Objectives: This study was designed to evaluate the efficacy of Pharbitidis Semen (PS) on obesity using 3T3-L1 cells and high-fat-diet rats. Methods: After the administration of PS at a concentration of 0.125, 0.25, and 0.50 mg/ml in 3T3-L1 cells, the degree of differentiation of adipocytes was meas...
Objectives: This study was designed to evaluate the efficacy of Pharbitidis Semen (PS) on obesity using 3T3-L1 cells and high-fat-diet rats. Methods: After the administration of PS at a concentration of 0.125, 0.25, and 0.50 mg/ml in 3T3-L1 cells, the degree of differentiation of adipocytes was measured by Oil Red O staining. The experimental animals were divided into five groups in vivo. Normal group: diet-fed normal group (Normal), Control group (Control): high-fat-diet (HFD)-fed, Positive control group (PC): HFD+Contrave 200 mg/kg, PS_Low group: HFD+PS 250 mg/kg group, PS_High group: HFD+PS 500 mg/kg. Results: The total cholesterol, low density lipoprotein-cholesterol (LDL-cholesterol), and triglycerides (TG) content of the PS medication groups were significantly lower than those of the control group. In addition, high density lipoprotein cholesterol (HDL-cholesterol) tended to increase, and free fatty acid, total lipid, and phospholipid tended to decrease, but the decrease was not statistically significant. The administration of PS inhibited the differentiation of 3T3-L1 adipocytes, and a statistically significant difference was found in the group administered with 0.125 mg/ml. The mRNA expression of $PPAR-{\gamma}$ and leptin, which are involved in the differentiation of adipocytes, was observed using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). The expressions of $PPAR-{\gamma}$ and leptin significantly decreased in comparison with the control and the positive control.
Objectives: This study was designed to evaluate the efficacy of Pharbitidis Semen (PS) on obesity using 3T3-L1 cells and high-fat-diet rats. Methods: After the administration of PS at a concentration of 0.125, 0.25, and 0.50 mg/ml in 3T3-L1 cells, the degree of differentiation of adipocytes was measured by Oil Red O staining. The experimental animals were divided into five groups in vivo. Normal group: diet-fed normal group (Normal), Control group (Control): high-fat-diet (HFD)-fed, Positive control group (PC): HFD+Contrave 200 mg/kg, PS_Low group: HFD+PS 250 mg/kg group, PS_High group: HFD+PS 500 mg/kg. Results: The total cholesterol, low density lipoprotein-cholesterol (LDL-cholesterol), and triglycerides (TG) content of the PS medication groups were significantly lower than those of the control group. In addition, high density lipoprotein cholesterol (HDL-cholesterol) tended to increase, and free fatty acid, total lipid, and phospholipid tended to decrease, but the decrease was not statistically significant. The administration of PS inhibited the differentiation of 3T3-L1 adipocytes, and a statistically significant difference was found in the group administered with 0.125 mg/ml. The mRNA expression of $PPAR-{\gamma}$ and leptin, which are involved in the differentiation of adipocytes, was observed using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). The expressions of $PPAR-{\gamma}$ and leptin significantly decreased in comparison with the control and the positive control.
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문제 정의
비록, 동물 실험을 진행하면서 표본수가 적었고, 이에 따라 표준편차가 다소 커서 통계적 유의성은 나타나지 않았으나 비만과 관련된 여러 지표에서 항비만 효과의 경향성을 관찰할 수 있었다. 이번 연구는 본 연구자가 임상에서 항비만 약재로 활용하고 있었던 흑축의 항비만효과를 실험적으로 규명하고자한 연구였으며, 특히, PPAR-γ, leptin, adiponectin에 대한 영향을 PCR을 이용한 점이 기존 연구와의 차이점이라 할 수 있다.
로 지방흡수억제 및 항산화 활성 등의 생리활성과 항암효과 등이 확인되었으나, 비만에 대한 실험 연구는 현재까지 진행된 바가 없었다. 이에 저자는 흑축의 항비만효과를 실험적으로 알아보고자 고지방 사료의 식이로 비만을 유발한 흰 쥐를 대상으로 체중 및 혈액학적 변화, 지방 축적과 관련된 PPAR-γ, leptin 및 adiponectin의 발현을 관찰하였고, 3T3-L1 세포주를 이용하여 세포의 지방축적 정도를 관찰하여 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
흑축의 항비만 효과를 알아보기 위해 3T3-L1세포와 고지방식이로 비만이 유발된 흰 쥐를 이용한 실험에서 다음과 같은 결과를 얻었다.
제안 방법
비만을 유발하지 않은 군을 Normal군, 비만을 유발하고 약물 처치를 하지 않은 군을 Control군, 비만을 유발하고 식욕억제제인 콘트라브(ContraveⓇ, 광동제약) 200 mg/kg를 투여한 군을 Positive control(PC)군, 비만을 유발하고 흑축 250 mg/kg를 투여한 군을 PS_Low군, 비만을 유발하고 흑축 500 mg/kg를 투여한 군을 PS_High군으로 나누었다. 각 실험군의 개체 수는 Normal 군은 8마리, 그 외 실험군은 각각 9마리로 실험을 시행하였다.
