[논문]편백나무(Chamaecyparis obtusa) 추출물의 항산화, 미백효과에 관한 연구

정여원; 김유미; 장영아

doi:10.12925/jkocs.2020.37.6.1496

편백나무(Chamaecyparis obtusa) 추출물의 항산화, 미백효과에 관한 연구
Studies on the Antioxidant and Whitening Effects of Chamaecyparis obtusa Extract 원문보기

Journal of the Korean Applied Science and Technology = 한국응용과학기술학회지, v.37 no.6, 2020년, pp.1496 - 1506

정여원 (대구한의대학교 화장품약리학과) , 김유미 ((주)바이노텍) , 장영아 (경성대학교 스마트헬스케어융복합연구센터)

초록
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본 연구는 화장품 소재로서 편백나무(Chamaecyparis obtusa)의 부위별 이용 가능성을 알아보기 위하여 잎·가지(Leaf), 수피(Bark), 목재(Wood), 뿌리(Root)로 분리하여 99.9 % 에탄올에 추출한 시료로 항산화, 미백효능을 확인하였다. 이를 위해 다음과 같은 연구를 진행하였다. 항산화 평가는 11-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거능, 2 2′-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS+) 라디칼 소거능으로 확인하였다. 미백 효과를 평가하기 위해서 mushroom tyrosinase 저해 활성 평가, MTT assay를 통한 편백나무 추출물의 세포독성평가를 진행하였으며 cellular tyrosinase 저해율 측정과 melanin 생합성량을 확인하였다. 항산화 활성 결과 편백나무 부위 중 수피(Bark) 추출물이 가장 효능이 우수하였으며 B16F10 melanoma cell내 편백나무 수피(Bark)는 tyrosinase 활성 억제 및 멜라닌 생합성 억제 효과를 나타내었다. 따라서 편백나무 수피 에탄올 추출물의 안전하고 우수한 미백 기능성 화장품의 천연물질 소재로서의 개발 가능성을 확인하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study was conducted as follows in order to find out the possibility of using (Chamaecyparis obtusa) by part as a cosmetic material. Chamaecyparis obtusa was separated leaves, bark, wood, and root, and extracted with 99.9% ethanol, and the antioxidant and whitening effects of the sample were confirmed. For this, the following studies were conducted. Antioxidant evaluation was confirmed by 1 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity, 2 2′-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS+) radical scavenging activity. To evaluate the whitening effect, mushroom tyrosinase inhibitory activity evaluation and cytotoxicity evaluation of Chamaecyparis obtusa extract through MTT assay were conducted, and cellular tyrosinase inhibition rate was measured and melanin contents was confirmed. As a result of antioxidant activity, Bark extract among Chamaecyparis obtusa parts showed the best efficacy, and bark in B16F10 melanoma cell showed tyrosinase activity inhibition and melanin contents inhibitory effects. Therefore, it was confirmed that the ethanol extract of Chamaecyparis obtusa was developed as a natural material for safe and excellent whitening functional cosmetics.

주제어

표/그림 (7)

