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[국내논문] Pseudomonas tolaasii 박테리오파지에 특이적인 다클론항체 형성 및 이를 이용한 파지 교차 반응성
Pseudomonas tolaasii bacteriophage-specific polyclonal antibody formation and its cross reactivity to various phages 원문보기

Journal of applied biological chemistry, v.62 no.3, 2019년, pp.287 - 292  

윤영배 (Department of Environmental and Biological Chemistry, Chungbuk National University) ,  박수진 (Department of Environmental and Biological Chemistry, Chungbuk National University) ,  김영기 (Department of Environmental and Biological Chemistry, Chungbuk National University)

초록
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Pseudomonas tolaasii는 느타리버섯에 갈반병을 일으키는 병원균주로, 다양한 변이균주들을 분리하여 $P1{\alpha}$$P1{\beta}$, $P1{\gamma}$ 세 가지 소그룹으로 분류하였다. 각 그룹별 균주들에 특이적인 박테리오파지를 이용한 파지테라피는 갈반병 방제에 매우 성공적이었다. 본 연구에서는, 박테리오파지들의 특성을 구명하기 위하여 소그룹별 대표균주을 이용하여 파지를 분리하였고, 이들의 다클론항체를 제작하여 파지들 사이에 유연관계를 조사하였다. 파지 준비물은 $10^{10}pfu/mL$ 이상으로 토끼의 다리 근육에 주사하였고, 3회의 반복주사에 의해 다클론항체가 얻어졌다. 파지 ${\phi}6264$에 대한 항체의 역가는 $2{\times}10^7Ab/mL$ 이상, 파지 ${\phi}HK2$에 대해서는 $1{\times}10^6Ab/mL$, 파지 ${\phi}HK19$${\phi}HK23$에 대해서는 $1{\times}10^7Ab/mL$ 이상이었다. 항체와 이에 특이적인 파지 사이에는 매우 높은 반응특이성이 있었고, 소그룹이 다른 파지의 항체와 파지 사이에도 일부 교차반응성을 확인하였다. 파지 ${\phi}6264$에서 생성된 $Ab{\phi}6264$는 모든 $P1{\alpha}$ 소그룹의 파지들과 반응성을 보였으나, 파지 ${\phi}HK16$을 제외한 다른 소그룹의 파지들과는 반응하지 않았다. $P1{\gamma}$ 소그룹에서 생성된 $Ab{\phi}HK23$$P1{\beta}$ 소그룹의 모든 파지들을 불활성화시켜 가장 넓은 항체범위를 보였다. 항체와 파지를 이용한 숙주균과의 관계를 분석하였을 때, 16S rRNA 유전자 분석에 의한 숙주균의 근연관계와 항체를 이용한 숙주균의 파지들 사이의 구조적 근연관계는 상당히 차이가 있음을 확인하였다. 결론적으로, 박테리오파지의 숙주균 특이성과 항체를 이용해 측정한 파지의 껍질단백질 구조유사성 사이에는 약한 상관성을 보였다.

Abstract AI-Helper 아이콘AI-Helper

Pseudomonas tolaasii causes brown blotch disease on the oyster mushroom (Pleurotus ostreatus). Various pathogenic strains of P. tolaasii were isolated and divided into three subtypes, $P1{\alpha}$, $P1{\beta}$, and $P1{\gamma}$. For phage therapy, bacteriophages agai...

