[논문]레몬그라스와 자소엽 추출물의 피부보습 및 피부장벽에 관한 연구

소양강; 황지영; 김현우; 조하늘; 이태범

doi:10.15230/scsk.2019.45.3.225

레몬그라스와 자소엽 추출물의 피부보습 및 피부장벽에 관한 연구
Skin Hydration and Skin Barrier Effects of Cymbopogon citratus and Perilla frutescens Extracts 원문보기

大韓化粧品學會誌 = Journal of the society of cosmetic scientists of Korea, v.45 no.3, 2019년, pp.225 - 235

소양강 ((재)남원시화장품산업지원센터) , 황지영 ((재)남원시화장품산업지원센터) , 김현우 ((재)남원시화장품산업지원센터) , 조하늘 ((재)남원시화장품산업지원센터) , 이태범 ((재)남원시화장품산업지원센터)

초록
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레몬그라스와 자소엽 추출물은 다양한 생리 효과를 나타내는 것으로 알려져 있지만, 피부보습과 피부장벽에 미치는 영향은 아직까지 연구되지 않았다. 본 연구에서는 레몬그라스와 자소엽 추출물의 피부보습과 피부장벽에 미치는 영향과 페놀성 화합물을 분석하였다. 피부각질형성세포에서 각 추출물이 피부보습에 미치는 영향을 조사한 결과, 두 추출물 모두 물보다 에탄올 추출물에서 히알루론산 생성이 많았다. HPLC를 이용한 19종 페놀성 화합물 분석 결과는 레몬그라스 에탄올 추출물(CCE)에서 chlorogenic acid와 p-coumaric acid가 검출되었으며 자소엽 에탄올 추출물(PFE)에서 rosmarinic acid와 caffeic acid가 검출되었다. 피부보습에 관련된 HAS1, HAS2, HAS3 및 AQP3와 피부장벽에 관련된 filaggrin, loricrin 발현은 PFE보다 CCE에서 높았다. 또한, CCE, PFE 모두 피부보습과 표피분화 조절에 관여하는 $PPAR-{\alpha}$ 단백질의 발현이 농도 의존적으로 증가하였으며 CCE의 주요성분인 chlorogenic acid와 p-coumaric acid가 $PPAR-{\alpha}$ 발현을 증가시켰다. 결론적으로 피부보습과 피부장벽보호 효과에 있어서 CCE가 PFE보다 우수한 효과를 나타내었고, 두 추출물은 피부보습과 피부장벽개선에 대한 기능성 소재로써 활용될 수 있을 것이라 생각된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Cymbopogon citratus (CC) and Perilla frutescens (PF) are known to exert various biological effects. However, their skin hydration and skin barrier effects remain unclear. This study investigated effects of their extracts on skin hydration and skin barrier and analysed the phenolic compounds. effects of these extracts on skin hydration in HaCaT cells showed that Hyaluronic acid production in cells treated with ethanol extracts was higher than that treated with water extracts for both CC and PF. HPLC was used to analyse 19 phenolic compounds in CC and PF ethanol extracts (CCE and PFE). Results revealed chlorogenic acid and p-coumaric acid in CCE and rosmarinic acid and caffeic acid in PFE. Expression levels of hyaluronan synthase 1 (HAS1), HAS2, HAS3, and aquaporin 3 (AQP3), which are related to skin moisturization, and filaggrin and loricrin, which are related to skin barrier were higher in cells treated with CCE than with PFE. CCE and PFE also increased expression of PPAR-a protein involved in skin moisturization and epidermal differentiation in a concentration-dependent manner. As major components of CCE, chlorogenic acid and p-coumaric acid increased PPAR-a protein expression. Thus, CCE and PFE could be used as functional cosmetic materials for skin hydration and skin barrier effects.

