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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 기능성식품소재, 의약품원료로서의 이용성을 증대시키기 위한 목적으로 해당화 열매 성숙 단계별 생리활성의 변화 및 다양한 기능성 물질의 함량 변화를 비교 분석하였다. 또한 in-silico docking 분석을 통하여 항노화 관련 해당화 열매 추출물의 생리활성 물질을 탐색하였고, 이를 통하여 해당화 열매가 기능성소재로 활용될 수 있음을 규명하고자 하였다.
- 따라서 본 연구에서는 기능성식품소재, 의약품원료로서의 이용성을 증대시키기 위한 목적으로 해당화 열매 성숙 단계별 생리활성의 변화 및 다양한 기능성 물질의 함량 변화를 비교 분석하였다. 또한 in-silico docking 분석을 통하여 항노화 관련 해당화 열매 추출물의 생리활성 물질을 탐색하였고, 이를 통하여 해당화 열매가 기능성소재로 활용될 수 있음을 규명하고자 하였다.
제안 방법
- 합성된 cDNA는 SYBR®Green Realtime PCR Master Mix (Toyobo, Co., Ltd, Osaka, Japan)와 CFX96TM Real-time PCR system (Bio-Rad Laboratories, Inc, CA, USA)을 이용하여 Real-time PCR을 실행하였으며, 각 유전자들의 발현량은 actin의 발현량으로 정량 비교 분석하였다
- 해당화 열매 성숙 단계별 anthocyanin 생합성 및 carotenoid 생합성 관련 유전자들의 발현 양상을 분석하기 위해 해당화 열매로부터 total RNA를 FavorPrep Plant Total RNA Purification Mini kit (Favogen, PingTung, Taiwan)을 이용하여 추출하였다. 추출된 total RNA는 Nanodrop (DS-11+, DeNovix Inc, Wilmington, USA)을 이용하여 정량 하였으며, 500 ng의 total RNA는 ReverTra Ace®qPCR RT Master Mix (Toyobo, Co.
- 다음으로 우리는 열매 성숙 단계별 카로테노이드 함량 변화와 생합성 관련 유전자들의 발현 간의 상호 관계를 알아보기 위하여 PSY 1과 2 (Phytoene synthase 1 and 2), 그리고 Lcy B1 (lycopene β-cyclase 1)의 발현양상을 분석하였다
- 2002). 따라서, 우리는 해당화 열매 성숙 단계별 생리활성 물질의 함량 변화를 비교 분석하기 위하여 각 성숙 단계별 TPC, TFC 그리고 TCC를 측정하였다. 그 결과, TPC (19.
- 2011). 이들 유전자들의 발현이 해당화 열매의 플라보노이드 함량 변화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 열매 성숙 단계별 CHS, CHI, F3H 그리고 FLS의 발현량을 real-time PCR을 통해 확인하였다. Fig.
- 다음으로 우리는 stage I 추출물에 많이 함유 되어 있는 것으로 조사된 myricetin, chlorogenic acid, caffeic acid, syringic acid 그리고 p-coumaric acid의 elastase 억제제로서의 가능성을 알아보기 위해 in-silico molecular docking 분석을 통해 결합 부위 및 결합 형태를 예측해 보았다. 이를 위해 blind molecular docking을 각각 100번씩 실행하여 elastase 내 binding site를 탐색하였으며, 그 결과를 바탕으로 defined molecular docking을 실행하여 elastase에 대한 myricetin, chlorogenic acid, caffeic acid, syringic acid 그리고 p-coumaric acid의 binding energy 값을 예측한 결과, chlorogenic acid (- 5.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용한 해당화 열매는 충북대학교 포장에서 수확하여 사용하였다. 시료는 4단계의 성숙단계(Fig.
데이터처리
- 본 연구의 실험은 독립적으로 3회 실시되었으며 평균±표준오차로 처리하였다
- 통계분석은 SPSS (Version 23, IBM, USA)를 사용하여 ANOVA 분석을 실시하였으며, 유의적으로 차이가 있는 항목에는 Duncan’s Multiple Range Test를 사용하여 유의성을 분석하였다(p < 0.05).
이론/모형
- 성숙 단계별 해당화 열매 추출물의 TPC와 TFC는 각각 Folin–Ciocalteu 방법과 Colorimetric 방법을 통하여 측정 하였다(Hyun et al
- 2009)를 이용하였다. Molecular docking 분석은 Seo and Efferth (2016)의 방법을 이용하여 수행하였다. Blind docking의 경우, 전체 잔기를 포함하는 grid maps을 형성하고 number of evaluation은 2,500,000으로 number of run은 100으로 설정 하였으며, Defined docking의 매개변수 값은 number of evaluation은 250,000으로 number of run은 250으로 설정하였다.
