추출용매에 따른 ACTS002의 항산화 활성 및 지표성분의 함량 비교 Comparison between the Antioxidant Activity and the Index Content of ACTS002 according to the Extraction Solvent원문보기
Objectives: Samul-tang is commonly used to alleviate the side effects of chemotherapy. This study aimed to establish an efficient method of extracting ACTS002 based on Samul-tang using the yield, high-performance liquid chromatography (HPLC), and antioxidant assay. Methods: ACTS002 was extracted fro...
Objectives: Samul-tang is commonly used to alleviate the side effects of chemotherapy. This study aimed to establish an efficient method of extracting ACTS002 based on Samul-tang using the yield, high-performance liquid chromatography (HPLC), and antioxidant assay. Methods: ACTS002 was extracted from each extraction solvent, and the contents of 5-hydroxymethyl-2-furaldehyde (5-HMF), paeoniflorin, and ferulic acid were quantitatively analyzed and compared using HPLC. Moreover, the antioxidant activities of ACTS002 were measured using total flavonoids, total phenolic compounds, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS), and Ferric reducing/antioxidant power (FRAP). Results: All of the components were set as the index contents because they were easy to process. The antioxidant activity of total flavonoids was the highest in 70% ethyl alcohol extracts, and total phenolic compounds were the highest in 50% ethyl alcohol extracts. In DPPH, 50% ethyl alcohol extracts showed the highest activity, and in ABTS 70% ethyl alcohol extracts were the highest. In FRAP, 70% ethyl alcohol extracts showed the highest activity. Conclusions: ACTS002 can control quality by setting 5-HMF, paeoniflorin, and ferulic acid as the index contents. The antioxidant activity measurement was relatively high in the 50% and 70% ethyl alcohol extracts. Our results can predict the possibility of a pharmacological activity and the standardization of ACTS002.
Objectives: Samul-tang is commonly used to alleviate the side effects of chemotherapy. This study aimed to establish an efficient method of extracting ACTS002 based on Samul-tang using the yield, high-performance liquid chromatography (HPLC), and antioxidant assay. Methods: ACTS002 was extracted from each extraction solvent, and the contents of 5-hydroxymethyl-2-furaldehyde (5-HMF), paeoniflorin, and ferulic acid were quantitatively analyzed and compared using HPLC. Moreover, the antioxidant activities of ACTS002 were measured using total flavonoids, total phenolic compounds, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS), and Ferric reducing/antioxidant power (FRAP). Results: All of the components were set as the index contents because they were easy to process. The antioxidant activity of total flavonoids was the highest in 70% ethyl alcohol extracts, and total phenolic compounds were the highest in 50% ethyl alcohol extracts. In DPPH, 50% ethyl alcohol extracts showed the highest activity, and in ABTS 70% ethyl alcohol extracts were the highest. In FRAP, 70% ethyl alcohol extracts showed the highest activity. Conclusions: ACTS002 can control quality by setting 5-HMF, paeoniflorin, and ferulic acid as the index contents. The antioxidant activity measurement was relatively high in the 50% and 70% ethyl alcohol extracts. Our results can predict the possibility of a pharmacological activity and the standardization of ACTS002.
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문제 정의
본 연구에서는 사물탕을 기반으로 가미되어진 처방(ACTS002)을 이용하여 생리활성을 확인하고자 하였으며 동일한 처방이라도 추출법에 따라 유효성은 충분히 차이가 있을 수 있기 때문에27 그에 대한 추출용매별 효능 및 지표성분을 비교하여 효율적인 추출법을 정립하고 표준화의 기틀을 마련하고자 하였다.
제안 방법
하지만 한약재의 종류에 따라 적합한 유기용매를 사용하면 물에서 추출되지 않는 유효성분을 더 추출할 수 있으며31 반대로 물에서 추출되는 무효물질들의 양을 줄일 수도 있다. 이에 본 연구에서는 ACTS002의 효율적인 추출법을 정립하기 위하여 추출용매에 따른 수율을 계산하였고, 5-HMF, Paeoniflorin, Ferulic acid를 정량분석 하였으며, Total flavonoids, Total phenolic compounds, DPPH, ABTS, FRAP를 이용하여 항산화 활성을 측정하였다.