주제어

AI 본문요약
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제안 방법

  • 항원과 항체가반응 한 혼합액을 숙주균에 처리하고, 15시간 배양 후 반응하지 않은 파지의 수를 측정하여 항체에 의해 감소한 파지의 수를 결정하여 항체의 titer로 하였다. 3차 면역화에서 2주 경과 후에 다클론항체는 토끼의 심장에서 채혈하여 최종 수확하고 항혈청 중 항체의 계수를 측정하였다. 항체를 포함한 혈청은 −80 에 보관하며 사용하였다.
  • tolaasii 변이균주들은 유전적으로 매우 유사하기에 각 변이균주들의 병원 특성을 잘 나타내진 않는다[15-17]. 기존의 연구에서 갈반병 변이균주들의 병원성 차이는 버섯조직함몰검정법, 적혈구 용혈활성, 톨라신 침강법의 세 가지 방법으로 확인하였다. 유전자를 분석하여 얻은 동일한 소그룹의 균주들은 세가지 병원성 측정에서 같은 경향을 보여 유전자 구조에 따른 분류와 각 그룹별 병원성 특성에는 큰 연관성이 있음을 확인하였다[8,18].
  • 다양한 파지와 다클론항체를 교차반응시키기 위하여 파지액은 식염수에 희석하여 이중층 방법으로 도말하여 계수를 측정하였다. 적절한 희석 배수가 선정된 파지는 희석한 다클론항체와 각각 혼합하고, 파지-항체 혼합액은 상온에서 2시간 동안 정치하여 충분히 항원-항체 반응을 일으켜 결합하게 하였다.
  • 다클론항체는 항체 생산에 사용한 파지와 강하게 항원-항체 반응을 하여 파지를 불활성화하였다. 갈반병 원인균주 P.
  • 파지의 다클론항체는 파지의 구조를 이루는 다양한 항원 결정부위에 대한 항체의 혼합물로 구성되어 있어 다양한 독성파지를 capsid 단백질 항원적 특성에 따라 분류가 가능하여 동일한 숙주역을 갖는 파지일지라도 항체를 이용한 구별이 가능하다. 따라서, 서로 다른 그룹에 속한 파지들의 항체 반응성 분석을 통하여 항체가 인식하는 부위인 capsid 단백질 구조의 유사성에 따른 상호 연관성을 조사하였다.
  • 배양 중 증류수로 적신여과지를 넣고 밀봉하여 수분 증발을 방지하였다. 반응에 대한 평가는 점적부위의 변색과 함몰 정도를 관찰하여 이루어졌다.
  • 본 연구에서 사용한 숙주균의 분류는 16S rRNA 유전자 염기서열을 비교하여 이루어졌다[8]. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통한 세균의 분류는 보편적인 방법이나, 갈반병을 유발하는 P.
  • 본 연구에서는 갈반병균의 분류별로 P1α, P1β, P1γ에 속하는 독성 파지를 항원으로 하는 다클론항체(polyclonal antibody)를 제작하여 각 항체에 의한 파지 억제 효과를 확인하였다.
  • 첫 면역화 반응은 1차 주사에서 파지와 Freund’s complete adjuvant를 혼합하여 유도하고[14], 2차와 3차 boost injection을 통한 면역화에서는 파지와 Freund’s incomplete adjuvant를 혼합하여 유도하였다. 생성된 항체의 측정은 항원을 주사하고 7일 후에 토끼의 귀 정맥에서 혈액을 채취하여 이루어졌다.
  • 선발한 8가지의 파지들과 4종류의 다클론항체를 각각 교차반응시켰다. 먼저, 파지 φ6264의 경우는 자신의 항체인 Abφ6264에 의해 완벽하게 불활성화되어 파지에 의한 용균반이 생성되지 않았고, 나머지 다른 항체들에 의해서는 φ6264의 활성이 억제되지 않았다.
  • 양송이버섯의 갓 부분과 자루 부분을 절단하여 수평을 이루게 하고 갓 부분의 절단면에 배지(control), 균주 배양액(108 -109 cfu/mL), 균주배양액+파지, 균주배양액+파지액+항체, 균주배양액+항체를 각각 10 μL씩 점적하여 흡수시켰다.
  • 이중층 방법으로 파지-항체 혼합액을 도말하여 25 ℃에서 15시간동안 배양하여 pfu를 측정하였다.
  • 다양한 파지와 다클론항체를 교차반응시키기 위하여 파지액은 식염수에 희석하여 이중층 방법으로 도말하여 계수를 측정하였다. 적절한 희석 배수가 선정된 파지는 희석한 다클론항체와 각각 혼합하고, 파지-항체 혼합액은 상온에서 2시간 동안 정치하여 충분히 항원-항체 반응을 일으켜 결합하게 하였다. 이중층 방법으로 파지-항체 혼합액을 도말하여 25 에서 15시간동안 배양하여 pfu를 측정하였다.
  • 첫 면역화 반응은 1차 주사에서 파지와 Freund’s complete adjuvant를 혼합하여 유도하고[14], 2차와 3차 boost injection을 통한 면역화에서는 파지와 Freund’s incomplete adjuvant를 혼합하여 유도하였다.
  • 파지는 선행연구에서 청주시 생활하수 하천과 버섯 재배 농가에서 배출하는 침출액에서 agar 이중층 방법으로 플라크를 생성시켜 파지를 분리하였다. Agar 이중층은 숙주균과 하천 샘플을 1:1의 비율로 soft agar 배지에 각각 접종한 후 hard agar 배지에 부어 만들었다[11].
  • 항원 물질은 항체 생산을 위하여 농축한 파지 (1011-1012 pfu/mL)와 항원보조제(Freund’s adjuvant)를 1:1 (v/v)의 비율로 혼합하여 토끼의 목뒤와 뒷다리의 근육에 주사하였다[13].
  • 항원-항체 반응은 다클론항체를 포함한 혈청과 희석된 파지를 서로 혼합하고 상온에서 정치하여 유도하였다. 항원과 항체가반응 한 혼합액을 숙주균에 처리하고, 15시간 배양 후 반응하지 않은 파지의 수를 측정하여 항체에 의해 감소한 파지의 수를 결정하여 항체의 titer로 하였다. 3차 면역화에서 2주 경과 후에 다클론항체는 토끼의 심장에서 채혈하여 최종 수확하고 항혈청 중 항체의 계수를 측정하였다.
  • 항체의 계수(titer) 측정은 파지용균액을 희석하여 배지당 300plaques 정도를 형성하도록 희석 배수를 결정한 후 이루어졌다. 항원-항체 반응은 다클론항체를 포함한 혈청과 희석된 파지를 서로 혼합하고 상온에서 정치하여 유도하였다.

