하는 실험에 적합하지 않았으나, 100 μg/mL 농도에서는 75% 이상의 생존율을 보여 세포에 미치는 독성이 미미하였으므로 100 μg/mL 이하의 농도에서 추출물의 MMPs에 대한 억제활성을 확인하는 실험을 진행하였다.
서늘한 곳에서 건조한 후 추출하기 전까지 -25℃에서 냉동 보관하였다. 가는갯능쟁이(610.50 g)를 추출에 용이하게 세절한 뒤, methylene chloride(CH₂Cl₂) 용매로 24시간 침지 후 여과하여 용매 추출물을 얻었으며 이를 2회 반복하였다. 여과하고 남은 잔사에 동량의 methanol(MeOH) 용매를 넣어 위의 과정을 반복한 후, 각 추출액을 감압 농축하여 CH₂Cl₂ 추출물 17.
새 배지로 교체한 뒤 농도 별로 준비한 시료를 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 각 well에 배지를 제거한 후, 1 mg/mL의 MTT 시약을 처리하여 4시간 동안 배양하여 formazan crystal이 형성되면 MTT 시약이 처리된 배지를 제거한 후, 형성된 formazan을 DMSO에 녹여 ELISA reader(Bio-Tek instruments, USA)를 이용해 540 nm에서 흡광도를 측정하여 세포생존율(%)을 구하였다.
건조한 RNA에 DEPC water 30 μL를 첨가한 후 spectrophotometer를 이용하여 260 nm / 280 nm에서 흡광도를 측정하여 RNA 농도를 정량하였다.
분리한 동량의 RNA(2 μg)로부터 components mixture(Invitrogen, USA)를 추가하여 cDNA를 합성하였다.
위와 동일한 조건에서 배양한 HT-1080 세포에서 배지제거 후 PBS buffer로 세척한 뒤, Trizol reagent(Ambion, USA)를 사용하여 RNA를 추출하고 chloroform을 가하여 phenol 성분을 제거하였다. 상등액과 동량의 isopropanol을 넣어 RNA를 침전시킨 뒤 알코올을 가하여 세척 및 건조하였다.
cells/well이 되도록 분주한 후 24시간 동안 고착시킨 후 준비한 시료 100 μL로 처리하여 1시간 동안 배양 후, MMP를 발현을 유도하기 위하여 phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, 10 ng/mL)(Sigma aldrich, USA)를 첨가하여 24시간 배양시킨 후 상등액을 얻었다. 이 상등액에 포함된 단백질 함량은 Bradford 단백질 정량법을 이용해 같은 양의 단백질을 포함하는 조정배지가 되게 하여 1.5 mg/mL gelatin(Sigma Aldrich, USA)을 함유한 10% sodium dodecylsulfate-polyacrlamide gel(비환원조건, Duksan Korea)에서 전기영동을 실시하였다. 전기영동 후에 polyacrylamide gel은 실온에서 2.
이와 같이 CH₂Cl₂와 MeOH 추출물의 MMPs 생성 억제능을 각각 검토한 후 추출물을 용매분획 하기 위해 CH₂Cl₂와 MeOH 추출물을 합한 혼합추출물 시료를 이용하여 MMPs 억제 활성 실험을 추가적으로 진행하였다. MMP-2와 9은 gelatinase이므로 HT-1080 세포에서 가는갯능쟁이 혼합추출물이 PMA에 의한 MMP-2와 MMP-9 의 분비에 미치는 효과를 효소 기질 분해능을 이용하여 측정하는 gelatin zymography에 의해서 확인하였다(Fig.
5 mg/mL gelatin(Sigma Aldrich, USA)을 함유한 10% sodium dodecylsulfate-polyacrlamide gel(비환원조건, Duksan Korea)에서 전기영동을 실시하였다. 전기영동 후에 polyacrylamide gel은 실온에서 2.5% Triton X-100(JUNSEI, Japan)이 함유된 50 mM Tris - HCl(pH7.5)로 30분씩 2회 세척 후, 10 mM CaCl₂, 50 mM Tris -HCl 및 150 mM NaCl를 함유한 developing buffer를 이용하여 37℃에서 48시간 배양하여 MMP에 의한 gelatin 가수분해를 유도하였다. MMP에 의해 가수분해되어 나타난 gelatin의 영역은 0.
PCR Premix(Bioneer, Korea)에 합성된 cDNA와 MMP-2 / MMP-9 /β-actin primer를 반응시킨 다음(Table 1), T100 Thermal cycler(Bio-Rad, USA)를 이용하여 95℃에서 5분간 predenature, 95℃에서 45초간 denature, 60℃에서 1분간 annealing cycle, 72℃에서 45초간 extension 과정을 30번 반복함으로써 증폭시킨 뒤, 72℃에서 10분 동안 finalextension을 시키고 4℃에서 반응을 종결, 보관하였다. 증폭된 PCR 산물들은 TAE buffer(Biosesang, Korea)를 전해질로 사용한 1.5% agarose gel을 이용하여 100 V에서 30분간 전기영동시킨 후 ethidium bromide(Bioneer, Korea) 용액에서 30분간 반응시킨 후 UV(Davinch-Chemi imager TM , CAS-400SM, Davinch-K, Korea)하에서 mRNA 발현 정도를 관찰하였다. PCR 산물들을 이용한 전기영동의 band intensity도 Quantity One(Bioneer, Korea) 프로그램을 사용하여 면적을 측정하였으며 그래프로 나타내었다.
추출물과 분획물에 대한 세포 증식 억제 효과를 확인하기 위하여 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) 시약을 이용하여 HT-1080 세포에 대한 세포독성 및 세포생존율(cell viability)을 측정하였다. 배양된 HT-1080 세포는 5 × 10³ cells/well이 되도록 96 well plate에 분주하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다.
합한 추출물의 MMP 발현억제효과와 암세포 전이관련인자와의 관련성을 알아보기 위해 RT-PCR과 Western blot assay를 이용해 MMP-2와 MMP-9의 mRNA와 단백질 발현수준을 분석하였다(Fig. 4B, 4C). RT-PCR의 분석결과, 추출물의 영향으로 PMA와 시료를 모두 처리하지않은 세포의 수준까지 MMP-2와 MMP-9의 mRNA 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