실험동물을 희생 전 12시간을 절식시킨 후 마취한 다음 심장천자로 혈액을 채집하여 약 100 μl를 EDTA-bottle에 넣은 후 Multispecies Hematology Analyser(Hemavet, USA)로 WBC, RBC, hemoglobin, platelet을 측정하였다. 나머지 혈액은 원심분리기 (Vision, Korea)에서 3,000 rpm으로 20분간 원심분리를 시행하여 혈청을 분리하였다.
약물 처치 농도의 근거를 설정하기 위하여 3T3-L1 세포에 농도별로(0, 0.0156, 0.03125, 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1 mg/ml) 흑축 추출액과 EZ-cytox 10 μl를 처리한 후 2시간과 3시간 후에 각각 450 nm 측정하여 세포 증식율을 관찰하였고, 최적의 농도로 0.125 mg/ml, 0.25 mg/ml, 0.50 mg/ml를 설정하였다.
대상 데이터
Mouse 배아에서 유래된 3T3-L1 지방전구세포는 한국세포주 은행에서 분양받아 사용하였으며 10% calf serum(invtrogen, USA), 1% Anti-biotic Anti-mycotic(Gibco, USA)을 포함한 DMEM media(Gibco, USA) 를 사용하여, 37 ℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
본 실험에 사용된 재료인 흑축(Pharbitidis Semen)은 D대학교 부속한방병병원에서 공급받아 사용하였다
생후 6주령 된 Spraque-Dawley계 수컷 흰 쥐를 샘타코(주)에서 공급 받아 고형사료(Dongaone Co., Korea)와 물을 충분히 공급하면서 1주일 동안 실험실 환경(온도 22±2 ℃, 습도 40±5%)에 적응시킨후 실험에 사용하였다(D대학교 동물실험윤리위원회 승인번호: 2017-07-04).
실험에 사용된 세포주는 생쥐(mouse)의 지방전구세포인 3T3-L1을 한국세포주 은행에서 분양받아 사용하였다.
데이터처리
수집된 데이터는 평균±표준편차로 표기하였고, 통계적 유의성을 검증하기 위하여 통계프로그램인 IBM SPSS Statistics 22를 사용하였다. 데이터의 평균 비교는 일원배치분산분석(one-way ANOVA)을 사용하였고, 사후검정은 Tukey 방식을 채택하였으며 p-value가 0.05 미만인 경우 유의한 것으로 인정하였다.
수집된 데이터는 평균±표준편차로 표기하였고, 통계적 유의성을 검증하기 위하여 통계프로그램인 IBM SPSS Statistics 22를 사용하였다. 데이터의 평균 비교는 일원배치분산분석(one-way ANOVA)을 사용하였고, 사후검정은 Tukey 방식을 채택하였으며 p-value가 0.
성능/효과
1. 흑축 투여군이 대조군에 비해 체중변화는 통계적인 유의성은 없었으나 감소하는 경향을 보였다.
3. 흑축 투여군은 3T3-L1 지방세포분화를 억제하였고, 그 중 0.125 mg/ml 농도 투여군에서 통계적으로 유의한 차이를 보였다.
4. 흑축 투여군은 PPAR-γ, Leptin의 발현이 대조군과 양성대조군에 비해 유의성 있게 감소되었다.
흑축 투여 후 지방세포 분화과정에서 관여하는 인자인 PPAR-γ. adiponectin, Leptin의 mRNA 발현을 RT-PCR을 이용하여 관찰한 결과, PPAR-γ 함량이 Control군에 비해 PC군 및 PS군에서 유의성 있게 감소되었음을 관찰할 수 있었고, Leptin의 발현에 있어서도 Control군에 비해 PC군과 PS군에서 유의성 있는 감소가 관찰되었을 뿐 아니라 PS군이 PC군에 비해서도 유의성 있게 감소하였음을 관찰할 수 있었으며, adiponectin에서는 Control 군에 비해 PC군과 PS군이 증가하는 경향이 보였으나 통계적으로 유의하지는 않았다(Table 6). 지방세포분화의 핵심적인 기능을 담당하는 PPAR-γ는 잉여 에너지원으로부터 TG 합성을 촉진하여 지방과 간 조직에 저장하여 지방생성 및 비만 예방과 관련되는데 27,37, 본 연구 결과 유의한 감소를 나타내었으며 이는 본 실험결과에서 나타난 3T3-L1 분화 억제가 향상된 결과와도 연관있다고 볼 수있다.