표 Table 1. The yield of Chamaecyparis obtusa according to various extraction methods.
그림 Fig. 1. DPPH radical scavenging activity(%) of dependent on concentration from extracts of Chamaecyparis obtusa var. BHA : Butylated hydroxyanisole. Data are expressed as mean ± standard derviation (n=3). Statistical analysis was performed using Duncan's multiple range test with a significance level of P<0.05.
그림 Fig. 2. ABTS⁺ radical cation scavenging activity(%) of dependent on concentration from extracts of Chamaecyparis obtusa var. BHA: Butylated hydroxyanisole. Data are expressed as mean ± standard derviation (n=3). Statistical analysis was performed using Duncan's multiple range test with a significance level of P<0.05.
그림 Fig. 3. Tyrosinase inhibition activity(%) of dependent on concentration from extracts of Chamaecyparis obtusa var. Data are expressed as mean ± standard derviation (n=3). Statistical analysis was performed using Duncan's multiple range test with a significance level of P<0.05.
그림 Fig. 4. Cell viability of dependent on concentration from extracts of Chamaecyparis obtusa var (Bark) extracts in B16F10 melanoma cells. The results are presented as mean±standard deviation of triplicate data. The values the mean ± S.D. from three independent experiments *p<0.05 vs control group.
그림 Fig. 5. Effect of dependent on concentration from extracts of Chamaecyparis obtusa var (Bark) extracts on inhibition of intracellular tyrosinase inhibition rate. The results are presented as mean±standard deviation of triplicate data. The results were expressed as the average of triplicate. *p＜0.05, compared with control. Nor, normal group (α-MSH untreated group); Cont, control group (α-MSH treated group).
그림 Fig 6. Effect of dependent on concent ration from extracts of Chamaecyparis obtusa var (Bark) extracts on melanin synthesis rate. The results are presented as mean±standard deviation of triplicate data. The results were expressed as the average of triplicate. *p＜0.05, compared with control. Nor, normal group (α-MSH untreated group); Cont, control group (α-MSH treated group).

AI 본문요약
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문제 정의

편백을 이용한 화장품 소재 활성 평가에 대한 연구는 미흡하며 특히 미백효과에 대한 연구는 많이 진행되지 않음을 확인하였다. 본 연구에서는 편백을 부위별로 에탄올 추출하여 항산화 활성을 알아보고 부위별 가장 효능이 좋은 편백의 목재부위를 이용하여 마우스 유래 흑색종 세포 murine melanoma cell lines (B16F10)내 MTT assay를 통한 시료의 안전성을 검토하였다. 피부 미백에 도움을 주는 기능성 화장품 유효성 평가 가이드라인에 해당하는 cellular tyrosinase 저해율, melanin 생합성량 실험법을 통해 편백 목재추출물의 미백 기능성 화장품 소재로의 활용가능성에 대하여 연구하였다.
본 연구에서는 화장품 천연물질 소재로서의 편백나무(Chamaecyparis obtusa)의 부위별 이용 가능성을 알아보기 위하여, 잎·가지(Leaf), 수피 (Bark), 목재(Wood), 뿌리(Root)로 분리하여 99.9 % 에탄올 추출물을 이용하여 항산화 및 미백 효능 실험을 진행하여 화장품 기능성 소재로서의 가능성에 대해 평가 하였으며 다음과 같은 결론을 얻었다. DPPH radical scavenging activity 측정 결과, 10 μg/mL에서 수피(Bark) (79.
본 연구에서는 편백을 부위별로 에탄올 추출하여 항산화 활성을 알아보고 부위별 가장 효능이 좋은 편백의 목재부위를 이용하여 마우스 유래 흑색종 세포 murine melanoma cell lines (B16F10)내 MTT assay를 통한 시료의 안전성을 검토하였다. 피부 미백에 도움을 주는 기능성 화장품 유효성 평가 가이드라인에 해당하는 cellular tyrosinase 저해율, melanin 생합성량 실험법을 통해 편백 목재추출물의 미백 기능성 화장품 소재로의 활용가능성에 대하여 연구하였다.

