[논문]갈색거저리 유충 오일이 MG-63 조골세포 분화에 미치는 영향

서민철; 백민희; 이준하; 이화정; 김인우; 김선영; 황재삼; 김미애

doi:10.5352/jls.2019.29.9.1027

[국내논문] 갈색거저리 유충 오일이 MG-63 조골세포 분화에 미치는 영향
Osteoblastogenic Activity of Tenebrio molitor Larvae Oil on the MG-63 Osteoblastic Cell 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.29 no.9, 2019년, pp.1027 - 1033

초록
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현재 우리나라는 고령화 사회에 접어들었으며, 이와 함께 골 대사 질환이 큰 문제로 대두되고 있다. 그 중 가장 흔하게 발생하는 골다공증은 여러 요인에 의해 발생하고 있으며 이의 예방 및 치료를 위한 소재 개발 연구가 활발하게 진행되고 있다. 그러나 곤충을 소재로 한 골다공증 예방 및 치료 연구는 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 골 형성 촉진 효능을 가진 새로운 소재 개발을 위해 갈색거저리 유충 오일의 MG-63 조골세포의 분화 촉진 효과를 연구하였다. 조골세포에서 갈색거저리 유충 오일의 독성 및 증식 효과를 평가하기 위하여 MTS assay를 진행한 결과 $80{\mu}g/ml$ 농도까지 세포 독성이 나타나지 않았으며, 48시간 배양했을 때 $40-80{\mu}g/ml$ 농도에서 120% 정도의 세포 증식 효능을 확인 하였다. 갈색거저리 유충 오일이 조골세포 분화에 미치는 영향을 확인하기 위하여 5일간 갈색거저리 유충 오일을 MG-63 조골세포에 처리한 후 ALP 활성을 측정하였다. 그 결과 $80{\mu}g/ml$ 농도에서 무처리 군에 비해 약 180%의 조골세포 분화 촉진 효능을 관찰 하였다. 이 결과는 ALP staining에서도 유사하게 나타났다. mRNA 발현량의 변화를 측정한 결과, Alpl과 Runx2 유전자 발현량이 증가하였고, 단백질 발현량을 측정했을 때에도 유사한 결과를 확인하였다. 이를 통해 ALP와 Runx2 유전자 및 단백질 발현에 의해서 ALP 활성이 증가하고 조골세포 분화가 촉진되었을 것으로 판단되며, 갈색거저리 유충 오일을 이용한 골 형성 촉진에 따른 골다공증 예방 및 치료 기능성 소재 개발에 대한 가능성을 확인하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

Recently, Korea has seen a rapid increase in the elderly population. As a result, osteoporosis, a geriatric disease, has become a social problem. To investigate the novel and natural materials for promoting osteoblastogenesis, we investigated the osteoblastogenic activity of Tenebrio molitor larvae oil (TMO) on the MG-63 preosteoblast cells. The cytotoxicity and proliferation effects of TMO on MG-63 cells were measured by MTS assay. There was no cytotoxicity up to $80{\mu}g/ml$. At 40 and $80{\mu}g/ml$ of TMO (treated for 48 hr), cell proliferation was elevated about 120% compared to the control. The osteoblastogenic activity of TMO was measured with alkaline phosphatase (ALP) activity at 5 days. Doses of 5 to $80{\mu}g/ml$ of TMO increased ALP activities significantly compared with the control. In addition, expression of ALP and Runx2 (osteoblastogenic markers) were markedly increased after treatment of TMO for 5 days. These results provide evidence that TMO promotes osteoblastogenesis by increasing the gene and protein expression of ALP and Runx2, and they suggest that TMO may be a potential agent for bone formation and preventing osteoporosis.

Keyword

표/그림 (5)

그림 Fig. 1. Effect of Tenebrio molitor larvae Oil on the osteoblastic cells proliferation.
표 Table 1. The sequences of primers for RT-PCR
그림 Fig. 2. Effect of Tenebrio molitor larvae Oil on the ALP activity and staining of osteoblastic cells.
그림 Fig. 3. Effect of Tenebrio molitor larvae Oil on the osteoblatogenesis related gene expression.
그림 Fig. 4. Effect of Tenebrio molitor larvae Oil on the osteoblatogenesis related protein expression.

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 갈색거저리 유충으로부터 추출한 오일이 MG-63 조골세포 증식 및 활성에 미치는 영향을 분석하고자 하였으며, 이를 통해 갈색거저리 유층 오일의 골다공증 개선 가능성을 확인하고자 하였다.