대상 데이터
ACTS002의 구성 약재인 숙지황, 백작약, 천궁, 당귀를 각각 분말화하고, 각 약재 분말을 1 : 1 : 1 : 1의 비율로 총 20 g을 칭량하여 준비하였다. 약재 총량의 10배인 200 ml의 증류수, 30%, 50%, 70%, 100% 주정을 가하여 각각 3시간 이상 환류 추출하였다.
ACTS002의 추출용매별 수율을 확인하기 위해 보관용기 5개의 무게를 각각 측정하여 준비하였다. 동결건조가 완료된 분말을 보관용기에 담고 각각의 무게를 다시 측정하여 측정한 무게 차이의 비교로 수율을 확인하였다.
을 응용하여 측정하였다. 검액인 ACTS002의 증류수, 30%, 50%, 70%, 100% 주정 추출물 동결건조 분말은 총 플라보노이드 함량 측정과 동일한 농도로 준비하였다. 검액 50 μl와 증류수를 이용하여 제조한 2% Na2CO3 1 ml를 혼합한 후 2분간 반응시켰다.
을 응용하여 측정하였다. 검액인 ACTS002의 증류수, 30%, 50%, 70%, 100% 주정 추출물 동결건조 분말은 총 플라보노이드 함량 측정과 동일한 농도로 준비하였다. 검액 50 μl와 증류수를 이용하여 제조한 2% Na2CO3 1 ml를 혼합한 후 2분간 반응시켰다.
을 응용하여 측정하였다. 검액인 ACTS002의 증류수, 30%, 50%, 70%, 100% 주정 추출물 동결건조 분말은 총 플라보노이드 함량 측정과 동일한 농도로 준비하였다. 검액 50 μl와 증류수를 이용하여 제조한 2% Na2CO3 1 ml를 혼합한 후 2분간 반응시켰다.
을 응용하여 측정하였다. 검액인 ACTS002의 증류수, 30%, 50%, 70%, 100% 주정 추출물 동결건조 분말은 총 플라보노이드 함량 측정과 동일한 농도로 준비하였다. 검액 50 μl와 증류수를 이용하여 제조한 2% Na2CO3 1 ml를 혼합한 후 2분간 반응시켰다.
그린명품제약(한국, 남양주)에서 모든 약재를 구입하였으며 판매사의 감별위원회에서 검증받았다.
Statistically significant value increased with concentration in ANOVA two-sided test (†: p<0.05).
분석파장은 280 nm으로 표준품의 분석결과를 표준곡선으로 그린 후, 표준곡선의 방정식에 표준품의 peak와 Retention time(RT) 값이 같은 분석물질의 peak 면적 값을 대입하여 결과값을 구하였다. 같은 조건으로 3번씩 반복하여 분석하고, 결과 값의 표준편차를 계산하여 오차범위를 구하였다.
본 연구 결과의 통계적 유의성 검증은 IBM SPSS Statistics 22 프로그램을 사용하여 ANOVA two-sided 및 Student t-test법으로 p값을 구하였고, p<0.05일 때 유의한 것으로 판정하였으며, 결과는 평균±표준편차로 나타내었다.
이론/모형
총 페놀화합물 함량은 Kim 등의 방법29을 응용하여 측정하였다. 검액인 ACTS002의 증류수, 30%, 50%, 70%, 100% 주정 추출물 동결건조 분말은 총 플라보노이드 함량 측정과 동일한 농도로 준비하였다.
총 플라보노이드 함량은 Davis 변법28을 응용하여 측정하였다. 검액인 ACTS002의 증류수, 30%, 50%, 70%, 100% 주정 추출물 동결건조 분말을 모두 0.
성능/효과
5-HMF 정량분석 결과 100% 주정, 증류수 추출물 순으로 함량이 높지만, ACTS002의 총량 20 g 기준으로 총 함량을 계산했을 때 증류수 추출물이 10.075 μg/6.5 g, 100% 주정 추출물이 10.032 μg/3.8 g으로 비슷한 함량을 보였다. 이 결과는 5-HMF의 추출 함량에는 차이가 없고, 이외의 성분들에 차이가 있는 것으로 보여진다.
5 (D)). ABTS 라디칼 소거 활성은 70% 주정 추출물이 가장 높았고, 100% 주정 추출물이 가장 낮았다.
