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문제 정의
- , 2004). 이에 본 연구에서는항균활성 세균을 분리하여 여러 인간 피부 상재균 및 오염 가능성이 있는 다양한 병원성 세균에 대하여 항균 및 항진균 활성을 평가하고, 항균물질 특성을 규명하고자 하였다.
제안 방법
- 선별한 균주는 (주)마크로젠에 의뢰하여 염기서열을 분석하였으며 National Center for Biotechnology Information (NCBI)에 등록된 세균 균주와 상동성을 비교하고, 형태학적 동정, 최적 생장온도, 영양원 조사 및 API kit (50CHB와 20E, Biomerieux)를 이용한 생리생화학적 검사를 통해서 균주를 동정하였다.
- 0, 4, 8, 24시간 간격으로 시료를 채취하여 0.22µm 여과막으로 여과하고 260 nm에서 흡광값을 측정하여 0시간 대비 DNA 유출 양상을 비교하였다(Lou et al., 2011).
- Chitinase : Colloidal chitin이 탄소원으로 첨가된 배지에 균주를 획선 배양한 후 집락 주변에 생긴 투명대를 토대로 chitinase 생산을 정성적으로 판단하였다. 이후 배양 상등액 1ml를 1% chitin이 첨가된 50 mM sodium phosphate buffer 1ml과 반응시키고 dinitrosalicylic acid method을 이용한 환원당 분석을 통해 정량하였다(Nagpure and Gupta, 2013).
- P. elgii DS381 균주의 단백질성 항균물질을 20 종류의 다양한 세균과 효모에 대하여 1 MIC로 처리하여 다양한 시간대별로 개체수 감소 양상을 조사하였다. DS381 균주의 단백질성 항균물질은 105~106 CFU/ml의 대상 세균을 24시간 내에 모두 사멸시켰다(Table 3).
- P. elgii DS381가 생산하는 계면활성제의 성질을 조사하고자 TLC를 수행하였다. DS381 균주의 배양 상등액의 ethylacetate 추출물을 이용하여 biosurfactant를 분획하고 plate에 1% ninhydrin, orcinol과 bromothymol blue를 처리하여 결과를 관찰하였을 때 DS381 균주는 1% ninhydrin과 bromothymol에 양성반응을 나타내어 lipopeptide의 구조를 가진 것으로 판단되었다.
- Protease : 균주를 LB 배지에서 배양하고 배양상등액을 회수하여 1% casein 용액과 함께 반응시키고(60°C, 15 min), 20% tricholoroacetic acid로 반응을 종료시켰다.
- 계면활성물질(lipopeptide) : 균주 배양 상등액의 계면활성 성질을 판단하기 위해 Petri dish에 증류수 50 ml를 담고, crudeoil 20 µl를 떨어뜨리고 상등액을 10 µl 가한 뒤 생긴 투명판을 측정하였다(Rodrigues et al., 2006).
- 균주가 생산하는 계면활성물질의 성질을 판단하기 위해 배양 상등액을 pH 2로 보정하고 ethyl acetate를 첨가하여 추출하였다. 이 시료를 thin layer chromatography (TLC) plate (silicagel 60, 70-230 mesh; Merk)에 점적하고, 이동상(chloroform/methanol/glacial acetic acid=65:15:2)으로 전개하고 이후 다양한 시약을 이용하여 물질의 성질을 판단하였다(Muruganand Rengaswamy, 2011).
- 균주의 세균 세포벽 용해활성은 다양한 세균의 배양액을 원심 분리하여 세포 성분을 수집하고, 121°C에서 15분간 멸균 후 NA 배지에 0.2%로 첨가하여 배지를 제작하고(Lim et al., 2001), 배지에 균주를 획선 배양 후 집락 주변의 투명대를 조사하였다.
- 단백질성 항균물질의 항균효과를 평가하기 위해 대상 미생물을 105~106 CFU/ml로 보정하였고 배양액에 1 MIC로 항균 물질을 처리하고 배양하였다.