대상 데이터

추출물과 MeOH 추출물을 합한 혼합추출물을 용매 극성에 따라 n-hexane, 85% aq.MeOH, n-BuOH, H₂O로 분획하였다. HT-1080 세포사멸효과를 MTT assay를 이용해 확인하였다(Fig.
, 37℃ incubator(Formascientific, Japan) 조건하에 배양하였다. 배양액으로는 100 unit/mL penicillin-streptomycin (Gibco-BRL, USA)과 10% FBS(Fetal Bovine Serum, GenDEPOT, USA)가 포함된 RPMI 1640(GenGEPOT, USA)을 사용하였다. 배양된 세포는 일주일에 5−6회 정도 PBS buffer로 세척한 뒤, 배지 교체 및 0.
Wash Buffer로 세척 후 각각의 시료를 100 μL씩 처리하여 상온에서 2시간 반응시켰다. 시료는 zymography 실험에서 준비된 상등액의 일부를 취하여 사용하였다. 세척 후 각 well에 100 μL의 detection antibody(MMP-2, #843028: 10 ng/mL, MMP-9, #844927: 150 ng/mL)를 처리하여 상온에서 2시간 반응시켰다.
실험에 사용된 가는갯능쟁이(Atriplex gmelinii C. A.Mey.)는 2007년 전라남도 무안군 현경면 현화리에서 채집하였다. 서늘한 곳에서 건조한 후 추출하기 전까지 -25℃에서 냉동 보관하였다.
인간 섬유육종세포인 HT-1080 세포는 한국 세포주 은행(KCLB, Korea Cell Line Bank)에서 구입하여 T-75 조직배양 플라스크(Nunc, Roskilde, Denmark)를 사용해 5% CO₂, 37℃ incubator(Formascientific, Japan) 조건하에 배양하였다. 배양액으로는 100 unit/mL penicillin-streptomycin (Gibco-BRL, USA)과 10% FBS(Fetal Bovine Serum, GenDEPOT, USA)가 포함된 RPMI 1640(GenGEPOT, USA)을 사용하였다.