생약복합물 HIM-1은 ACTS002의 증류수 추출물보다 높은 전자공여능을 나타내는데, 이는 약재의 총량 및 추출 시간, 배합조건 등의 차이에서 나타나는 결과로 보여진다. ABTS 라디칼 소거 활성을 측정한 결과 70% 주정, 50% 주정 추출물 순으로 활성이 높았고, 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. FRAP를 이용하여 항산화 활성을 측정한 결과 70% 주정, 50% 주정 추출물 순으로 활성이 높았고, 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다.
Paeoniflorin 정량분석 결과 100% 주정, 70% 주정추출물 순으로 g당 함량이 높지만 약 2배 정도 차이를 보였고, 증류수 추출물이 g당 함량이 가장 낮았다. ACTS002의 총량 20 g 기준으로 총 함량을 계산했을 때 100% 주정 추출물이 60.914 μg/3.8 g, 증류수 추출물이 43.03 μg/6.5 g이었다. 이 결과는 Paeoniflorin의 추출은 비극성 용매에서 용이한 것으로 보여진다.
총 페놀화합물 함량을 측정한 결과 50% 주정, 70% 주정 추출물 순으로 함량이 높았고, 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 결과 50% 주정, 30% 주정 추출물 순으로 활성이 높았고, 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. 당귀, 천궁, 백작약을 동일 무게 비율로 혼합하여 열수추출한 생약복합물 HIM-1은 100, 200, 400 μg/ml의 농도에서 각각 24.
ABTS 라디칼 소거 활성을 측정한 결과 70% 주정, 50% 주정 추출물 순으로 활성이 높았고, 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. FRAP를 이용하여 항산화 활성을 측정한 결과 70% 주정, 50% 주정 추출물 순으로 활성이 높았고, 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다.
본 연구에서의 함량을 비교했을 때 비슷한 정도로 올바르게 추출되었음을 확인할 수 있었다. Ferulic acid 정량분석 결과 Paeoniflorin과 동일하게 비극성 용매에서 추출이 용이한 것으로 보여지고, 증류수와 주정을 혼합한 추출물은 비극성 용매의 비율이 높아질수록 Ferulic acid의 함량이 비례하여 증가하지 않았다. 총 세 가지의 정량분석을 통하여 100% 주정으로 추출했을 때 지표성분의 함량이 높은 것으로 나타났다.
항산화 활성은 생리활성의 정도를 예측할 수 있는 활성물질의 확인시험으로 위와 같은 결과를 보았을 때 ACTS002는 농도 의존적인 생리활성을 가진다. 본 연구에서는 ACTS002를 50%와 70% 주정으로 추출하는 것이 유효성 면에서 가장 효율적인 것을 확인할 수 있었다. 또한 이렇게 추출하였을 때 해당 약재들의 지표성분을 분석하기에 문제가 없음을 확인할 수 있었다.
FRAP는 낮은 pH에서 Fe3+가 환원되면서 흡광도가 변화하는 원리를 이용한 방법으로, 주로 혈청의 항산화력 측정에 사용되며 간단하고 단시간 내에 측정이 가능하지만 다른 방법에 비해 정확도가 상대적으로 떨어진다. 이러한 기법으로 항산화 활성을 비교한 결과 50% 주정과 70% 주정으로 추출했을 때 항산화 활성이 상대적으로 높은 것을 확인하였다. 항산화 활성은 생리활성의 정도를 예측할 수 있는 활성물질의 확인시험으로 위와 같은 결과를 보았을 때 ACTS002는 농도 의존적인 생리활성을 가진다.
총 플라보노이드 함량을 측정한 결과 70% 주정, 50% 주정 추출물 순으로 함량이 높았고, 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. 총 페놀화합물 함량을 측정한 결과 50% 주정, 70% 주정 추출물 순으로 함량이 높았고, 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 결과 50% 주정, 30% 주정 추출물 순으로 활성이 높았고, 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다.
총 플라보노이드 함량을 측정한 결과 70% 주정, 50% 주정 추출물 순으로 함량이 높았고, 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. 총 페놀화합물 함량을 측정한 결과 50% 주정, 70% 주정 추출물 순으로 함량이 높았고, 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다.