- 대상 미생물이 도말된 NA 배지에 10 mm 직경의 well을 뚫고 배양 상등액을 100 µl 첨가하여 배양 후 저해 직경을 측정하였다(Ansari et al., 2012).
- , 2006). 배양 상등액의 표면장력은 표면 장력계(514-B2, Itoh Seisakuso)를 이용하여 측정하였다(Sharma and Saharan, 2014).
- 먼저 배양 상등액에 동량의 n-butanol을 첨가하여 추출하고, 소량으로 농축시키고 silica gel (Kieselgel 60) column에 2ml의 시료를 올리고 CHCl3/MeOH를 이동상으로 하여 시료를 분획하였다. 분획한 시료 중 항균활성을 나타낸 1개의 분획물을 강원대학교 공동실험실습관에 의뢰하여 Autoflex speed TOF/TOF(Bruker daltonics)를 이용하여 분자량을 분석하였다.
- 세균 또는 효모에 대한 항균활성 평가를 위해 분리세균 균주를 LB 배지에 배양하고 배양액을 원심 분리하였다. 대상 미생물이 도말된 NA 배지에 10 mm 직경의 well을 뚫고 배양 상등액을 100 µl 첨가하여 배양 후 저해 직경을 측정하였다(Ansari et al.
- 단백질성 항균물질의 항균효과를 평가하기 위해 대상 미생물을 105~106 CFU/ml로 보정하였고 배양액에 1 MIC로 항균 물질을 처리하고 배양하였다. 이후 0, 4, 8, 24시간 간격으로 채취하여 생균수를 계수하여 그 감소양상을 조사하였다(Al-Ani etal., 2015). 항균 물질 처리 후 세포질 물질이 유출되는 양상은 인산 완충용액으로 세척한 다양한 대상 미생물(107 CFU/ml) 세포에 1 MIC로 DS381 균주의 단백질성 항균물질을 첨가한 후 평가하였다.
- 춘천 지역 삼림에서 채취한 토양 시료를 Nutrient agar (NA), Luria-Bertani agar (LA) 배지에 배양하고 계대하여 세균 균주를 순수 분리한 후 다음의 미생물에 대한 항균 활성을 평가하였다: 화장품업계에서 흔히 조사하는 피부 상재균 6종(Candidaalbicans, B. subtilis, S. aureus, Aspergillus niger, Pseudomonasaeruginosa, E. coli), 경상대학교 병원체 자원은행[GyeongsangNational University Hospital Branch of the National CultureCollection for Pathgens (GNUH-NCCP)]으로부터 분양받은 균주(Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus, Staphylococcusepidermidis, Listeria monocytogenes, Klebsiella pneumoniae). 선별한 균주는 (주)마크로젠에 의뢰하여 염기서열을 분석하였으며 National Center for Biotechnology Information (NCBI)에 등록된 세균 균주와 상동성을 비교하고, 형태학적 동정, 최적 생장온도, 영양원 조사 및 API kit (50CHB와 20E, Biomerieux)를 이용한 생리생화학적 검사를 통해서 균주를 동정하였다.
- , 2015). 항균 물질 처리 후 세포질 물질이 유출되는 양상은 인산 완충용액으로 세척한 다양한 대상 미생물(107 CFU/ml) 세포에 1 MIC로 DS381 균주의 단백질성 항균물질을 첨가한 후 평가하였다. 0, 4, 8, 24시간 간격으로 시료를 채취하여 0.
이론/모형
- Lipopeptide 성질을 나타내는 물질을 silica gel columnchromatography (Naing et al., 2014)를 이용하여 분획하였다. 먼저 배양 상등액에 동량의 n-butanol을 첨가하여 추출하고, 소량으로 농축시키고 silica gel (Kieselgel 60) column에 2ml의 시료를 올리고 CHCl3/MeOH를 이동상으로 하여 시료를 분획하였다.