주제어

표/그림 (9)

표 Table 1. Retention Time and Maximum Absorbance Wavelength of 19 Standard Phenolic Compounds
표 Table 2. PCR Primers for Real-time PCR
표 Table 3. Real-time PCR Conditions
그림 Figure 1. Cytotoxicity effect of (A) C. citratus and (B) P. frutescens extracts in human keratinocyte HaCaT cells.
그림 Figure 2. Hyaluronic acid release of C. citratus and P. frutescens extracts in HaCaT cells.
그림 Figure 3. HPLC chromatogram of (A) 19 standard phenolic compounds, and ethanol extracts of (B) C. citratus and (C) P. frutescens.
그림 Figure 4. Effect of ethanol extract of C. citratus and P. frutescens on expression of (A) HAS1, (B) HAS2, (C) HAS3 and (D) AQP3 mRNA in HaCaT cells.
그림 Figure 5. Effect of ethanol extract of C. citratus and P. frutescens on expression of (A) filaggrin and (B) loricrin mRNA in HaCaT cells.
그림 Figure 6. Effect of (A) ethanol extract and (B) main compounds of C. citratus and P. frutescens on expression of PPAR-α protein in HaCaT cells.

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 인간 피부각질형성세포인 HaCaT 세포에서 레몬그라스와 자소엽 추출물의 피부보습 및 피부장벽 개선 효과를 검증함으로써 화장품소재 원료로서의 응용가능성을 제시하고자 한다.
피부의 가장 중요한 기능은 신체로부터 체액이 빠져나가는 것을 막고, 병균 및 유해물질이 침투하는 것을 막는 장벽으로서의 역할이다. 본 연구에서는 피부각질 형성세포인 HaCaT 세포에서 레몬그라스와 자소엽 추출물의 피부보습과 피부장벽개선에 대한 화장품 소재원료로써의 가능성을 검토하였다.