데이터처리

a-dMeans with the different letters are significantly different (p < 0.05) by Duncan’s multiple range test.
a-eMeans with the different letters are significantly different (p < 0.05) by Duncan’s multiple range test.
실험결과는 평균 ± 표준편차(Mean ± Standard deviation, SD)로 표시하였으며, SPSS + /WIN 12.0(Statistical Package for Social Science, version 12.0) 통계프로그램을 이용하여 통계적 유의성을 검토하였다.
집단간의 유의성을 검정하기 위해 일원배치 분산분석(Oneway Analysis Of Variance: ANOVA)을 통해 분석하였고, 사후검증은 Duncan’s multiple range test를 실시하여 p < 0.05 수준에서 검증하였다.

이론/모형

MMP-2/MMP-9의 단백질 수준에서의 발현을 측정하기 위해 Western Blot 실험을 진행하였다. HT-1080 세포를 24 well plate에 2 × 10⁵ cells/well이 되도록 분주한 후 24시간 동안 배양 후 농도 별로 준비한 시료를 처리한 뒤, RIPA lysis buffer(Sigma Aldrich, USA)를 사용하여 단백질을 추출했다.
가는갯능쟁이 용매분획물을 활용하여 HT-1080에서의 세포이동성에 끼치는 영향을 cell migration법을 이용해 알아보았다(Fig. 5D). 가는갯능쟁이 분획물을 함께 처리한 세포는 아무것도 처리하지 않은 세포에 비해 세포의 이동을 억제하는 것을 확인할 수 있었으며, 모든 분획물이 유의적인 세포이동 억제활성을 가졌으나 그 중 n-BuOH 분획물이 가장 뚜렷한 세포이동 억제효과를 나타내었고 85% aq.
추출한 단백질은 Bradford 단백질 정량법을 통해서 정량하였고, loading하는 시료에 함유된 단백질의 양(20 μg)을 모두 동일하게 하여 10% SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동을 실시하였다.