대상 데이터

  • 다클론항체(polyclonal antibody)의 제작은 70일령의 암컷 New Zealand White rabbit을 사용하여 이루어졌다. 항원 물질은 항체 생산을 위하여 농축한 파지 (1011-1012 pfu/mL)와 항원보조제(Freund’s adjuvant)를 1:1 (v/v)의 비율로 혼합하여 토끼의 목뒤와 뒷다리의 근육에 주사하였다[13].
  • 항원으로 사용한 파지는 숙주균의 소그룹에 따라 P1α 그룹의 φ6264와 φHK2, P1β 소그룹의 φHK19, P1γ 소그룹의φHK23이 선발되었다.

이론/모형

  • 버섯조직함몰검정법은 양송이버섯을 이용하여 수행하였다. 양송이버섯의 갓 부분과 자루 부분을 절단하여 수평을 이루게 하고 갓 부분의 절단면에 배지(control), 균주 배양액(108 -109 cfu/mL), 균주배양액+파지, 균주배양액+파지액+항체, 균주배양액+항체를 각각 10 μL씩 점적하여 흡수시켰다.
  • 파지 입자의 분리는 Chibani-Chennoufi 등[12]의 방법에 따라 숙주균과 함께 배양한 파지 용균액에 NaCl을 용균액의 10%가 되도록 첨가하고, 0 ℃에서 1시간 동안 배양하여 8,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다.
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질의응답

