[논문]약용작물의 뿌리에서 분리된 3종의 국내 미기록 내생균

박혁; 정충렬; 엄안흠

doi:10.4489/kjm.20190014

초록
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경북영주의 산림약용자원연구소에서 재배하고 있는 약용작물 3종(토천궁, 참당귀, 일천궁)의 뿌리에서 내생균을 분리하였다. 분리된 균주는 형태적 특성과 internal transcribed spacer, large subunit rDNA, beta-tubulin 영역의 분자적 분석을 토대로 동정하였다. 연구과정에서 3종의 국내 미기록종 내생균 균주를 확인하였고, 확인된 종은Dactylonectria pauciseptata, Rhizopycnis vagum, Sistotrema sernanderi이다. 미기록종 내생균 균주의 형태적 특성 확인 및 계통 분석 결과에 대해 기술하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

We isolated endophytic fungal strains from the roots of three medicinal crops, Ligusticum chuanxiong, Angelica gigas, and Cnidium officinale, cultivated at Yeongju, Korea. The fungal strains were identified based on their morphological characteristics and molecular analyses of their internal transcr...

We isolated endophytic fungal strains from the roots of three medicinal crops, Ligusticum chuanxiong, Angelica gigas, and Cnidium officinale, cultivated at Yeongju, Korea. The fungal strains were identified based on their morphological characteristics and molecular analyses of their internal transcribed spacer, large subunit rDNA, and beta-tubulin regions. Thereby, we identified three previously unrecorded endophytic fungal species, Dactylonectria pauciseptata, Rhizopycnis vagum, and Sistotrema sernanderi, in Korea. In this report, we describe the morphological characteristics and phylogenetic analyses of these three fungal species.

주제어

표/그림 (5)

표 Table 1. Morphological characteristics of fungal strains isolated in this study
그림 Fig. 1. Colonies of strain 17E023 (Dactylonectria pauciseptata) grown for 7 days on potato dextrose agar (PDA) (A) and malt extract agar (MEA) (E), macroconidium (D), microconidium (H1) and macroconidium (H2). Colonies of strain 17E011 (Rhizopycnis vagum) grown for 7 days on PDA (B) and MEA (F), conidia (I, J). Colonies of strain 17E012 (Sistotrema sernanderi) grown for 7 days on PDA (C) and MEA (G), basidia (K, L). (scale bars: D=20 μm, H-L=10 μm).
그림 Fig. 2. Neighbor-joining phylogenetic tree based on a concatenated alignment of the internal transcribed spacer (ITS), large subunit (LSU), and beta-tubulin (TUB) sequences. Campylocarpon fasciculare was used as an outgroup. Numbers on branches indicate bootstrap values (1,000 replicates). The fungal strain isolated in this study is in bold.
그림 Fig. 3. Neighbor-joining phylogenetic tree based on a concatenated alignment of internal transcribed spacer (ITS) and large subunit (LSU) sequences. Neocucurbitaria quercina was used as an outgroup. Numbers on branches indicate bootstrap values (1,000 replicates). The fungal strain isolated in this study is in bold.
그림 Fig. 4. Neighbor-joining phylogenetic tree based on a concatenated alignment of internal transcribed spacer (ITS) and large subunit (LSU) sequences. Hydnum repandum was used as an outgroup. Numbers on branches indicate bootstrap values (1,000 replicates). Fungal strain isolated in this study is in bold.

AI 본문요약
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문제 정의

이러한 상황에서 약용작물에 서식하는 내생균에 대한 연구는 위와 같은 연구들을 뒷받침할 수 있는 기초자료로써 중요한 역할을 할 수 있을 것으로 생각된다. 본 연구에서는 약용작물로써 재배하고 있는 식물의 뿌리에서 내생균을 분리하던 중 확인된 3종의 국내 미기록 내생균에 대한 형태적 특성과 분자계통분석의 결과를 기술하고자 한다.

제안 방법

5 cm 길이로 잘라 water agar(WA) 배지의 네 귀퉁이에 치상하였다[9]. 25ﾟC의 암소에서 배양하면서 매일 관찰하여 균사가 뻗어 나오는 것이 확인되면 메스를 이용하여 potato dextrose agar (PDA, BD Difco TM , USA) 배지로 계대배양하였으며, 순수 분리된 균주는 PDA배지와 더불어 malt extract agar (MEA, BD Difco TM , USA)배지에서 7일간 배양하여 해부현미경 및 광학현미경 상에서 형태적 특성을 관찰하였다(Table 1). 형태적으로 분류된 균주의 분자계통학적 동정을 위해 DNeasy plant mini kit (Qiagen, USA)을 이용하여 균사에서 DNA를 추출한 뒤, ribosomal DNA (rDNA)의 5.
25ﾟC의 암소에서 배양하면서 매일 관찰하여 균사가 뻗어 나오는 것이 확인되면 메스를 이용하여 potato dextrose agar (PDA, BD Difco TM , USA) 배지로 계대배양하였으며, 순수 분리된 균주는 PDA배지와 더불어 malt extract agar (MEA, BD Difco TM , USA)배지에서 7일간 배양하여 해부현미경 및 광학현미경 상에서 형태적 특성을 관찰하였다(Table 1). 형태적으로 분류된 균주의 분자계통학적 동정을 위해 DNeasy plant mini kit (Qiagen, USA)을 이용하여 균사에서 DNA를 추출한 뒤, ribosomal DNA (rDNA)의 5.8S 지역을 포함하는 internal transcribed spacer (ITS)영역을 균류 특이적 primer인 ITS1F와 ITS4 [10]를 이용하여 증폭하였으며, 보다 정확한 동정을 위하여 rDNA의 large subunit (LSU)영역을 primer LR0R과 LR16 [11]을 이용하여 증폭하였고, beta-tublin (TUB) 영역을 primer Bt2a와 Bt2b [12]를 이용하여 증폭하였다. PCR반응은 SolGent PCR smartmix (SolGent, Daejeon, Korea)의 protocol에 따라 95ﾟC 2분, (95ﾟC 20초, annealing 40초, 72ﾟC 1분)을 35 cycle 반복, 72ﾟC 5분, 8ﾟC에서 종료로 진행하였고, annealing 온도는 ITS영역은 50°C, LSU영역은 44°C, TUB 영역은 55°C로 설정하였다.