제안 방법

수피(Bark)는 5 ~20 μg/mL 의 농도까지 80% 이상의 세포 생존율을 보였다. 40~100 μg/mL 의 농도까지 세포 독성을 나타낸 결과를 토대로 이후 진행한 실험은 세포 생존율 구간을 참고하여 다음실험을 진행 하였다.
같이 측정하였다. ABTS⁺ radical catione 7.4 mM ABTS⁺ [2, 2'- azino-bis(3-ethylbenzothia-zoline-6-sulfonic acid)]와 2.6 mM potassium persulfate (K₂S₂O₈)을 1:1로 혼합하여 암 실에서 실온으로 24 h 동안 반응하였다. 사용전에 ABTS+ 용액을 에탄올에 희석하여 734 nm에서 흡광도 값이 0.
Cellular tyrosinase 활성실험과 함께 미백활성 평가에 이용되는 melanin 생합성 저해율의 실험결과는 다음과 같다. B16F10 melanoma 세포에 멜라닌 자극제인 α-MSH를 처리하여 멜라닌 합성을 유도한 후 편백나무수피(Bark) 추출물을 처리하고 melanin 세포의 pellet을 NAOH를 처리하여 흡광도로 분석하였다. melanin 생합성율은 농도별 (5, 10, 20) μg/mL에 따라 82.
멜라닌 생합성에 있어서 중요한 핵심 효소인 tyrosinase는 구리를 함유한 monooxygenase 효소로 이 효소는 tyrosine을 DOPA(3, 4-dihydroxyphenylalanine), DOPA quinone, melanin으로 변형시킨다[21]. 따라서 tyrosinase의 활성을 저해시킨다면 피부에 melanin이 생성되는 것을 억제시킬 수 있으므로편백의 부위별 tyrosinase 저해활성을 측정하였다. 그 결과 Fig.
Louis, MO, USA) 에서구입하였다. 또한 실험측정기기는 ELISA reader (Tecan, Männedorf, Switzerland)를 이용하여 분석하였다.
B16F10 melanoma cell을 6 well plate에 cell counting을 하여 5×10⁴ cells/well이 되도록 분주하고, 37℃, 5% CO₂incubator에서 24 h 배양하였다. 배양 후 농도별로 조제한 시료와 함께 멜라닌 자극제인 α-melanocyte stimulating hormone (α-MSH)을 200 nM이 되도록 처리하였다. 48 h 배양한 후 phosphate buffered saline (PBS; Gibco, NY, USA)로 3회 세척 후 12, 000 rpm, 4℃, 30 min 원심 분리하여 상층 액을 버리고 침전물에 10% dimethyl sulfoxide (DMSO; Duksan, Korea)가 첨가된 1N NaOH 용액을 200 μL 첨가하고 60℃에서 1 h 용해하였으며 405 nm에서 흡광도를 측정한 후 실험군의 멜라닌 양은 대조군의 멜라닌 양에 대한 백분율로 계산하여 나타내었다.
있다[22]. 본 연구에서는 편백나무(Chamaecyparis obtusa) 에서 분리한 수피(Bark)가 B16F10 melanoma 세포 독성에 미치는 농도를 조사하고, 실험에 사용 가능한 농도 범위 설정을 위해 MTT assay를 시행하였으며, 수피(Bark)를 5, 10, 20, 40, 80, 100 μg/mL로 처리한 후 세포 독성 측정 결과 Fig. 4.와 같이 나타내었다. 수피(Bark)는 5 ~20 μg/mL 의 농도까지 80% 이상의 세포 생존율을 보였다.
4%) 순으로 mushroom tyrosinase 활성을 저해하였다. 편백 수피는 DPPH radical 및 ABTS+ radical 소거능이 우수하고 미백 효능도 4가지 부위 중 가장 높아 수피(Bark) 추출물의 B16F10 melanoma 세포 내 미백활성을 평가하기로 하였다.

