[논문]배양가능한 피부세균의 분리 및 동정

배영민

doi:10.12925/jkocs.2020.37.6.1698

배양가능한 피부세균의 분리 및 동정
Isolation and identification of culturable bacteria from human skin 원문보기

Journal of the Korean Applied Science and Technology = 한국응용과학기술학회지, v.37 no.6, 2020년, pp.1698 - 1705

초록
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나이가 20-25세인 남녀 성인들 20명(남성 5명, 여성 15명)의 엄지손가락 표면에 상재하는 세균을 채취하고 Luria-Bertani agar에서 배양하였다. 배양된 세균들의 16S rDNA를 polymerase chain reaction을 통하여 증폭하고, 그 염기서열을 분석하였다. 이렇게 얻어진 염기서열을 genbank의 자료들과 비교하여 세균들을 동정한 결과, 총 14종의 세균들이 확인되었다. 개인별로는 평균 2.5종의 배양 가능한 세균들을 손의 피부에 보유하는 것으로 확인되었다. 확인된 세균 중에서는 Staphylococcus 종들이 가장 널리 존재하고 있었으며, 다음으로는 Micrococcus luteus이었다. Staphylococcus 종들의 경우에는 그 분포에 있어서 성별에 따른 차이가 적었으나, Micrococcus luteus의 경우에는 남자보다 여자에게서 훨씬 더 많이 분리되는 경향을 보였다. 이러한 결과는 피부 질환에 대한 연구, 피부질환에 대한 치료제 개발, 피부에 사용하는 화장품개발 등의 분야에 도움이 될 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Bacteria were collected from the thumb surface of the twenty young adults that are 20 to 25 years old and cultured on the Luria-Bertani agar. The 16S rDNA of the cultured bacteria was amplified by polymerase chain reaction(PCR) and DNA sequence of the PCR products analyzed. Total 14 different bacterial species were identified by comparing their 16S rDNA sequence with the data in genbank. It appears that each individual has 2.5 different bacterial species in average. Staphylococcal species were the most abundant among the identified bacteria and Micrococcus luteus was the second. Staphylococcal species were isolated at similar frequency between male and female donors but Micrococcus luteus was isolated more frequently from female than male donors. The result obtained in this study might be useful in research of dermatic diseases, searching for new drugs for those diseases and development of new cosmetics.

주제어

표/그림 (4)

표 Table 1. Primers used for PCR to amplify 16S rDNA
표 Table 2. Total numbers of bacteria isolated from male donors
표 Table 3. Total numbers of bacteria isolated from female donors
표 Table 4. Number of isolated bacteria from male and female donors

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 여러 다양한 지역에 거주하는 사람들의 피부에 존재하는 미생물을 주거환경, 성별 또는 나이에 따라 분석해 보면 피부건강을 유지하거나 미용을 위해 이용될 수 있는 자료들이 얻어질 수 있다. 이러한 목적을 위하여 본 연구에서는 경남 창원지역에 거주하는 20대 초반의 건강한 성인 남녀를 대상으로 호기적 조건하의 Luria-Bertani agar에서 배양 가능한 피부세균들을 분리하고 동정하였다.