- Blind docking의 경우, 전체 잔기를 포함하는 grid maps을 형성하고 number of evaluation은 2,500,000으로 number of run은 100으로 설정 하였으며, Defined docking의 매개변수 값은 number of evaluation은 250,000으로 number of run은 250으로 설정하였다. Docking 결과는 Lamarckian Genetic Algorithm을 이용하여 계산하였으며, AutodockTools- 1.5.7rc1을 사용하여 시각화 하였다. Elastase의 결합 포켓을 보여주는 표면표현이미지는 Visual Molecular Dynamics software (http://www.
성능/효과
- 그 결과, TPC (19.63±0.67 mg GAE/g to 4.74±0.05 mg GAE/g)와 TFC (3.37±0.04 mg QE/g to 0.67±0.04 mg QE/g)는 열매가 성숙함에 따라 감소하였으며, 이와 반대로 TCC (19.06±3.58 µg/g to 179.75±13.46 µg/g)는 열매가 성숙함에 따라 증가하는 것으로 조사되었다(Table 1).
- Fig. 1에서와 같이 CHS, CHI, F3H 그리고 FLS의 발현이 열매가 성숙됨에 따라 감소 하는 것으로 조사되었으며, 이는 해당화 열매가 성숙함에 따른 플라보노이드 함량 감소는 주로 이들 생합성 관련 유전자들의 발현 감소에 따른 결과임을 의미한다.
- 따라서 elastase 저해제 탐색은 주름 개선제 개발에 있어 주요 target이 되고 있다. 해당화 열매 추출물의 elastase 저해활성을 조사해본 결과, 추출물의 처리 농도가 증가 할수록 elastase 저해 활성이 증가하였으며, 해당화 열매가 성숙함에 따라 elastase 저해 활성이 감소하는 것으로 조사되었다(Fig. 3).
- 해당화 열매 추출물의 주요 polyphenol 성분을 규명 하고자 HPLC를 이용하여 성분 분석을 수행하였으며, 그 결과 총 19종의 polyphenol 성분을 검출하였다(Table 3). Stage I 추출물은 다른 추출물과 비교하여 mricetin (1.
- 특히 stage I 추출물에서는 cyringic acid, stage II 추출물에서는 caffeic acid, 그리고 stage III와 stage IV 추출물에서는 chlor-ogenic acid가 주요 성분으로 분석되었다(Table 3). 해당화 열매 성숙 단계에 따라 polyphenol 성분의 조성 및 함량의 차이가 있었으며, 이와 같은 차이가 해당화 열매 추출물의 생리활성에 많은 영향을 미친 것으로 사료된다. 또한 myricetin, caffeic acid 등의 polyphenol 화합물은 elastase의 enzymatic activity을 억제 함으로써 피부 노화 예방효과가 있는 것으로 보고됨에 따라 기능성 화장품의 원료로 각광 받고 있다(Duan et al.
- 다음으로 우리는 stage I 추출물에 많이 함유 되어 있는 것으로 조사된 myricetin, chlorogenic acid, caffeic acid, syringic acid 그리고 p-coumaric acid의 elastase 억제제로서의 가능성을 알아보기 위해 in-silico molecular docking 분석을 통해 결합 부위 및 결합 형태를 예측해 보았다. 이를 위해 blind molecular docking을 각각 100번씩 실행하여 elastase 내 binding site를 탐색하였으며, 그 결과를 바탕으로 defined molecular docking을 실행하여 elastase에 대한 myricetin, chlorogenic acid, caffeic acid, syringic acid 그리고 p-coumaric acid의 binding energy 값을 예측한 결과, chlorogenic acid (- 5.64 kcal/ mol)와 myricetin (- 5.59 kcal/ mol)가 높은 결합 친화력을 나타내는 것으로 조사되었다(Table 4). 4-hydroxybenzoic acid, pinocembrin, quercitrin 그리고 lupeol 등과 같은 elastase 억제제의 경우 elastase의 active site의 SER195 residue와 공유결합 함으로서 억제 활성을 나타내는 것으로 알려져 있으며(Narayanaswamy et al.
- 2013, 2015 and 2016), 이와 유사하게 chlorogenic acid과 myricetin은 SER195 residue와 hydrophobic interaction 하는 것으로 조사되었다(Table 4). 이상의 결과는 해당화 미성숙 열매 추출물 내 활성물질들은 elastase의 active site와 직접 결합함으로써 elastase 활성을 직접 억제함을 시사한다.
후속연구
- 5%의 elastase 저해 활성을 나타냈다. 이상의 연구 결과를 통하여 해당화 미성숙 열매는 피부노화 방지를 위한 화장품 소재로 개발이 가능할 것으로 생각된다.
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