대상 데이터

B16F10 세포의 배양은 10% fetal bovine serum (FBS; Introgen Therapeutics, USA)과 1% penicillin/ streptomycin (Hyclone^™, GE Healthcare Life Sciences, USA) 100 U/mL을 첨가한 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM; Gibco™, Thermo Fisher Scientific, USA) 배지를 사용하였으며 37℃, 5% CO₂incbator (Forma^™, Thermo Fisher Scientific, USA)에 적응시켜 계대 배양하였다. 미백 실험을 위한 시약 3-(4 5-dimethylthiazol -2-yl)-2 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 와 0.4% trypan blue stain, mushroom tyrosinase, tyrosine, L-DOPA, griess reagent는 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) 에서구입하였다. 또한 실험측정기기는 ELISA reader (Tecan, Männedorf, Switzerland)를 이용하여 분석하였다.
본 연구에서 사용한 편백나무(Chamaecyparis obtusa)는 2020년 3월 전남 광양시 광양읍 일원에서 채취한 것을 시험재료로 사용하였다. 편백나무(Chamaecyparis obtusa)는 잎·가지(Leaf) 부분과 수피(Bark), 목재(Wood), 뿌리(Root) 부분을 분리하여 통풍이 잘되는 그늘에서 건조 하였다.
9% 에탄올을 넣어 실온에서 24 h마다 2번에 걸쳐 추출물을 얻었다. 이를 거름종이 (Whatman No. 2, GE healthcare, Arlington Heights, IL, USA)를 사용하여 여과한 뒤, 여과액을 용기에 넣어 40℃의 수온에서 rotary vacuum evaporator (HS-10SP; Hahnshin S&T, Korea)를 사용하여 감압농축 후 동결기(FD5525; Ilshin BioBase, Korea)로 건조하고 얻어진 분말을 4℃에 보관하여 실험에 사용하였으며 시료의 수율은 Table 1과 같다.
항산화 실험에 사용된 시약인 DPPH (1 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)와 ABTS⁺(2 2′ -azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt), Trizma base, Pyroallol 은 Sigma-Aldrich Co. (Saint Louis, MO, USA) 에서, B16F10 세포(murine melanoma cell lines) 는 한국세포주은행 (Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. B16F10 세포의 배양은 10% fetal bovine serum (FBS; Introgen Therapeutics, USA)과 1% penicillin/ streptomycin (Hyclone^™, GE Healthcare Life Sciences, USA) 100 U/mL을 첨가한 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM; Gibco™, Thermo Fisher Scientific, USA) 배지를 사용하였으며 37℃, 5% CO₂incbator (Forma^™, Thermo Fisher Scientific, USA)에 적응시켜 계대 배양하였다.

데이터처리

Data are expressed as mean ± standard derviation (n=3). Statistical analysis was performed using Duncan's multiple range test with a significance level of P<0.05.
실험결과에 대한 통계처리는 Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) software package (Version 22.0; IBM, USA)를 이용하여 평균과 표준편차로 나타내었고, 각 처리군 간의 유의성에 대한 검증은 분산분석(ANOVA: analysis of variance)를 이용하여 유의성을 확인한 후, p<0.05 수준에서 Duncan’s multiple test를 이용하여 분석하였다.

이론/모형

전자공여능(EDA; electron donating ability)은 DPPH free radical 소거법으로 다음과 같이 측정되었다. 각 시료 용액 100 μL에 0.