제안 방법

20대 초반 성인들의 피부에 주로 존재하는 세균들에 대한 연구를 수행하기 위하여 나이가 20-25세인 남녀 대학생들 20명(남성 5명, 여성 15명)의 손가락 표면에 상재하는 세균을 채취하고 배양 가능한 세균들을 동정하였다. 그 결과, 14종의 세균들이 확인되었으며, 개인별로 평균 2.
PCR products는 0.7% agarose gel에서 분자량에 따라 separation 시켜서 산물을 확인한 후, Promega Corporation의 Gel and PCR purification system을 사용하여 DNA를 정제 하였다. 정제된 PCR product는 ATP와 T4 polynucleotide kinase로 5’ 말단을 인산화시켜주었다.
PCR 반응을 위해서는 DNA template 100 ng, forward primer 2.5 pmol, reverse primer 2.5 pmol, dNTPs mixture 2 μl (10 nM each) 그리고 Pfu DNA polymerase 1 μl (3 U)를 포함하는 100 μl의 반응액에서 반응을 진행하였다. 16S rDNA 중에서 V3-V4 region을 증폭하기 위해서는 forward primer로서 341f 및 reverse primer로서 785r을 사용하였다[4] (Table 1).
coli 세포들을 100 μg/ml의 ampicillin을 함유하는 MacConkey agar 에 도말하고 37℃에서 배양하였다. 나타난 colony들 중에서 흰색 colony들을 골라서 이들로부터 plasmid DNA를 추출한 후에, supercoiled plasmid DNA를 agarose gel electrophoresis로 분석하였다. 예상되는 크기의 PCR 산물이 확인되면 (주)솔젠트(Daejeon, Korea)에 의뢰 하여 insert DNA들의 염기서열을 분석하였다.
시료를 채취한 때가 11월이었는데, 이 시기에 사람 손가락 표면의 온도가 대략 30℃ 정도 되는 것으로 보고되었으므로, 채취된 세균들의 배양온도를 30℃로 결정하였다[7]. 세균들을 집락의 형태 및 현미경 관찰 결과에 따라서 분리한 후에, 각 그룹을 대표하는 세균들의 genomic DNA를 추출하고, 이것을 template로 사용하여 16S rDNA를 증폭하였다. 이렇게 얻어진 PCR 산물들을 plasmid에 삽입하여 염기서열 분석을 수행하였다.
얻어진 염기서열은 Genbank의 BLAST program으로 다른 세균들의 16S rDNA 염기서열들과 similarity를 비교하여 분리된 세균들을 동정하였다[6].
나타난 colony들 중에서 흰색 colony들을 골라서 이들로부터 plasmid DNA를 추출한 후에, supercoiled plasmid DNA를 agarose gel electrophoresis로 분석하였다. 예상되는 크기의 PCR 산물이 확인되면 (주)솔젠트(Daejeon, Korea)에 의뢰 하여 insert DNA들의 염기서열을 분석하였다.
도달할 때까지 배양하였다. 이렇게 배양된 세균 세포로부터 genomic DNA를 추출하였다. Genomic DNA의 추출에는 Macherey-Nagel, Inc.
세균들을 집락의 형태 및 현미경 관찰 결과에 따라서 분리한 후에, 각 그룹을 대표하는 세균들의 genomic DNA를 추출하고, 이것을 template로 사용하여 16S rDNA를 증폭하였다. 이렇게 얻어진 PCR 산물들을 plasmid에 삽입하여 염기서열 분석을 수행하였다. 얻어진 염기서열들은 Genbank의 BLAST program을 이용하여 세균을 동정하였다 [6].
이렇게 얻어진 세균들을 집락의 형태에 따라 몇 개의 그룹으로 나누고 각 그룹에 속하는 세균들을 Gram 염색법으로 염색한 후에 각 세균 세포의 형태 및 색을 현미경으로 관찰하였다. 집락의 특징 및 Gram 염색의 결과로 관찰된 각 세균들의 형태 및 염색 특성을 바탕으로 세균들을 여러 그룹으로 나누었다.
16S rDNA 중에서 V3-V4 region을 증폭하기 위해서는 forward primer로서 341f 및 reverse primer로서 785r을 사용하였다[4] (Table 1). 이렇게 얻어진 염기서열로 정확한 동정이 불가능할 경우에는 forward primer로 16S rDNA 5'-말단의 conserved region을 target으로 하여 제조된 fD1 및 reverse primer로 16S rDNA 3' 부위를 target으로 하여 제조된 rP2를 사용하여 16S rDNA 전체를 증폭하여 추가로 분석하였다[5] (Table 1). V3-V4 region을 증폭할 때에는 95℃ 에서 2분간 한 cycle, 그리고 95℃에서 45초, 5 5℃에서 45초, 72℃에서 1분씩 30 cycle을 진행시킨 후, 최종적으로 72℃에서 5분간 유지시켰고, 16S rDNA 전체를 증폭할 때에는 elongation time을 2분으로 증가시켰다.
정제된 genomic DNA들을 template로 사용하여 polymerase chain reaction (PCR)을 수행하였다. PCR 반응을 위해서는 DNA template 100 ng, forward primer 2.
정제된 PCR product는 ATP와 T4 polynucleotide kinase로 5’ 말단을 인산화시켜주었다. 제한효소 SmaⅠ으로 절단하고 bacterial alkaline phosphatase로 처리하여 5’ 말단의 인산기를 제거한 pBluscript Ⅱ SK- plasmid DNA와 PCR 산물을 섞어서 ligation 시키고, competent Escherichia coli DH₅α에 transformation 하였다. Transformation된 E.
이렇게 얻어진 세균들을 집락의 형태에 따라 몇 개의 그룹으로 나누고 각 그룹에 속하는 세균들을 Gram 염색법으로 염색한 후에 각 세균 세포의 형태 및 색을 현미경으로 관찰하였다. 집락의 특징 및 Gram 염색의 결과로 관찰된 각 세균들의 형태 및 염색 특성을 바탕으로 세균들을 여러 그룹으로 나누었다.