- Chitinase : Colloidal chitin이 탄소원으로 첨가된 배지에 균주를 획선 배양한 후 집락 주변에 생긴 투명대를 토대로 chitinase 생산을 정성적으로 판단하였다. 이후 배양 상등액 1ml를 1% chitin이 첨가된 50 mM sodium phosphate buffer 1ml과 반응시키고 dinitrosalicylic acid method을 이용한 환원당 분석을 통해 정량하였다(Nagpure and Gupta, 2013).
성능/효과
- DS381 균주는 그람양성 간균의 특성을 지니며, 30°C, 호기성 조건, sorbitol, D-manitol, glycerol의 탄소원, ammoniumsulfate, tryptone, malt extract 등의 질소원 조건 하에서 높은 생장과 활성을 나타내었다.
- 춘천 지역 토양 시료로부터 분리한 DS381 균주는 다양한 미생물과 대치배양 하였을 때 대부분의 대상 미생물을 제어하는 항균활성을 나타내었다. DS381 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열은 NCBI 등록 균주 중 Paenibacillus elgii SD17, Paenibacillus elgii NBRC 100335와 99%의 상동성을 나타내었다. DS381 균주는 그람양성 간균의 특성을 지니며, 30°C, 호기성 조건, sorbitol, D-manitol, glycerol의 탄소원, ammoniumsulfate, tryptone, malt extract 등의 질소원 조건 하에서 높은 생장과 활성을 나타내었다.
- elgii DS381가 생산하는 계면활성제의 성질을 조사하고자 TLC를 수행하였다. DS381 균주의 배양 상등액의 ethylacetate 추출물을 이용하여 biosurfactant를 분획하고 plate에 1% ninhydrin, orcinol과 bromothymol blue를 처리하여 결과를 관찰하였을 때 DS381 균주는 1% ninhydrin과 bromothymol에 양성반응을 나타내어 lipopeptide의 구조를 가진 것으로 판단되었다. 이는 유사한 추출, 전개 조건을 이용했던A.
- Oil spreading test를 통해서 P. elgii DS381 균주 배양 상등액의 계면활성을 조사하였을때 crude oil에 DS381 균주의 배양 상등액 첨가 시 oil이 퍼져 투명대가 형성되어 DS381 균주의 계면활성제 생산을 알 수 있었다. 퍼진 직경은 5.
- 다양한 대상 미생물에 DS381 균주의 단백질성 항균물질을 1 MIC로 처리하고 세포질 내 nucleotide가 유출되는 결과는 대부분이 time kill assay에서 대상 미생물이 사멸되는 양상과 일치하는 경향을 나타내었다(Table 4). 특히 C.
- 다양한 미생물을 대상으로 P. elgii DS381 배양 상등액의 항균활성을 조사하였을 때, DS381 균주는 다양한 그람 양성과 그람 음성 세균, 효모를 포함한 모든 대상 미생물에 항균활성을 나타내었다. 특히 M.
- 단백질성 항균물질 : 다양한 미생물의 생장을 억제하는 P.elgii DS381 균주의 단백질성 항균물질의 MIC를 조사하였을 때 C. albicans ATCC 10231를 포함한 6종의 피부 상재균에 0.078~0.625 mg/ml의 MIC를 나타내었으며, E. faecalis에 대해 0.156~1.250 mg/ml, K. pneumoniae, L. monocytogenes, S.epidermidis와 M. luteus에 대해 0.039~0.156 mg/ml로 제어에 효과적이었다. 진균인 A.
- DS381 균주의 단백질성 항균물질은 105~106 CFU/ml의 대상 세균을 24시간 내에 모두 사멸시켰다(Table 3). 대상 세균 중 B. subtilis, S. aureus, E.faecalis, L. monocytogenes, S. epidermidis 등의 그람 양성 세균의 개체수가 빠르게 감소되었으며 특히 B. subtilis, S. aureus, L. monocytogenes 2균주, S. epidermidis 2균주에 대해서 배양 4시간 후 개체수가 2 log CFU/ml로 감소되는 빠른 효과가 나타났다. 또한 E.