성능/효과

n-BuOH과 85%aq.MeOH 분획물들은 MMP-9의 단백질 발현수준을 각각69.7%, 65.6% 감소시켰고, MMP-2의 단백질 발현수준은 각각 58.5%, 54.7%로 감소시켜 MMP-9보다는 MMP-2의 발현을 더 억제하는 것으로 나타났다. n-Hexane 분획물도 MMP-2과 MMP-9에 대해서 각각 45.
85% aq.MeOH 분획물은 MMP-2와 MMP-9 모두에서 control과 blank와 비교하여 거의 완전한 억제활성을 가져왔으며 그 외 MMP-2에 대해서는 n-hexane, n-BuOH, H₂O 분획물 모두가 약 50% 내외의 억제활성을 나타내었으며 MMP-9에 대해서는 n-hexane이 41.9%의 억제활성을 나타내었고 n-BuOH과 H₂O 분획물은 거의 억제활성을 나타내지 않았다.
ELISA kit를 이용한 분획물의 MMP-2와 MMP-9에 대한 분비 억제정도를 비교 분석한 결과 85% aq.MeOH 분획물이 MMP-2와MMP-9에 대해 가장 독보적인 억제활성을 보였다(Fig.3C, 3D).
85% aq.MeOH 분획물이 gelatin zymography와 ELISA assay에서 가장 뛰어난 MMP-2와 MMP-9의 억제활성을 가졌음을 확인할수 있었고, n-BuOH 분획물은 MMP-2와 MMP-9의 mRNA와 단백질의 발현을 가장 강하게 억제하였으며 세포이동에 있어서도 가장 뛰어난 억제 활성을 보여 주었다. n-Hexane 분획물은 RT-PCR에서 MMP-9의 억제에 n-BuOH 분획물과 필적하는 좋은 활성을 나타내었다.
PMA로 발현시킨 HT-1080 세포의 MMP-2와 MMP-9의 분비량을 ELISA kit를 이용해 측정해보니 PMA만 처리한 세포는 PMA를 처리하지 않은 세포에 비해 MMP-2와 MMP-9 분비량이 뚜렷하게 증가한 것을 볼 수 있었다. PMA와 가는갯능쟁이 각각의 추출물을 함께 처리한 경우 MMP-2와 MMP-9의 생성억제효과를 모두 관찰할 수 있었다.
PMA로 발현시킨 HT-1080 세포의 MMP-2와 MMP-9의 분비량을 ELISA kit를 이용해 측정해보니 PMA만 처리한 세포는 PMA를 처리하지 않은 세포에 비해 MMP-2와 MMP-9 분비량이 약 2배 이상 증가하였으며 PMA와 가는갯능쟁이 각각의 용매 분획물을 함께 처리한 경우 MMP-2와 MMP-9의 생성억제효과를 모두 관찰할 수 있었다. MMP-2의 경우, 분획물 모두 PMA를 처리하지 않은 blank 수준까지 MMP-2 분비량이 감소하였으며 85% aq.
PMA를 단독으로 처리한 세포에서는 PMA와 시료를 모두 처리하지 않은 세포에 비해 MMP-2와 MMP-9의 발현 정도가 크게 증가하였으며 PMA와 추출물(100 μg/mL) 을 함께 처리한 경우 PMA를 단독 처리한 세포에 비해 MMP-2와 MMP-9의 발현 수준이 각각 47.5%, 52.5% 감소한 것을 확인할 수 있었다.
PMA로 발현시킨 HT-1080 세포의 MMP-2와 MMP-9의 분비량을 ELISA kit를 이용해 측정해보니 PMA만 처리한 세포는 PMA를 처리하지 않은 세포에 비해 MMP-2와 MMP-9 분비량이 뚜렷하게 증가한 것을 볼 수 있었다. PMA와 가는갯능쟁이 각각의 추출물을 함께 처리한 경우 MMP-2와 MMP-9의 생성억제효과를 모두 관찰할 수 있었다. MMP-2의 경우에는 CH₂Cl₂와 MeOH 추출물은 각각 10 μg/mL의 농도에서도 PMA로 처리하지 않은 세포 수준까지 생성억제 효과를 나타내었으며 MMP-9의 경우에는 MeOH 추출물의 생성억제 효과는 크지 않았으나 CH₂Cl₂추출물이 MMP-9을 농도의존적으로 활성을 억제하여 100 μg/mL 농도에서는 PMA나 시료로 처리하지 않은 경우보다도 더 낮은 분비수준을 보였다(Fig.
RTPCR의 분석 결과, PMA를 단독 처리한 세포에서는 아무것도 처리하지 않은 세포에 비해 MMP-2 및 MMP-9의mRNA 발현량이 모두 뚜렷하게 증가한 것을 볼 수 있었다. PMA와 가는갯능쟁이 용매 분획물을 함께 처리한 경우, 모든 분획물이 MMP-2와 MMP-9의 mRNA 발현을 현저하게 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 분획물들 중에서는 n-BuOH 분획물이 가장 강한 억제활성을 보였으며 PMA로 처리한 control과 비교하여 MMP-2와 MMP-9의 mRNA 발현을 각각 72.
4B, 4C). RT-PCR의 분석결과, 추출물의 영향으로 PMA와 시료를 모두 처리하지않은 세포의 수준까지 MMP-2와 MMP-9의 mRNA 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. Western blot의 분석결과, 추출물을 처리한 세포에서 MMP-2와 MMP-9의 단백질 발현수준이 각각 60.