성능/효과

8em;">과 같이 나타내었다. 50 μg/mL 에서 잎·가지(Leaf) (93.2%), 수피(Bark) (95.7%), 뿌리(Root) (94.7%)는 90% 이상이 넘는 DPPH radical 소거능력을 보였으며, 수피 (Bark)는 저농도 10 μg/mL에서 79.8%의 매우 높은 DPPH radical 소거능력을 나타내어 다른 부위와 비교하여 가장 효능이 높았으며 동일 농도에서 대조군인 BHA 72.8%의 효능과 비교하여 더 높은 활성을 나타내어 DPPH radical 소거 능이 가장 우수함을 확인하였다.
2와 같이 나타내었다. 50 μg/mL에서 잎·가지(Leaf)는 98.4%, 수피(Bark) 는 99.8%, 뿌리(Root)는 99.4%로 목재 부위를 제외한 부위에서 90% 이상의 ABTS+ radical 소거능력을 보였으며, 수피(Bark)는 낮은 농도인 10 μg/mL에서 71.6% ABTS+ radical 소거능을 나타내 항산화 활성이 우수함을 확인하였다. 편백나무 엑기스를 모아 녹인 편백나무 추출액의 ABTS⁺ radical 소거능 결과에서 50 μg/mL 농도에서 62.
1%)순으로 DPPH radical 소거 능력을 보여주었다. ABTS⁺ radical cation scavenging activity 측정 결과, 10 μ g/mL에서 수피(Bark) (71.6%) > 목재(Wood) (48.6%) > 뿌리(Root) (46.8%) > 잎·가지(Leaf) (41.1%) 순으로 ABTS⁺ radical소거능을 나타내었다. 항산화 실험에서 편백나무 부위별 4종의 에탄올 추출물 시료 중, 수피(Bark)가 가장 항산화 활성이 높음을 나타내었다.
B16F10 melanoma 세포 내 편백나무(Chamaecyparis obtusa)에서 분리한 수피 (Bark)의 미백활성에 대해 cellular tyrosinase 저해 활성 측정 결과는 α-MSH를 200nM 자극군 (control)을 100%로 계산하여 대비하여 각 시료를 농도별 (5, 10, 20) μg/mL로 처리하였을 때각 94.8%, 91.6%, 83.5%의 tyrosinase 활성이나 타내어 농도의존적으로 미백활성을 나타내었다 (Fig. 5). 멜라닌은 tyrosin이 tyrosinase의 작용에 의해 여러가지 물질로 대사되는 과정 중에 최종적으로 합성된 물질이기 때문에 멜라닌의 생성 효소인 tyrosinase는 멜라닌 생합성의 속도결정단계를 촉매하는 것으로 알려져 있다[24].
9 % 에탄올 추출물을 이용하여 항산화 및 미백 효능 실험을 진행하여 화장품 기능성 소재로서의 가능성에 대해 평가 하였으며 다음과 같은 결론을 얻었다. DPPH radical scavenging activity 측정 결과, 10 μg/mL에서 수피(Bark) (79.8%) > 뿌리(Root) (72.7%) > 잎·가지(Leaf) (40.4%) > 목재(Wood) (9.1%)순으로 DPPH radical 소거 능력을 보여주었다. ABTS⁺ radical cation scavenging activity 측정 결과, 10 μ g/mL에서 수피(Bark) (71.
B16F10 melanoma 세포에 멜라닌 자극제인 α-MSH를 처리하여 멜라닌 합성을 유도한 후 편백나무수피(Bark) 추출물을 처리하고 melanin 세포의 pellet을 NAOH를 처리하여 흡광도로 분석하였다. melanin 생합성율은 농도별 (5, 10, 20) μg/mL에 따라 82.7%, 78.7%, 74.3% 의 합성율을 나타내어 cellular tyrosinase 억제능과 유사한 활성을 보였다(Fig. 6).
항산화 실험에서 편백나무 부위별 4종의 에탄올 추출물 시료 중, 수피(Bark)가 가장 항산화 활성이 높음을 나타내었다. 미백활성 평가인 mushroom tyrosinase 저해활성 측정 결과, 1000 μ g/mL에서 수피(Bark) (42.0%) > 잎·가지 (Leaf) (40.9%) > 뿌리(Root) (32.0%) > 목재(Wood)(27.4%) 순으로 tyrosinase 활성을 저해하였다. 부위별 활성 중 가장 효능이 우수한 수피(Bark) 추출물의 B16F10 melanoma 세포 내 미백 활성을 측정하기 위한 시료의 세포독성 측정결과, 20 μ g/mL 의 농도까지 80% 이상의 세포 생존율 나타내어 안전한 시료의 농도를 검증하였다.
4%) 순으로 tyrosinase 활성을 저해하였다. 부위별 활성 중 가장 효능이 우수한 수피(Bark) 추출물의 B16F10 melanoma 세포 내 미백 활성을 측정하기 위한 시료의 세포독성 측정결과, 20 μ g/mL 의 농도까지 80% 이상의 세포 생존율 나타내어 안전한 시료의 농도를 검증하였다. 수피 추출물의 cellular tyrosinase 저해활성에서 α -MSH 자극군에 대비 수피추출물을 농도별 (5, 10, 20) µg/mL로 처리하였을 때 농도 의존적으로 tyrosinase 활성이 저해되는 것을 확인하였으며 melanin 생합성에 미치는 영향을 측정한 결과 20 µg/mL 농도에서 멜라닌의 합성을 25.
부위별 활성 중 가장 효능이 우수한 수피(Bark) 추출물의 B16F10 melanoma 세포 내 미백 활성을 측정하기 위한 시료의 세포독성 측정결과, 20 μ g/mL 의 농도까지 80% 이상의 세포 생존율 나타내어 안전한 시료의 농도를 검증하였다. 수피 추출물의 cellular tyrosinase 저해활성에서 α -MSH 자극군에 대비 수피추출물을 농도별 (5, 10, 20) µg/mL로 처리하였을 때 농도 의존적으로 tyrosinase 활성이 저해되는 것을 확인하였으며 melanin 생합성에 미치는 영향을 측정한 결과 20 µg/mL 농도에서 멜라닌의 합성을 25.7% 저해하여 시료의 미백활성효능을 확인하였다. 결과적으로 편백나무 수피(Bark) 에탄올 추출물은 잎· 가지, 뿌리, 목재 추출물 중 가장 우수한 항산화 활성과 미백활성이 확인 되었으며 향후 미백 관련 유전자 발현의 검증 및 melanin 생성 기전 연구를 통해 그 가능성을 확인하여 기능성화장품의 원료로써 활용이 가능함을 시사한다.
2 mM의 DPPH 용액을 50 μL를 넣고 교반한 후 차광하여 30 min 방치한 다음 517 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능 효과는 시료용액의 첨가 구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.
6% ABTS+ radical 소거능을 나타내 항산화 활성이 우수함을 확인하였다. 편백나무 엑기스를 모아 녹인 편백나무 추출액의 ABTS⁺ radical 소거능 결과에서 50 μg/mL 농도에서 62.0%의 활성을 가지는 것과 비교할 때[19] 편백 수피 99.9% 에탄올 추출물의 효능이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
1%) 순으로 ABTS⁺ radical소거능을 나타내었다. 항산화 실험에서 편백나무 부위별 4종의 에탄올 추출물 시료 중, 수피(Bark)가 가장 항산화 활성이 높음을 나타내었다. 미백활성 평가인 mushroom tyrosinase 저해활성 측정 결과, 1000 μ g/mL에서 수피(Bark) (42.