본 실험에서 고지방 식이와 흑축의 투여가 흰쥐의 체중에 어떠한 영향을 끼치는지 관찰하기 위하여 실험기간 동안 총 9회 흰 쥐의 체중을 측정한 결과 Normal군에 비해 다른 실험군의 체중이 증가한 경향을 보였으며, PC군과 PS군에서 모두 Control군에 비해 체중이 감소하는 경향이 있었으나 통계적으로 유의한 차이는 보이지 않았다(Fig. 1).
비만 연구에서 다용되는 대표적인 혈청 인자34인 free fatty acid, total lipid와 phospholipid 변화를 관찰한 결과 Control군에 비해 PS군에서 모두 감소하는 경향을 보였으나 통계적인 유의성은 없었 다(Table 4).
세포 내 지방축적 감소 효과를 확인하기 위하여 3T3-L1 세포와 Oil Red O 용액으로 염색하여 세포 내 지방 축적의 정도를 관찰한 결과, 0 mg/ml 투여군에 비해 모든 PS군에서 지방의 축적이 감소 하였고, 특히 0.125 mg/ml에서는 통계적으로 유의성 있는 감소를 보였다(Table 5, Fig. 6).
실험기간 동안 총 9회 흰 쥐의 체중(g)을 측정한 결과, Normal군(460.44)에 비해 다른 실험군의 체중이 증가하였고(PC=507.67, PS_Low=503.44, PS_High=501.00), PC군과 PS군에서 모두 Control군(535.67)에 비해 체중이 감소하였으나 통계적인 유의성은 없었다(Fig. 1).
이상의 연구를 통해 흑축은 혈청 분석 결과 Total-cholesterol과 TG 수치를 낮추며, Leptin 값을 낮추고 PPAR-γ 수치를 높이는 등 비만 관련 단백질 조절 능력이 있음을 확인하였다. 특히, PPAR-γ와 Leptin에서는 PC군보다 유의한 차이를 보여 비만 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
이상의 연구를 통해 흑축은 혈청 분석 결과 Total-cholesterol과 TG 수치를 낮추며, Leptin 값을 낮추고 PPAR-γ 수치를 높이는 등 비만 관련 단백질 조절 능력이 있음을 확인하였다. 특히, PPAR-γ와 Leptin에서는 PC군보다 유의한 차이를 보여 비만 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 비록, 동물 실험을 진행하면서 표본수가 적었고, 이에 따라 표준편차가 다소 커서 통계적 유의성은 나타나지 않았으나 비만과 관련된 여러 지표에서 항비만 효과의 경향성을 관찰할 수 있었다.
흑축의 항비만효과를 관찰한 결과 고지방식이로 유도된 흰 쥐의 혈청 비만지표와 비만관련 인자의 mRNA 발현을 감소시키는 데 유효했고, 지방세포 분화를 감소시키는 것으로 나타나 이를 통해 흑축이 비만에 있어 임상적으로 활용될 가능성이 있다고 사료된다.
후속연구
7). 고농도 보다 저농도에서 효과가 더 좋은 결과에 대해서는 항비만에 대한 적정한 농도를 산정할 수 있을 근거가 될 수도 있겠지만 향후 다른 측정 지표의 결과들과 종합하여 그 기전을 연구해야 봐야 할 것으로 사료된다.
이상의 결과로 흑축이 항비만효과가 있음을 알 수 있었으며, 본 연구를 기반으로 흑축의 항비만 기전 연구 등의 추가적인 연구를 진행되어야 할 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
지방축적 감소 효과를 확인하기 위한 방법은?
흑축 투여에 따른 세포 내 지방축적 감소 효과를 확인하기 위하여 2가지 방법을 사용하였다. 지방전구세포인 3T3-L1 세포에 Oil Red O 용액으로 염색하여 관찰하였고, 다른 한편으로는 세포 내에지방 대사 과정 중 축적된 TG 함량을 triglyceride kit를 이용하여 측정하였다. 3T3-L1 세포는 생쥐의 섬유아세포로부터 유래된 세포주로, in vitro 상에서 지방세포로 분화되는 특징 때문에 지방세포 축적과 관련된 연구에 많이 사용되는데36, Oil Red O 염색에서는 흑축을 처리하지 않은 군(0.
흑축이란 무엇인가?
흑축(Pharbitidis Semen)은 메꽃과(旋花科)에 속한 1년생 藤性草本인 나팔꽃의 성숙한 種子로 利水通便⋅祛痰逐飮 효능이 있어 瀉下와 利尿작용 및 평활근 흥분작용이 있는 것으로 알려져 있다14.
비만관리가 필요한 이유는 무엇인가?
비만은 정상인에 비해 당뇨, 고혈압 등 질병 발생위험증가와 함께 각종 암을 유발하고, 사망위험을 증가시키기 때문에 실질적 삶의 질 향상을 위해서는 건강수명 향상을 위한 적극적인 비만관리가 필요한 실정이다1,3,5.
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