5B, 5C). RTPCR의 분석 결과, PMA를 단독 처리한 세포에서는 아무것도 처리하지 않은 세포에 비해 MMP-2 및 MMP-9의mRNA 발현량이 모두 뚜렷하게 증가한 것을 볼 수 있었다. PMA와 가는갯능쟁이 용매 분획물을 함께 처리한 경우, 모든 분획물이 MMP-2와 MMP-9의 mRNA 발현을 현저하게 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
RT-PCR의 분석결과, 추출물의 영향으로 PMA와 시료를 모두 처리하지않은 세포의 수준까지 MMP-2와 MMP-9의 mRNA 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. Western blot의 분석결과, 추출물을 처리한 세포에서 MMP-2와 MMP-9의 단백질 발현수준이 각각 60.2%, 37.8% 감소되어 MMP-9보다는 MMP-2의 발현을 유의적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
n-Hexane 분획물은 RT-PCR에서 MMP-9의 억제에 n-BuOH 분획물과 필적하는 좋은 활성을 나타내었다. mRNA의 발현을 억제하는 RT-PCR 실험에서는 모든 용매 분획 물이 좋은 억제활성을 나타내었으며 단백질 발현에 있어 서는 물층을 제외한 모든 분획물이 우수한 억제활성을 보여주었다. MMP-2와 MMP-9의 활성과 관련된 모든 실험 결과를 고려할 때 85% aq.
7%로 감소시켜 MMP-9보다는 MMP-2의 발현을 더 억제하는 것으로 나타났다. n-Hexane 분획물도 MMP-2과 MMP-9에 대해서 각각 45.7%와 52.2% 발현을 억제시켰다.
MeOH 분획물이 gelatin zymography와 ELISA assay에서 가장 뛰어난 MMP-2와 MMP-9의 억제활성을 가졌음을 확인할수 있었고, n-BuOH 분획물은 MMP-2와 MMP-9의 mRNA와 단백질의 발현을 가장 강하게 억제하였으며 세포이동에 있어서도 가장 뛰어난 억제 활성을 보여 주었다. n-Hexane 분획물은 RT-PCR에서 MMP-9의 억제에 n-BuOH 분획물과 필적하는 좋은 활성을 나타내었다. mRNA의 발현을 억제하는 RT-PCR 실험에서는 모든 용매 분획 물이 좋은 억제활성을 나타내었으며 단백질 발현에 있어 서는 물층을 제외한 모든 분획물이 우수한 억제활성을 보여주었다.
5D). 가는갯능쟁이 분획물을 함께 처리한 세포는 아무것도 처리하지 않은 세포에 비해 세포의 이동을 억제하는 것을 확인할 수 있었으며, 모든 분획물이 유의적인 세포이동 억제활성을 가졌으나 그 중 n-BuOH 분획물이 가장 뚜렷한 세포이동 억제효과를 나타내었고 85% aq.MeOH과 H₂O 분획물들이 그 다음으로 세포이동 억제효과를 나타내었다.
그러므로 본 연구에서는 염생식물로부터 효과적인 MMP 억제제를 탐색하는 과정중에 가는갯능쟁이 시료의 MMP-2와 MMP-9에 대한 억제활성을 조사하였다. 먼저 gelatin zymography, ELISA assay, RT-PCR, Western blot등의 실험을 진행하여 가는갯능쟁이 추출물이 젤라틴 분해 활성 및 mRNA와 단백질의 발현에 대한 유의적인 억제활성이 있음을 확인하였다. 또한 MMP 억제활성을 갖는 성분들의 성질을 확인하기 위해 CH₂Cl₂와 MeOH 추출물을 합한 후에 용매극성도에 따라 n-hexane, 85% aq.
본 연구팀에서는 우리나라의 다양한 연안 습지식물 시료로부터 MMP 억제활성을 스크리닝하는 과정에서 가는갯능쟁이의 추출물이 MMP 생성 저해효과가 있음을 확인하였다. 따라서 본 연구에서는 PMA로 유도시킨 HT-1080 세포에서 MMP-2와 MMP-9에 유의적인 활성억제 효과를 나타낸 가는갯능쟁이 추출물로부터 용매분획물을 제조하고 이 분획물들이 MMP 발현조절에 미치는 효과를 측정하여 MMP 저해제로서의 개발 가능성과 나아가 효소적 저해활성을 활용한 표적 항암제로서의 잠재적 이용 가능성에 대해서 알아보고자 하였다(Jeong et al.
PMA와 가는갯능쟁이 용매 분획물을 함께 처리한 경우, 모든 분획물이 MMP-2와 MMP-9의 mRNA 발현을 현저하게 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 분획물들 중에서는 n-BuOH 분획물이 가장 강한 억제활성을 보였으며 PMA로 처리한 control과 비교하여 MMP-2와 MMP-9의 mRNA 발현을 각각 72.7%, 75.5% 감소시켰다. 이 값은 PMA와 시료를 모두 처리하지 않은 blank의 경우와 비슷하였다.