핵심어 질문 논문에서 추출한 답변
갈반병은 무엇에 의해 발생되는가? 이러한 이점에도 불구하고 재배시 세균성 갈반병(brown blotch disease)의 빈번한 발생으로 느타리버섯의 재배면적은 해마다 감소하고 있다. 갈반병은 주로 병원성 세균인 Pseudomonas tolaasii가 분비하는 펩티드 독소인 tolaasin과 유사한 펩티드들에 의해 발생한다[4,5]. 갈반병을 유발하는 병원균에 대한 정확한 전염경로나 효과적인 방제법이 현재까지 확립되어 있지 않기에 발병시 버섯재배 농가의 경제적 피해가 매우 크다.
느타리버섯의 약용 및 건강 효능은 어떤것들이 있는가? 느타리버섯은 단위 면적당 수익성이 가장 높은 작물 중 하나이며, 다양한 생리활성 물질을 함유하는 것이 확인되어 약용 및 건강식품으로 널리 사용되고 있다[1]. 특히, ω-3 지방산을 함유하고 있어 항산화 또는 항염증 효능과 체지방을 감소시켜 성인병 예방 등의 효과가 있는 것으로 밝혀졌다[2,3]. 이러한 이점에도 불구하고 재배시 세균성 갈반병(brown blotch disease)의 빈번한 발생으로 느타리버섯의 재배면적은 해마다 감소하고 있다.
파지테라피란 무엇인가? 최근 농약사용에 따른 잔류독성 위험성과 항생제 내성균의 발생에 따른 효과감소 등으로 세균의 바이러스인 박테리오파지를 이용하여 세균을 사멸시키는 파지테라피 방법이 실용화되고 있다[6]. 파지테라피는 병원균을 숙주균으로 감염할 수 있는 파지들을 선발하고, 이를 혼합한 칵테일 형태로 처리하여 다양한 변이균을 포함한 병원균을 효과적이고 강력하게 사멸시켜 병발생을 억제하는 방법이다. 파지는 효과적인 항생제가 없는 병원성 세균에도 큰 방제효과를 보이며, 항생제에 내성을 갖는 약제내성 세균들도 효과적으로 방제할 수 있는 장점을 갖는다[7].
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참고문헌 (22)

  1. Tolera, Kumela D., Abera, Solomon. Nutritional quality of Oyster Mushroom ( Pleurotus Ostreatus ) as affected by osmotic pretreatments and drying methods. Food science & nutrition, vol.5, no.5, 989-996.

  2. Visioli, Francesco, Poli, Andrea, Richard, Doriane, Paoletti, Rodolfo. Modulation of inflammation by Nutritional Interventions. Current atherosclerosis reports, vol.10, no.6, 451-453.

  3. Schneider, I., Kressel, G., Meyer, A., Krings, U., Berger, R.G., Hahn, A.. Lipid lowering effects of oyster mushroom (Pleurotus ostreatus) in humans. Journal of functional foods : the official journal of the International Society for Nutraceuticals & Functional Foods, vol.3, no.1, 17-24.

  4. Rainey, Paul B., Brodey, Catherine L., Johnstone, Keith. Biological properties and spectrum of activity of tolaasin, a lipodepsipeptide toxin produced by the mushroom pathogen Pseudomonas tolaasii. Physiological and molecular plant pathology, vol.39, no.1, 57-70.

  5. Wells, J.. Postharvest Discoloration of the Cultivated MushroomAgaricus bisporusCaused byPseudomonas tolaasii, P.reactans, andP.gingeri. Phytopathology, vol.86, no.10, 1098-.

  6. Kortright, Kaitlyn E., Chan, Benjamin K., Koff, Jonathan L., Turner, Paul E.. Phage Therapy: A Renewed Approach to Combat Antibiotic-Resistant Bacteria. Cell host & microbe, vol.25, no.2, 219-232.

  7. Lin, Derek M, Koskella, Britt, Lin, Henry C. Phage therapy: An alternative to antibiotics in the age of multi-drug resistance. World journal of gastrointestinal pharmacology and therapeutics, vol.8, no.3, 162-173.

  8. Yun, Yeong-Bae, Park, Seong-Wan, Cha, Jae-Soon, Kim, Young-Kee. Biological Characterization of Various Strains of Pseudomonas tolaasii that Causes Brown Blotch Disease. Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry, vol.56, no.1, 41-45.