최 등은 사물탕을 약재별로 물과 주정으로 추출한 경우 숙지황만 수율의 차이를 보이고 나머지 백작약, 천궁, 당귀는 수율의 차이를 보이지 않는다고 보고하였다32. 추출용매에 따라 수율의 차이가 있는 것으로 보아 숙지황에 비극성 성분보다 극성 성분이 다량 포함되어있는 것으로 보여지며, 본 연구의 수율의 차이도 숙지황 및 배합된 약재의 영향이 있을 것으로 사료된다.
이러한 기법으로 항산화 활성을 비교한 결과 50% 주정과 70% 주정으로 추출했을 때 항산화 활성이 상대적으로 높은 것을 확인하였다. 항산화 활성은 생리활성의 정도를 예측할 수 있는 활성물질의 확인시험으로 위와 같은 결과를 보았을 때 ACTS002는 농도 의존적인 생리활성을 가진다. 본 연구에서는 ACTS002를 50%와 70% 주정으로 추출하는 것이 유효성 면에서 가장 효율적인 것을 확인할 수 있었다.
후속연구
ACTS002의 유효물질 및 그에 해당하는 분획의 연구 등을 추가로 진행하여 유효성을 더 높힐 필요가 있다. 또 본 연구에서 진행된 항산화 활성은 세포실험 또는 동물실험 차원에서의 실험이 아니므로 임상적용하기에 한계가 있다.
ACTS002의 유효물질 및 그에 해당하는 분획의 연구 등을 추가로 진행하여 유효성을 더 높힐 필요가 있다. 또 본 연구에서 진행된 항산화 활성은 세포실험 또는 동물실험 차원에서의 실험이 아니므로 임상적용하기에 한계가 있다. 이에 추가적으로 세포실험과 동물실험을 진행하여 세부적인 효능과 그에 해당하는 기전에 대한 연구가 필요하다.
또 본 연구에서 진행된 항산화 활성은 세포실험 또는 동물실험 차원에서의 실험이 아니므로 임상적용하기에 한계가 있다. 이에 추가적으로 세포실험과 동물실험을 진행하여 세부적인 효능과 그에 해당하는 기전에 대한 연구가 필요하다. 추가적인 연구들이 지속적으로 진행된다면 ACTS002는 한방산업에서 검증된 약이 될 수 있을 것이며 이러한 움직임으로 우리 전통적인 한약이 표준화, 과학화로 나아가게 되기를 기원한다.
이에 추가적으로 세포실험과 동물실험을 진행하여 세부적인 효능과 그에 해당하는 기전에 대한 연구가 필요하다. 추가적인 연구들이 지속적으로 진행된다면 ACTS002는 한방산업에서 검증된 약이 될 수 있을 것이며 이러한 움직임으로 우리 전통적인 한약이 표준화, 과학화로 나아가게 되기를 기원한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
지황(地黃, Rehmannia glutinosa Liboschitz)은 무엇인가?
사물탕 처방 약재 중 지황(地黃, Rehmannia glutinosa Liboschitz)은 현삼과에 속하는 다년생 초본으로 수치법에 따라 생지황, 건지황으로 나누며 특히 증숙하여 구중구포한 것을 숙지황이라 한다10. 지황에는 stigmasterol, campesterol, sitosterol, catalpol, manninotriose 등 다양한 성분들이 함유되어 있으며11 숙지황의 경우에는 증숙하는 과정에서 5-Hydroxymethyl-2-furaldehyde (5-HMF)가 생성되고 iridoid 배당체들이 분해되어 약리활성이 바뀐다.
지황의 성분들은 무엇이 있는가?
사물탕 처방 약재 중 지황(地黃, Rehmannia glutinosa Liboschitz)은 현삼과에 속하는 다년생 초본으로 수치법에 따라 생지황, 건지황으로 나누며 특히 증숙하여 구중구포한 것을 숙지황이라 한다10. 지황에는 stigmasterol, campesterol, sitosterol, catalpol, manninotriose 등 다양한 성분들이 함유되어 있으며11 숙지황의 경우에는 증숙하는 과정에서 5-Hydroxymethyl-2-furaldehyde (5-HMF)가 생성되고 iridoid 배당체들이 분해되어 약리활성이 바뀐다. 숙지황은 보혈의 효능이 있으며 생리불순, 발육부진, 치매 등에 처방된다12.
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