후속연구

Matrix metalloproteinases(MMPs)는 암세포의 성장, 혈관생성, 침입, 그리고 전이에 중요한 역할을 하기 때문에 만약에 MMPs를 효과적으로 억제할 수 있는 물질을 개발한다면 암의 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있을 것이다. 여러 종류의 알려진 MMPs 중에서 MMP-2와 MMP-9 은 암 침윤 및 암 전이와 연관된 세포기저막에 있는 세포외 기질성분을 가수분해하는 효소이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	금속단백질분해효소의 특징은 무엇인가?	세포외 기질 금속단백질분해효소(matrix metalloproteinase, MMP)는 Zn 2+ , Ca 2+ 의존성 펩타이드 내부가수분해 효소 로서 25종 이상이 알려져 있으며, 세포외 기질의 분해와 재형성, 그리고 사이토카인(cytokine), 성장인자, 호르몬수 용체 및 세포 부착 인자의 합성과 분비를 조절한다는 것이 보고되어 있다(Giannelli et al. 1997; Legrand et al.
	가는갯능쟁이란 무엇인가?	Mey.)는 명아주과 갯능쟁이속에 속하는 한해살이 염생식물로 좁은잎갯능 쟁이 또는 가는명아주라고 불리며, 우리나라 전역의 바닷가 조간대, 모래땅, 간척지 등과 세계적으로는 중국 북부, 러시아 사할린, 일본, 북아메리카 등에 분포한다. 잎은 버드나무 잎의 형태와 유사하고 피침형 또는 선형으로 길이 3−10 cm, 폭 5−15 mm로 두꺼우며, 표면에 분백의 가루가 있다.
	가는갯능쟁이의 사용처는 무엇인가?	줄기는 자주색이며 가지는 높이 약 30−70 cm 정도로 자란다(김 2013). 예로부터 식용뿐만 아니라 약용 식물로써 백전풍, 충독, 한창, 개선 등의 질환에 사용되었고, 어린잎과 줄기는 사료로도 이용되었다. 가는갯능쟁이는 염내성, 항염증, 항산화에 대한 연구가 보고되어 있으나, MMP 활성 억제효과에 관한 연구는 이루어진 적이 없다(배 등 2003; 국립생물자원관 2011; Jeong et al.

참고문헌 (27)

National Institute of Biological Resources (2011) Biodiversity of the Korean Peninsula. https://species.nibr.go.kr/home/mainHome.do?cont_link009&subMenu009002&contCd009002&ktsn120000060646. Accessed 25 Mar 2019
Kim S-K (2018) If you know the sea, you will see the future (Marine biological resources that have become economically useful due to the 4th industrial revolution). World Science, Seoul, 332 p
Kim EK (2013) Halophytes of Korea. Nature and Ecology, Seoul, 368 p
Bae JJ, Yoon HS, Choo YS, Song SD (2003) The responses of antioxidative enzymes and salt tolerance of Atriplex gmelinii. Korean J Ecol 26:273-280

원문보기 상세보기
Bae MJ, Karadeniz F, Oh JH, Yu GH, Jang MS, Nam KH, Seo Y, Kong C-S (2017) MMP-inhibitory effects of flavonoid glycosides from edible medicinal halophyte Limonium tetragonum. Evid-Based Compl Alt 2017:6750274. doi:10.1155/2017/6750274

상세보기
Egeblad M, Werb Z (2002) New functions for the matrix metalloproteinases in cancer progression. Nat Rev Cancer 2:161-174

상세보기
Giannelli G, Falk-Marzillier J, Schiraldi O, Stetler-Stevenson WG, Quaranta V (1997) Induction of cell migration by matrix metalloprotease-2 cleavage of laminin-5. Science 277:225-228

상세보기
Ha KT, Kim JK, Kang SK, Kim DW, Lee YC, Kim HM, Kim CH (2004) Inhibitory effect of Sihoga-Yonggol-Moryo-Tang on matrix metalloproteinase-2 and-9 activities and invasiveness potential of hepatocellular carcinoma. Pharmacol Res 50:279-285

상세보기
Hadler-Olsen E, Fadnes B, Sylte I, Uhlin-Hansen L, Winberg JO (2011) Regulation of matrix metalloproteinase activity in health and disease. FEBS J 278:28-45

상세보기
Hu J, Van den Steen PE, Sang Q, Opdenakker G (2007) Matrix metalloproteinase inhibitors as therapy for inflammatory and vascular diseases. Nat Rev Drug Discov 6:480-498

상세보기
Jeong H, Kim H, Ju E, Kong C-S, Seo Y (2016) Antioxidant effect of the Halophyte Atriplex gmelinii. KSBB J 31:200-207

원문보기 상세보기
Jeong H, Kim H, Ju E, Lee S-G, Kong C-S, Seo Y (2017) Antiinflammatory activity of solvent-partitioned fractions from Atriplex gmelinii C. A. Mey. in LPS-stimulated RAW264.7 macrophages. J Life Sci 27:187-193

원문보기 상세보기
Kim H, Kong C-S, Seo Y (2017) Inhibitory activity of Ligustrum japonicum fructus on MMP-2 and MMP-9. KSBB J 32:328-334