후속연구

7% 저해하여 시료의 미백활성효능을 확인하였다. 결과적으로 편백나무 수피(Bark) 에탄올 추출물은 잎· 가지, 뿌리, 목재 추출물 중 가장 우수한 항산화 활성과 미백활성이 확인 되었으며 향후 미백 관련 유전자 발현의 검증 및 melanin 생성 기전 연구를 통해 그 가능성을 확인하여 기능성화장품의 원료로써 활용이 가능함을 시사한다.

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L. Z. Piao, H. R. Park, Y. K. Park, S. K. Lee, J. H. Park, M. K. Park. "Mushroom tyrosinase inhibition activity of some chromones", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, Vol.50, No.3 pp. 309-311 (2002).

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A. Korner, J. Pawelek, "Mammalian tyrosinase catalyzes three reactions in the bio synthesis of melanin", Science, Vol.217, No.4565, pp. 1163-1165, (1982).

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K. Maeda, T. Naitou, K. Umishio, T. Fukuhara, A. Motoyama, "A novel melanin inhibitor: hydroperoxy traxastanetype triterpene from flowers of Arnica montana", Biological and Pharmaceutical Bulletin, Vol.30, No.5 pp. 873-879 (2007).

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F. A. Badria, M. A. elGayyar, "A new type of tyrosinase inhibitors from natural products as potential treatments for hyperpigmentation", Bollettino Chimico Farmaceutico, Vol.140, No.4 pp. 267-271 (2007).

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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