제안 방법

ALP 효소 활성 검사는 p-nitrophenyl phosphate (p-NPP)의 가수분해 반응에 ALP가 촉매로 작용하는 원리를 이용하여, p-nitrophenyl phosphate 의 가수분해 산물인 p-nitrophenol의 양을 측정함으로써 ALP의 활성을 간접적으로 확인하는 방법을 사용하였다. MG-63세포를 96-well plate에 1.
인간 골육종 유래 MG-63 세포는 골 형성 연구에서 primary osteoblast cell을 대체하여 alkaline phosphatase (ALP), runt-related transcription factor 2 (Runx2) 및 osteoproteger-in (OPG) 등 다양한 골 형성 관련 인자들의 발현 확인을 통한 골 형성 연구에서 폭넓게 사용되고 있다[5]. 본 연구에서는 갈색거저리 유충으로부터 추출한 오일(Tenebrio molitor larvae oil, TMO)이 MG-63 조골세포의 증식에 미치는 영향을 확인하기 위해서 TMO를 24시간 및 48시간 동안 처리한 후 MTS re-agent를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과, TMO는 80 μg/ml 농도까지 세포 독성을 유발하지 않았으며 특히 TMO 농도에 따라 세포 생존율이 유의적으로 증가하는 것을 관찰 할 수 있었다(Fig.

대상 데이터

본 연구에 사용된 갈색거저리 유충(Tenebrio molitor)은 경기도 화성 소재 갈색거저리 사육농가에서 구입하여 중적외선건조기(MS3-6, Lichtzen, Korea)를 이용하여 건조 후 시료로 사용하였다. 수분함량이 3.
인간유래 조골세포(human osteoblast-like cell, MG-63)는 ATCC (Manassas, VA, USA)에서 구입하였으며, 10% FBS (fetal bovine serum) (Hyclone, Logan, UT, USA)와 1× pen-icillin-streptomycin (Hyclone)이 첨가된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (Hyclone)을 배양배지로 사용하여 37℃, 5% CO₂의 배양조건에서 배양하였다. 세포의 계대배양은 세포가 충분히 성장하는 2-3일 간격으로 수행하였다.

데이터처리

모든 실험 결과는 3회 반복하여 평균과 표준편차(mean ± SD)로 나타냈다. 실험군 간의 유의성은 Student’s t-test를 통해 검정하였고, p<0.05일 때 군 간의 차이가 유의적인 것으로 판단하였다.

이론/모형

TMO가 MG-63의 세포 생존율에 미치는 영향은 Chao 등[4]의 방법에 따라 MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-car-boxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) re-agent를 이용하여 확인하였다. MG-63에 대한 TMO의 세포독성 및 세포증식을 확인하기 위하여 MG-63을 96-well plate에 5.

성능/효과

본 연구에서는 갈색거저리 유충으로부터 추출한 오일(Tenebrio molitor larvae oil, TMO)이 MG-63 조골세포의 증식에 미치는 영향을 확인하기 위해서 TMO를 24시간 및 48시간 동안 처리한 후 MTS re-agent를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과, TMO는 80 μg/ml 농도까지 세포 독성을 유발하지 않았으며 특히 TMO 농도에 따라 세포 생존율이 유의적으로 증가하는 것을 관찰 할 수 있었다(Fig. 1). 따라서 이후 실험에서는 세포독성이 확인된 80 μg/ml 이하의 농도에서 모든 연구를 수행하였다.
다음으로 세포 내 ALP 염색을 통하여 갈색거저리 오일이 ALP 활성에 미치는 영향을 확인한 결과, ALP 활성변화와 유사하게 CTR 군에 비해 TMO 처리군에서 농도 의존적으로 ALP 염색(푸른색)의 진하기가 증가함을 확인할 수 있었다. 따라서 갈색거저리 유충 오일은 MG-63 조골세포의 ALP 활성을 증가시키며 이에 따라 조골세포의 분화가 증가하였음을 확인하였고, 이는 갈색거저리 유충 오일이 골세포 분화 및 성장 촉진에 도움을 줄 수 있는 소재로 사용될 수 있음을 의미하고 있다.
이러한 결과는 Runx2의 발현이 조골세포분화유도 배지에 사용한 ascorbic acid에 영향을 받지 않는다는 기존 연구결과와 일치한다[29]. 결과적으로 TMO 처리는 조골세포 분화와 밀접한 관련이 있는 Alpl 및 Runx2 유전자의 발현을 증가시킴으로써 조골세포의 분화 및 골 형성을 촉진시킬 것으로 판단된다.

후속연구

또한 real-time PCR 결과와 동일하게 positive control인 DM 군에서 RUNX2의 발현량 또한 변화가 없음을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과들을 종합해보면, TMO는 MG-63 조골세포에서 ALP 및 RUNX2의 단백질 발현을 증가시키고, 이를 통해 MG-63 조골세포의 분화를 촉진하고 골 형성 기능을 강화하며 결과적으로 골다공증 예방 및 치료에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.

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