제안 방법

cells로 분주한 후 24 h 동안 배양하고, FBS 미포함 DMEM 배지로 2번 세척한 후 FBS 미포함 DMEM 배지로 교체하고 레몬그라스와 자소엽 에탄올 추출물을 48 h 동안 처리하였다. 48 h 후에 세포에서 RNA를 추출하기 위해 total RNA extraction reagent인 trireagent (RNAiso PLUS, Takara, Japan)를 이용하였다. Trireagent 1 mL을 세포에 넣은 후 15 s 동안 vortex하였다.
6 well plate에 HaCaT 세포를 6×105 cells로 분주한 후 24 h 동안 배양하고, FBS 미포함 DMEM 배지로 2번 세척한 후 FBS 미포함 DMEM 배지로 교체하고 레몬그라스와 자소엽 에탄올 추출물을 48 h 동안 처리하였다.
60 mm dish에 HaCaT 세포를 1×106 cells로 분주한 후 24h 동안 배양하고, FBS 미포함 DMEM 배지로 2번 세척한 후 FBS 미포함 DMEM 배지로 교체하고 레몬그라스와 자소엽 에탄올 추출물을 48 h 처리하였다.
RNA 농도(1 OD = 40 μg/mL)는 Evloution 260 Bio UV-Vis spectrophotometer (Thermo Scientific, USA)를 이용하여 260nm에서 측정한 후, reverse transcription kit (RNA to cDNA EcoDry Premix (Oligo dT), Clontech, USA)를 이용하여 1 μgRNA로부터 cDNA를 합성하였다.
WST-1 assay는 cell viability assay kit (EZ-Cytox, Dogen, Korea)를이용하였고, 모든 well에 EZ-Cytox 용액 10 μL를 가해주고 다시 37 ℃, 5% CO2에서 2 h 배양한 뒤 흡광도 측정을 위해 1 min 정도 부드럽게 shaking을 한 뒤 microplate reader (Tecan, Seestrasse, Switzerland)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
WST-1 assay를 이용하여 레몬그라스와 자소엽 추출물의 세포 생존율을 측정하였다. 96 well plate에 HaCaT 세포를 5×103 cells로 분주한 후 24 h 동안 5% CO2, 37 ℃ 조건에서 부착 및 안정화를 시킨 후, 레몬그라스와 자소엽 추출물을 농도별로 처리하여 48 h 동안 배양하였다.
또한, 레몬그라스 추출물과 자소엽 에탄올 추출물 모두 피부보습과 표피분화 조절에 관여하는 PPAR-α 단백질의 발현을 농도 의존적으로 증가시켰으며 레몬그라스의 추출물의 주요성분인 chlorogenic acid와 p-coumaric acid를 20 μM의 농도로 처리하였을 때 PPAR-α 단백질의 발현을 증가시켰다 (Figure 6).
레몬그라스와 자소엽 에탄올 추출물에 대한 19종 페놀성화합물(phenolic compounds)의 함량 분석은 HPLC (Alliancee2695, Waters, USA)를 이용하여 함량을 분석하였다. 시료 10 ㎎ 또는 표준품 1 ㎎을 취하여 50% 에탄올 1 mL에 용해하였고, 시료 10 μL를 HPLC에 주입하고 0.
레몬그라스와 자소엽 에탄올 추출물에 대한 페놀성 화합물을 검출하기 위하여 HPLC를 이용한 동시 다분석을 실시하였다. 19종의 표준물질을 이용하여 동시 다분석 HPLC 그래프는 Figure 3A과 같으며 레몬그라스 에탄올 추출물은 chlorogenic acid와 p-coumaric acid가 각각 11.
8 mL/min 속도로 분석하였다. 이동상으로는 water (0.1% formic acid)와 acetonitrile (0.1% formic acid)를 사용하였고, column은 ShimpackVP-ODS (4.6 ㎜ x 250 ㎜, 5 ㎛) (Shimadzu, Japan)를 이용하여 흡광도 280 ㎚에서 분석하였다. 19종 표준품은 gallic acid, chlorogenic acid, methyl gallate, caffeic acid, EGCG, syringic acid, p-coumaric acid, rutin, ellagic acid, ferulic acid, astragalin, quercitrin hydrate, rosmarinic acid, myricetin, luteolin, quercetin, apigenin, kaempferol, hesperetin (Sigma, USA)을 이용하였다.
이후 SDS-PAGE gel에 20 μg을 loading 한 후 PVDF membrane에 transfer 한 다음 blocking, 1차 항체(PPAR-α 1 : 1000, β-actin 1 :2500), 2차 항체(anti-rabbit 1 : 5000) 및 ECL Western Blotting Substrate (Promega, USA)로 PPAR-α 단백질의 발현 정도를 확인하였다.
인간 피부각질형성세포주인 HaCaT 세포에서 레몬그라스와 자소엽 에탄올 추출물을 48 h 동안 처리한 후 real-time PCR를 통해 피부보습 및 피부장벽에 관한 유전자의 발현을 조사하였다. 피부보습에 관련된 유전자는 HAS1, HAS2, HAS3 및 AQP3 mRNA와 피부장벽에 관련된 유전자는 filaggrin, locrin 및 involucrin mRNA의 발현을 측정하였다.
건조된 레몬그라스와 자소엽을 분쇄기(HMF-3600TG, Hanil, Korea)를 이용하여 분쇄한 후 100 g에 물과 50% 에탄올 2L를 혼합하고 물은 100 ℃, 50% 에탄올은 80 ℃에서 각각 4 h 동안 추출하였다. 추출물은 부직포와 종이여과지를 이용하여 2회 여과하였으며, 여과된 추출물은 감압농축기(R-100, BUCHI, Switzerland)를 이용하여 50 ℃에서 농축하고, 동결건조기(MCFD8508, IlshinBiobase, Korea)를 이용하여 동결 건조하여 분석용 시료로 사용하였다.
피부보습과 피부장벽에 대한 양성대조군은 각각 1 μM ATRA과 2mM의 CaCl2를 사용하였고 페놀성 단일 화합물의 농도는 20 μM을 사용하였다.
피부보습에 관련된 양성대조군으로 ATRA 1 μM 를 사용하였으며 레몬그라스와 자소엽 에탄올 추출물은 50, 100, 200 μg/mL 농도로 처리하였다(Figure 4).
인간 피부각질형성세포주인 HaCaT 세포에서 레몬그라스와 자소엽 에탄올 추출물을 48 h 동안 처리한 후 real-time PCR를 통해 피부보습 및 피부장벽에 관한 유전자의 발현을 조사하였다. 피부보습에 관련된 유전자는 HAS1, HAS2, HAS3 및 AQP3 mRNA와 피부장벽에 관련된 유전자는 filaggrin, locrin 및 involucrin mRNA의 발현을 측정하였다. 피부보습에 관련된 양성대조군으로 ATRA 1 μM 를 사용하였으며 레몬그라스와 자소엽 에탄올 추출물은 50, 100, 200 μg/mL 농도로 처리하였다(Figure 4).
피부장벽에 관련된 유전자를 조사하기 위하여 양성대조군으로 2 mM CaCl2를 사용하였으며 레몬그라스와 자소엽의 에탄올 추출물은 50, 100, 200 μg/mL 농도로 테스트한 결과, 양성대조군인 CaCl2는 filaggrin과 loricrinmRNA의 발현을 각각 4.6배, 4.2배 증가시켰다(Figure 5).
RNA 농도(1 OD = 40 μg/mL)는 Evloution 260 Bio UV-Vis spectrophotometer (Thermo Scientific, USA)를 이용하여 260nm에서 측정한 후, reverse transcription kit (RNA to cDNA EcoDry Premix (Oligo dT), Clontech, USA)를 이용하여 1 μgRNA로부터 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 멸균된 3차증류수로 5배 희석한 후 실시간 PCR 은 Fast Start DNA Master^PLUS SYBR Green I kit (Roche, Germany)을 이용하여 Light Cycler 2.0 (Roche)에서 증폭하였다. 사용한 primer와 PCR 조건은 Table 2, 3과 같으며 유전자의 정량분석은 Light Cycler Software 4.