대상 데이터

5 pmol, dNTPs mixture 2 μl (10 nM each) 그리고 Pfu DNA polymerase 1 μl (3 U)를 포함하는 100 μl의 반응액에서 반응을 진행하였다. 16S rDNA 중에서 V3-V4 region을 증폭하기 위해서는 forward primer로서 341f 및 reverse primer로서 785r을 사용하였다[4] (Table 1). 이렇게 얻어진 염기서열로 정확한 동정이 불가능할 경우에는 forward primer로 16S rDNA 5'-말단의 conserved region을 target으로 하여 제조된 fD1 및 reverse primer로 16S rDNA 3' 부위를 target으로 하여 제조된 rP2를 사용하여 16S rDNA 전체를 증폭하여 추가로 분석하였다[5] (Table 1).
Genomic DNA preparation에는 NucleoSpin Microbial DNA Kit(Macherey-Nagel)이 사용되었고, plasmid DNA preparation에는 NucleoSpin Plasmid EasyPure kit(Macherey-Nagel)이 사용되었다. PCR에 사용된 Pfu DNA polymerase 및 dNTP mixture는 Promega Corporation (Madison, WI, USA)의 제품을 사용하였다.
나이가 20-25세인 남녀 대학생들 20명(남성 5 명, 여성 15명)의 엄지손가락을 LB agar의 표면에 접촉시켜서 세균을 옮긴 후 30℃에서 3일간 배양하였다. 시료를 채취한 때가 11월이었는데, 이 시기에 사람 손가락 표면의 온도가 대략 30℃ 정도 되는 것으로 보고되었으므로, 채취된 세균들의 배양온도를 30℃로 결정하였다[7].
실험에 사용된 Luria-Bertani(LB) agar는 BactoTM Tryptone (BD), Bacto^TM Yeast extract (BD), sodium chloride (Junsei Chemical Co.) 및 agar (USB corp.)를 사용하여 제조하였다. Genomic DNA preparation에는 NucleoSpin Microbial DNA Kit(Macherey-Nagel)이 사용되었고, plasmid DNA preparation에는 NucleoSpin Plasmid EasyPure kit(Macherey-Nagel)이 사용되었다.

데이터처리

이렇게 얻어진 PCR 산물들을 plasmid에 삽입하여 염기서열 분석을 수행하였다. 얻어진 염기서열들은 Genbank의 BLAST program을 이용하여 세균을 동정하였다 [6].

이론/모형

)를 사용하여 제조하였다. Genomic DNA preparation에는 NucleoSpin Microbial DNA Kit(Macherey-Nagel)이 사용되었고, plasmid DNA preparation에는 NucleoSpin Plasmid EasyPure kit(Macherey-Nagel)이 사용되었다. PCR에 사용된 Pfu DNA polymerase 및 dNTP mixture는 Promega Corporation (Madison, WI, USA)의 제품을 사용하였다.
이렇게 배양된 세균 세포로부터 genomic DNA를 추출하였다. Genomic DNA의 추출에는 Macherey-Nagel, Inc. (Bethlehem, PA, USA)의 NucleoSpin Microbial DNA kit를 사용하였고, 실험방법은 kit에 동봉된 protocol에 따랐다.