대상 데이터

5")에서 진행되었다. 국내에서 임산물로 많이 재배되고 있으며, 뿌리를 약재로 이용하는 약용작물인 토천궁(Ligusticum chuanxiong Hort.), 참당귀(Angelica gigas Nakai), 일천궁(Cnidium officinale Makino)의 뿌리를 채집하여 24시간 이내에 실험실로 운반하였다. 뿌리는 증류수로 씻어 흙을 완전히 제거한 후에 3% NaClO 용액에 3분, 70% EtOH에 1분간 차례로 처리하여 표면살균하였고, 100 μg/mL 농도의 streptomycin 용액에 10분간 처리한 뒤 멸균수로 3회 씻어주었다.
시료의 채집은 2017년 9월 경북 영주에 위치한 산림약용자원연구소 내의 경작지(N36°52'40.5", E128°32'11.5")에서 진행되었다. 국내에서 임산물로 많이 재배되고 있으며, 뿌리를 약재로 이용하는 약용작물인 토천궁(Ligusticum chuanxiong Hort.

이론/모형

5% agarose gel에 20분간 전기영동하여 각각 DNA 단편의 크기를 확인한 후 염기서열 분석을 의뢰하였다(SolGent, Daejeon, Korea). DNA 염기서열은 미국 국립생물정보센터(NCBI) 상에서 BLAST하여 유사도를 확인하고, MEGA7 프로그램을 이용하여[13] 두 영역 혹은 세 영역의 염기서열을 이어 neighbor-joining 방식으로 계통수를 작성하였다. 확인된 미기록종 균주는 국립생물자원관(NIBR)에 기탁하였으며, BLAST 유사도검색 및 계통수 작성에 이용된 염기서열은 NCBI에 등록하였다.

성능/효과

최초 분리는 뉴질랜드에서 진달래과 식물(Erica melanthera)의 뿌리, 슬로바키아의 포도나무 줄기 및 뿌리에서 분리되었으며[14], 이후에도 호주의 담배속(Nicotiana) 식물에서 내생균으로 분리된 기록이 존재한다[16]. ITS, LSU, TUB 영역의 DNA 염기서열 분석 결과 ITS는 D. pauciseptata MF440370.1과 99.64%, LSU는 D. pauciseptata KM515903.1과 99.83%, TUB는 D. pauciseptata JF735435.1과 98.12%의 일치도를 보였으며 모두 같은 계통을 형성하였다(Fig. 2).
vagum 균주가 분비하는 물질이 인간 암세포를 억제할 수 있다는 연구 결과가 존재한다[18]. ITS와 LSU 영역의 DNA 염기서열 분석 결과 ITS는 R. vagum HQ610503.1과 98.78%, LSU는 R. vagum JN859474.1과 100%의 일치도를 보였으며 모두 같은 계통을 형성하였다(Fig. 3).
가문비나무(Picea abies)와 너도밤나무(Fagus sylvatica)에서 분리된 기록이 존재하며[20], 주로 나무 껍질 조직에서 많이 분리된다[21, 22]. ITS와 LSU 영역의 DNA 염기서열 분석 결과 ITS는 S. sernanderi AY805624.1과 99.82%, LSU는 S. sernanderi AM259219.1과 99.68%의 일치도를 보였으며 모두 같은 계통을 형성하였다(Fig. 4).

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	내생균의 역할은?	내생균(endophytic fungi)은 식물의 잎, 줄기, 뿌리 등 조직 내에서 서식하며 병원성을 나타내지 않고 살아가는 균류이다[6]. 내생균은 주로 식물체 내에서 2차 대사산물을 분비하여 포식자인 초식곤충, 혹은 식물 병원체 등으로부터 식물을 보호하는 역할을 한다[7]. 또한 이러한 대사물질의 항균, 항암작용[8]이 밝혀짐에 따라, 내생균의 분비물질에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
	약용식물이란 무엇인가?	약용식물은 질병의 치료 혹은 건강의 증진에 도움을 줄 수 있는 천연 약재로 사용될 수 있는 식물을 말한다[1]. 한국에서 자생하고 있는 약용식물은 약 900여 종 정도로 알려져 있으며, 이 가운데 약재 혹은 건강식품으로써 활용가치가 있어 악용작물로써 재배하거나 임산물로 채취하는 종은 약 60여 종으로 추정된다[2].
	D. pauciseptata의 최초 분리는 어떻게 이루어 졌나?	3개의 격벽을 가진 대분생자와 격벽이 없는 하나의 세포로 이루어진 소분생자를 갖는 것이 특징이며[14], 본 연구에서도 대분생자가 2~3개의 격벽에 의해 나눠지는 것을 확인할 수 있었고 격벽이 없는 소분생자를 확인하였다. 최초 분리는 뉴질랜드에서 진달래과 식물(Erica melanthera)의 뿌리, 슬로바키아의 포도나무 줄기 및 뿌리에서 분리되었으며[14], 이후에도 호주의 담배속(Nicotiana) 식물에서 내생균으로 분리된 기록이 존재한다[16]. ITS, LSU, TUB 영역의 DNA 염기서열 분석 결과 ITS는 D.

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