대상 데이터

6 ㎜ x 250 ㎜, 5 ㎛) (Shimadzu, Japan)를 이용하여 흡광도 280 ㎚에서 분석하였다. 19종 표준품은 gallic acid, chlorogenic acid, methyl gallate, caffeic acid, EGCG, syringic acid, p-coumaric acid, rutin, ellagic acid, ferulic acid, astragalin, quercitrin hydrate, rosmarinic acid, myricetin, luteolin, quercetin, apigenin, kaempferol, hesperetin (Sigma, USA)을 이용하였다. 19종 페놀성 화합물의 retention time과 최대흡수파장은 Table 1과 같다.
본 시험에서 사용한 레몬그라스와 자소엽은 각각 2017년 10월과 8월에 전라북도 남원시 운봉읍과 주천면에서 채취하여 사용하였으며, 뿌리를 제외한 지상부를 사용하였다. 채취한 원물은 40 ℃에서 72h 건조(LD9013, L’EQUIP, Korea)한 후 4 ℃에서 보관하면서 실험에 사용하였다.
양성대조군은 1 μM all-trans retinoic acid (ATRA)를사용하였다.
인간 피부각질형성세포주인 HaCaT 세포를 56 ℃에서 30 min 열처리된 fetal bovine serum (Merck, USA) 10%와 항생제(penicillin/streptomycin, Gibco, USA)를 함유한 Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM, Welgene, Korea)를 사용하여 5% CO2, 37 ℃ 세포 배양기에서 배양하였다.
피부보습과 피부 장벽에 대한 양성대조군은 각각 1 μM ATRA과 2 mM의 calcium chloride (CaCl2)를 사용하였다.

데이터처리

모든 분석 자료는 평균±표준오차 (Mean ± SD)로 나타내었으며 실험결과는 GraphPad InStat software (SanDiego,USA)를 이용하였다.
모든 분석 자료는 평균±표준오차 (Mean ± SD)로 나타내었으며 실험결과는 GraphPad InStat software (SanDiego,USA)를 이용하였다. 통계적인 분석은 one-way analysis of variance with tukey-kramer multiple comparisons test 방법을 이용하였다.