성능/효과

확인된 세균 중에서는 Staphylococcus 종들이 가장 널리 존재하고 있었으며, 두 번째로는 Micrococcus luteus이었다. Staphylococcus 종들의 경우에는 그 분포에 있어서 성별에 따른 차이가 적었으나, Micrococcus luteus의 경우에는 남성보다 여성에게서 훨씬 더 많이 분리되는 경향을 보였다. 이러한 결과는 피부 질환에 대한 연구, 피부질환에 대한 치료제 개발, 피부에 사용하는 화장품개발 등의 분야에 큰 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.
배양 가능한 세균들을 동정하였다. 그 결과, 14종의 세균들이 확인되었으며, 개인별로 평균 2.5종의 세균을 손에 보유하는 것으로 확인되었다. 세균의 가짓수는 성별에 따른 차이가 거의 없었다.
따라서 이 세균의 경우에는 여성보다 남성에게서 더 많이 분리되는 경향을 보이고 있다. 남성과 여성 모두에서 개인에 따라 1종부터 4종까지의 세균들이 분리되었고, 평균적으로 남성들은 2.6종, 여성들은 2.5종의 세균들이 분리되었다(Table 4). 그러므로 개인별로 분리되는 세균의 가짓수는 성별에 따라 큰 차이가 없음을 알 수 있었다.
따라서 이 세균의 분포는 성별에 따라 별다른 차이를 보이지 않았다. 두 번째로 자주 분리된 세균은 Micrococcus luteus로서 이 세균은 전체적으로는 시료 제공자의 60%가 보유하고 있으나, 남성의 경우에는 20%, 여성의 경우에는 73%가 보유하고 있었다. 따라서 이 세균의 경우에는 남성보다 여성들이 훨씬 더 흔하게 보유하고 있는 것으로 나타났다.
두 번째로 자주 분리된 세균은 Micrococcus luteus로서 이 세균은 전체적으로는 시료 제공자의 60%가 보유하고 있으나, 남성의 경우에는 20%, 여성의 경우에는 73%가 보유하고 있었다. 따라서 이 세균의 경우에는 남성보다 여성들이 훨씬 더 흔하게 보유하고 있는 것으로 나타났다. 세 번째로는 Staphylococcus aureus로서 전체적으로는 40%가 보유하고 있으며, 남성의 60%, 여성의 33%가 보유하고 있었다.
본 연구를 수행한 결과, 피부에서 병원체, 기회 성 병원체 및 공생체를 포함한 다양한 세균들이 분리되었다. 이러한 세균들은 인간의 피부라는 서식처를 놓고 서로 경쟁을 하며 균형을 유지하고 있다.
그러므로 개인별로 분리되는 세균의 가짓수는 성별에 따라 큰 차이가 없음을 알 수 있었다. 분리된 14종의 세균들이 속하는 문(phylum)을 살펴보면 모두 Actinobacteria, Firmicutes 및 Proteobacteria의 3개 문(phylum)에 속한다는 것을 알 수 있고, 특이하게도 남성들로부터 분리된 세균들은 모두 Actinobacteria와 Firmicutes에 속하는 Gram 양성 세균들이었다(Table 2).
수집된 세균들을 분석한 결과 14종의 세균들이확인되었다. 분리된 세균 중에서는 Staphylococcus petrasii가 20명 중에서 15명으로부터 분리되어 시료 제공자의 75%가 보유하고 있었다. 따라서 이 세균이 가장 널리 분포되어 있는 것으로 나타났다.
따라서 이 세균의 경우에는 남성보다 여성들이 훨씬 더 흔하게 보유하고 있는 것으로 나타났다. 세 번째로는 Staphylococcus aureus로서 전체적으로는 40%가 보유하고 있으며, 남성의 60%, 여성의 33%가 보유하고 있었다. 따라서 이 세균의 경우에는 여성보다 남성에게서 더 많이 분리되는 경향을 보이고 있다.
수집된 세균들을 분석한 결과 14종의 세균들이확인되었다. 분리된 세균 중에서는 Staphylococcus petrasii가 20명 중에서 15명으로부터 분리되어 시료 제공자의 75%가 보유하고 있었다.
따라서 이 세균이 가장 널리 분포되어 있는 것으로 나타났다. 이 세균은 남성의 경우에는 5명 중에서 4 명으로부터 분리되었으므로 남성의 80%가 보유하고 있었고(Table 2), 여성의 경우에는 15명 중에서 11명으로부터 분리되었으므로 여성의 73% 가 보유하는 것으로 확인되었다(Table 3). 따라서 이 세균의 분포는 성별에 따라 별다른 차이를 보이지 않았다.
피부상재 세균 중에서 가장 흔한 것이 Staphylococcus epidermidis로 알려져 있으나, 본연구에서는 이 세균보다 Staphylococcus petrasii 가 더 흔하게 존재하는 것으로 나타났다. S.
세균의 가짓수는 성별에 따른 차이가 거의 없었다. 확인된 세균 중에서는 Staphylococcus 종들이 가장 널리 존재하고 있었으며, 두 번째로는 Micrococcus luteus이었다. Staphylococcus 종들의 경우에는 그 분포에 있어서 성별에 따른 차이가 적었으나, Micrococcus luteus의 경우에는 남성보다 여성에게서 훨씬 더 많이 분리되는 경향을 보였다.

후속연구

[21]. 그러므로 이 세균의 경우에도 병원성이 균주에 따라 다르게 나타나는 것인지 아니면 세균을 투여 받은 사람의 면역력에 따라 다르게 나타나는 것인지에 대해서는 추가적인 연구가 필요하다.
Staphylococcus 종들의 경우에는 그 분포에 있어서 성별에 따른 차이가 적었으나, Micrococcus luteus의 경우에는 남성보다 여성에게서 훨씬 더 많이 분리되는 경향을 보였다. 이러한 결과는 피부 질환에 대한 연구, 피부질환에 대한 치료제 개발, 피부에 사용하는 화장품개발 등의 분야에 큰 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.
이러한 현실을 감안한다면 미생물을 이용해서 미생물을 제어하고, 결과적으로 인간의 질환을 치료하는 방법이야말로 가장 바람직한 대안이 될 수가 있다. 이러한 이유로 피부 미생물에 대한 좀 더 체계적이고 깊이 있는 연구가 필요하다고 본다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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