  9. Haji-Ghassemi, Omid, Blackler, Ryan J, Martin Young, N, Evans, Stephen V. Antibody recognition of carbohydrate epitopes. Glycobiology, vol.25, no.9, 920-952.

  10. Yun YB (2013) Characterization of Pseudomonas tolaasii strains and their bacteriophages for the biological control of brown blotch disease, Dissertation, Chungbuk National University : 

  11. Santos, Sílvio B, Carvalho, Carla M, Sillankorva, Sanna, Nicolau, Ana, Ferreira, Eugénio C, Azeredo, Joana. The use of antibiotics to improve phage detection and enumeration by the double-layer agar technique. BMC microbiology, vol.9, 148-148.

  12. Chibani-Chennoufi, Sandra, Sidoti, Josette, Bruttin, Anne, Kutter, Elizabeth, Sarker, Shafiq, Brüssow, Harald. In Vitro and In Vivo Bacteriolytic Activities of Escherichia coli Phages: Implications for Phage Therapy. Antimicrobial agents and chemotherapy, vol.48, no.7, 2558-2569.

  13. 10.1093/ilar.46.3.269 

  14. Halliday LC, Artwohl JE, Bunte RM, Ramakrishnan V, Bennett BT (2004) Effects of Freund's complete adjuvant on the physiology, histology, and activity of New Zealand White rabbits, Contemp Top Lab Anim Sci 43: 8-13 

  15. Poretsky, Rachel, Rodriguez-R, Luis M., Luo, Chengwei, Tsementzi, Despina, Konstantinidis, Konstantinos T.. Strengths and Limitations of 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing in Revealing Temporal Microbial Community Dynamics. PloS one, vol.9, no.4, e93827-.

  16. Clarridge III, Jill E.. Impact of 16S rRNA Gene Sequence Analysis for Identification of Bacteria on Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Clinical microbiology reviews, vol.17, no.4, 840-862.

  17. Jo, Jay-Hyun, Kennedy, Elizabeth A., Kong, Heidi H.. Research Techniques Made Simple: Bacterial 16S Ribosomal RNA Gene Sequencing in Cutaneous Research. The Journal of investigative dermatology, vol.136, no.3, e23-e27.

  18. Mu, Lin-Lin, Yun, Yeong-Bae, Park, Soo-Jin, Cha, Jae-Soon, Kim, Young-Kee. Various Pathogenic Pseudomonas Strains that Cause Brown Blotch Disease in Cultivated Mushrooms. Journal of applied biological chemistry, vol.58, no.4, 349-354.

  19. Żaczek, Maciej, Łusiak-Szelachowska, Marzanna, Jończyk-Matysiak, Ewa, Weber-Dąbrowska, Beata, Międzybrodzki, Ryszard, Owczarek, Barbara, Kopciuch, Agnieszka, Fortuna, Wojciech, Rogóż, Paweł, Górski, Andrzej. Antibody Production in Response to Staphylococcal MS-1 Phage Cocktail in Patients Undergoing Phage Therapy. Frontiers in microbiology, vol.7, 1681-.

  20. Shi, Ergang, Fury, Wen, Li, Wentian, Mikulka, Warren, Aldrich, Thomas, Rafique, Ashique, Chen, Gang, Hoffenberg, Simon, Daly, Thomas J., Radziejewski, Czeslaw. Monoclonal antibody classification based on epitope-binding using differential antigen disruption. Journal of immunological methods, vol.314, no.1, 9-20.

  21. Sela-Culang, Inbal, Kunik, Vered, Ofran, Yanay. The Structural Basis of Antibody-Antigen Recognition. Frontiers in immunology, vol.4, 302-.

  22. Pratihar, Supriya, Sabo, T. Michael, Ban, David, Fenwick, R. Bryn, Becker, Stefan, Salvatella, Xavier, Griesinger, Christian, Lee, Donghan. Kinetics of the Antibody Recognition Site in the Third IgG‐Binding Domain of Protein G. Angewandte Chemie. international edition, vol.55, no.33, 9567-9570.

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