이론/모형

60 mm dish에 HaCaT 세포를 1×106 cells로 분주한 후 24h 동안 배양하고, FBS 미포함 DMEM 배지로 2번 세척한 후 FBS 미포함 DMEM 배지로 교체하고 레몬그라스와 자소엽 에탄올 추출물을 48 h 처리하였다. 48 h 후에 lysis buffer로 단백질을 추출하고 Bradford 방법을 이용하여 단백질을 정량하였다. 이후 SDS-PAGE gel에 20 μg을 loading 한 후 PVDF membrane에 transfer 한 다음 blocking, 1차 항체(PPAR-α 1 : 1000, β-actin 1 :2500), 2차 항체(anti-rabbit 1 : 5000) 및 ECL Western Blotting Substrate (Promega, USA)로 PPAR-α 단백질의 발현 정도를 확인하였다.
0 (Roche)에서 증폭하였다. 사용한 primer와 PCR 조건은 Table 2, 3과 같으며 유전자의 정량분석은 Light Cycler Software 4.0 (Roche)을 이용하였다. 피부보습과 피부 장벽에 대한 양성대조군은 각각 1 μM ATRA과 2 mM의 calcium chloride (CaCl₂)를 사용하였다.

성능/효과

레몬그라스와 자소엽 에탄올 추출물에 대한 페놀성 화합물을 검출하기 위하여 HPLC를 이용한 동시 다분석을 실시하였다. 19종의 표준물질을 이용하여 동시 다분석 HPLC 그래프는 Figure 3A과 같으며 레몬그라스 에탄올 추출물은 chlorogenic acid와 p-coumaric acid가 각각 11.15 mg/g과 2.05 mg/g이 검출되었으며 자소엽 에탄올 추출물에서 rosmarinicacid와 caffeic acid가 각각 20.87 mg/g과 1.50 mg/g이 검출되었다(Figure 3B, Figure 3C).
1배 증가하였다. 결과적으로 레몬그라스 추출물이 자소엽 추출물보다 히알루론산 생성이 더 많았으며, 레몬그라스와 자소엽 물 추출물보다 50% 에탄올 추출물에서 훨씬 더 많은 히알루론산을 방출하였다(Figure 2).
결과적으로 피부보습과 피부장벽보호 효과에 있어서 레몬그라스 에탄올 추출물이 자소엽 에탄올 추출물보다 우수한 효과를 나타내었다. 결론적으로, 레몬그라스와 자소엽 에탄올 추출물은 피부보습과 피부장벽에 대한 유전자를 증가시킴으로써 피부보습과 피부장벽 개선효과가 있음을 확인하였다.
결과적으로 피부보습과 피부장벽보호 효과에 있어서 레몬그라스 에탄올 추출물이 자소엽 에탄올 추출물보다 우수한 효과를 나타내었다. 결론적으로, 레몬그라스와 자소엽 에탄올 추출물은 피부보습과 피부장벽에 대한 유전자를 증가시킴으로써 피부보습과 피부장벽 개선효과가 있음을 확인하였다.
0배 증가하였다. 그리고 레몬그라스와 에탄올 추출물을 처리한 경우에는 HAS1, HAS2, HAS3 및 AQP3 mRNA의 발현이 농도 의존적으로 증가하였고, 자소엽 에탄올 추출물 처리에 의해서는 HAS2와 HAS3 mRNA발현이 농도 의존적으로 증가함을 확인할 수 있었다. 또한, 레몬그라스와 자소엽 에탄올 추출물을 비교한 경우 레몬그라스가 자소엽보다 훨씬 많은 피부보습에 관련된 유전자를 증가시킴을 알 수 있었다.
레몬그라스와 자소엽의 물 추출물과 에탄올 추출물을 비교한 결과 에탄올 추출에서 훨씬 많은 히알루론산 생성을 확인하였다. 그리고 레몬그라스와 자소엽 에탄올 추출물 모두 피부보습과 피부장벽 개선 효과를 나타내었지만 자소엽 에탄올 추출물보다 레몬그라스 에탄올 추출물에서 우수한 효과를 나타내었고, 특히 레몬그라스의 주요성분인 chlorogenic acid와 p-coumaric acid에서 우수한 피부보습과 피부장벽 개선 효과를 나타내었다.