상세보기
Kim J, Kong C-S, Seo Y (2018) Inhibitory effects of Carex pumila extracts on MMP-2 and MMP-9 activities in HT-1080 cells. Ocean Polar Res 40:249-257
Legrand C, Gilles C, Zahm JM, Polette M, Buisson AC, Kaplan H, Birembaut P, Tournier JM (1999) Airway epithelial cell migration dynamics: MMP-9 role in cell-extracellular matrix remodeling. J Cell Biol 146:517-529

상세보기
Miller AB, Hoogstraten B, Staquet M, Winkler A (1981) Reporting results of cancer treatment. Cancer 47(1):207-214

상세보기
Mook ORF, Frederiks WM, Van Noorden CJF (2004) The role of gelatinases in colorectal cancer progression and metastasis. BBA-Rev Cancer 1705:69-89
Oh JH, Lee JI, Karadeniz F, Seo Y, Kong C-S (2018) 3,5-Dicaffeoyl-epi-quinic acid isolated from edible halophyte Atriplex gmelinii inhibits adipogenesis via AMPK/MAPK pathway in 3T3-L1 adipocyte. Evid-Based Compl Alt 2018:8572571. doi:10.1155/2018/8572571

상세보기
Sang QXA, Jin Y, Newcomer RG, Monroe SC, Fang X, Hurst DR, Lee SW, Cao Q, Schwartz MA (2006) Matrix metalloproteinase inhibitors as prospective agents for the prevention and treatment of cardiovascular and neoplastic diseases. Curr Top Med Chem 6:289-316

상세보기
Seo UK, Lee YJ, Kim JK, Cha BY, Kim DW, Nam KS, Kim CH (2005) Large-scale and effective screening of Korean medicinal plants for inhibitory activity on matrix metalloproteinase-9. J Ethnopharmacol 97:101-106

상세보기
Son J, Kim H, Kong C-S, Seo Y (2018) Anti-invasive effect of the solvent-partitioned fractions from viticis fructus in PMA-induced HT-1080 cells. J. Life Sci 28:293-299
Son J, Kim J, Kim H, Seo Y (2019) Anti-invasion effects of Calystegia soldanella solvent extracts and partitioned fractions on PMA-stimulated fibrosarcoma cells. J Life Sci 29:287-294
Sternlicht MD, Werb Z (2001) How matrix metalloproteinases regulate cell behavior. Annu Rev Cell Dev Bi 17:463-516

상세보기
Zhang C, Kim SK (2009) Matrix metalloproteinase inhibitors (MMPIs) from marine natural products: the current situation and future prospects. Mar Drugs 7:71-84

상세보기
Zheng L, Zhang Y-M, Zhan Y-Z, Liu C-X (2014) Momordica cochinchinensis seed extracts suppress migration and invasion of human breast cancer ZR-75-30 cells via down-regulating MMP-2 and MMP-9. Asian Pac J Cancer P 15:1105-1110

원문보기 상세보기
Kang J-H, Han I-H, Sung M-K, Yoo H, Kim Y-G, Kim J-S, Kawada T, Yu R (2008) Soybean saponin inhibits tumor cell metastasis by modulating expressions of MMP-2, MMP-9 and TIMP-2. Cancer Lett 261:84-92

상세보기
Yang J-L, Lin J-H, Weng S-W, Chen J-C, Yang J-S, Amagaya S, Funayana S, Wood WG, Kuo C-L, Chung J-G (2013) Crude extract of Euphorbia formosana inhibits the migration and invasion of DU145 human prostate cancer cells: The role of matrix metalloproteinase-2/9 inhibition via the MAPK signaling pathway. Mol Med Rep 7:1403-1408

상세보기

저자의 다른 논문 :

LOADING...

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 논문명, 저널/프로시딩명, 저자 , 발행년, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, 발행기관 관리번호, 논문명, 대등논문명, 저자 , 저널/프로시딩명, 발행기관, 발행년, 발행언어, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, ISBN, ISSN, 주제분야, 키워드, 초록(한글), 초록(영문), 저자(소속기관)
저장형식	Text(ASCII format) Excel format RefWorks Direct Export RIS format (for Reference Manager, ProCite, EndNote), Scholar's Aids, Mendeley
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format

연합인증