그리고 레몬그라스와 에탄올 추출물을 처리한 경우에는 HAS1, HAS2, HAS3 및 AQP3 mRNA의 발현이 농도 의존적으로 증가하였고, 자소엽 에탄올 추출물 처리에 의해서는 HAS2와 HAS3 mRNA발현이 농도 의존적으로 증가함을 확인할 수 있었다. 또한, 레몬그라스와 자소엽 에탄올 추출물을 비교한 경우 레몬그라스가 자소엽보다 훨씬 많은 피부보습에 관련된 유전자를 증가시킴을 알 수 있었다.
레몬그라스와 자소엽의 물 추출물과 에탄올 추출물을 비교한 결과 에탄올 추출에서 훨씬 많은 히알루론산 생성을 확인하였다. 그리고 레몬그라스와 자소엽 에탄올 추출물 모두 피부보습과 피부장벽 개선 효과를 나타내었지만 자소엽 에탄올 추출물보다 레몬그라스 에탄올 추출물에서 우수한 효과를 나타내었고, 특히 레몬그라스의 주요성분인 chlorogenic acid와 p-coumaric acid에서 우수한 피부보습과 피부장벽 개선 효과를 나타내었다.
피부보습에 관련된 양성대조군으로 ATRA 1 μM 를 사용하였으며 레몬그라스와 자소엽 에탄올 추출물은 50, 100, 200 μg/mL 농도로 처리하였다(Figure 4). 실험결과 양성대조군인 ATRA는 대조군과 비교하였을 때 HAS1, HAS2, HAS3 및 AQP3 mRNA의 발현이 각각 2.7배, 21.4배, 2.3배, 2.0배 증가하였다. 그리고 레몬그라스와 에탄올 추출물을 처리한 경우에는 HAS1, HAS2, HAS3 및 AQP3 mRNA의 발현이 농도 의존적으로 증가하였고, 자소엽 에탄올 추출물 처리에 의해서는 HAS2와 HAS3 mRNA발현이 농도 의존적으로 증가함을 확인할 수 있었다.
인간 피부각질형성세포주인 HaCaT 세포에서 레몬그라스와 자소엽의 물 추출물과 50% 에탄올 추출물을 50 μ g/mL의 농도로 48 h 동안 처리한 후 히알루론산 생성능을 측정한 결과, 양성대조군인 ATRA를 1 μM의 농도로 처리하였을 때 대조군에 비해 6.8배 증가하였고 레몬그라스 물 추출물과 50% 에탄올 추출물은 각각 5.1배, 8.6배 증가하였으며 자소엽 물 추출물과 에탄올 추출물에서는 각각 3.0배, 6.1배 증가하였다.
인간 피부각질형성세포주인 HaCaT 세포에서 레몬그라스와 자소엽의 물 추출물과 50% 에탄올 추출물을 6.25 ∼200 μg/mL의 농도로 48 h 처리한 후 세포독성을 측정한 결과, 75 μg/mL의 농도까지는 세포독성을 보이지 않았으나, 100 μg/mL, 200 μg/mL의 농도에서는 약간의 세포독성을 나타내었다(Figure 1).

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	레몬그라스란?	레몬그라스(Cymbopogon citratus (CC) Stapf)는 볏과(Poaceae)의 여러해살이풀로 레몬향기가 나고 \근육이완, 진통, 해열, 스트레스 조절 효과로 인하여 동서양에서 널리 섭취해 오고 있는 허브중의 하나이며 항산화, 항염증, 항균의 효과가있는 것으로 보고되고 있다[15,16]. 레몬그라스는 isoscoparin, swertiajaponin, chlorogenic acid, caffeic acid, 및 p-coumaric acid 등의 다양한 폴리페놀을 함유하고 있는 것으로 알려져 있다[17,18].
	AQP3 넉아웃 마우스가 나타내는 피부문제에는 어떤 것이 있는가?	이외에도 피부보습에 관련된 인자로서, aquaporin 3 (AQP3)는 세포내외의 물과 글리세롤의 이동에 관여한다고 알려져 있다[8,9]. 그리고 인간 표피각질형성세포는 세포막에 AQP3를 발현하고 있고, AQP3 넉아웃 마우스는 피부보습, 피부보호막손상, 상처치유능 저하 등의 피부문제를 나타내는 것으로 알려져 있다[9].

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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