- Chitinase : Chitinase는 진균 세포벽 성분인 chitin을 분해하는 효소이며 이를 생산하는 미생물은 진균의 생장을 억제할 수 있다. 따라서 DS381 균주의 chitinase 생산으로 lipopeptide 항균 효과에 더하여 더욱 효율적으로 진균의 생장을 저해할 수 있을 것으로 생각된다. Chitinase 활성 정성 조사 배지에서 배양 7일차에 DS381 균주의 집락 주변에 투명환이 형성되었으며 이는 DS381 균주가 chitinase를 생산하여 colloidal chitin을 탄소원으로 이용할 수 있음을 나타낸다.
- , 2012). 또한 Bacillus amyloliquefaciens An6가 P. aeruginosa, K. pneumoniae, A. niger, E. faecalis에 활성을 나타내지 못한 결과(Ayed et al., 2015)와 비교하여 DS381의 항균활성이 우수하였다. 한편 같은 속의 Paenibacillus alvei AN5 균주가 S.
- epidermidis 2균주에 대해서 배양 4시간 후 개체수가 2 log CFU/ml로 감소되는 빠른 효과가 나타났다. 또한 E. faecalis 2균주, K. pneumoniae 1균주, L.monocytogenes 2균주 S. epidermidis 2균주는 배양 8시간 이내에 모두 사멸하였다. Zou 등(2012)이 보고한 유산균이 생산한 단백질성 항균물질인 nisin과 다양한 약용식물의 항균활성 성분인 allyl isothiocyanate를 각각 단독으로 S.
- , 2015)와 비교하여 DS381 균주의 단백질성 항균물질은 10배 더 많은 대상 미생물에 더낮은 수치의 MIC값을 나타내어 더 우수한 항균활성임을 알 수 있었다. 또한 이 연구에서 양성 대조군으로 사용했던 bacitracinzinc가 E. coli ATCC 25922와 K. pneumoniae ATCC 13883에 5 mg/ml 이상, S. aureus ATCC 25923, M. luteus ATCC 4698, E. faecalis ATCC 29212와 Bacillus cereus ATCC 11778에 0.156~0.625 mg/ml 그리고 A. niger I1 진균에 대해서 활성을 나타내지 못한 것을 감안하면 DS381 균주의 단백질성 항균물질이 항생물질을 대체할 정도라 할 수 있다.
- , 2014)와 달리 폭넓은 항균활성을 나타내었다. 또한 진균(A. niger)에 대해서도 23 mm 이상의 높은 항진균 활성을 나타내었다. 이러한 결과로 미루어 보아 DS381은 다양한 그람양성, 음성세균, 효모, 진균을 모두 저해하는 높은 항균활성을 나타낸다고 할 수 있다.
- 열-사멸 처리된 피부 상재균의 성분을 0.2% 포함하고 있는 한천 배지에서 DS381 균주의 세균 세포벽 용해능을 조사하였는데 B. subtilis, P. aeruginosa와 E. coli의 세포벽을 용해하는 것으로 나타났다. 이는 M.
- 312 mg/ml의 비교적 낮은 MIC를 나타내었다(Table 2). 이 결과로 DS381 균주가 생산하는 단백질성 항균물질이 항균 활성의 대부분을 차지하고 있음을 추측할 수 있다. 이는 Bacillus amyloliquefaciens An6가 생산하는 bacteriocin이 E.
- dieseloleiB-5 균주가 생산하는 lipopeptide 계면활성물질의 결과와 동일하였다(Qiao and Shao, 2013). 이 후 silica gel coumn chromatography를 통해 항균활성을 나타내는 lipopeptide를 분획하여 분자량을 측정 결과 고분자의 4592.269 m/z에서 높은 peak이 관찰되었다(Fig. 1). Paenibacillus sp.
- 이 결과로 DS381 균주가 생산하는 단백질성 항균물질이 항균 활성의 대부분을 차지하고 있음을 추측할 수 있다. 이는 Bacillus amyloliquefaciens An6가 생산하는 bacteriocin이 E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC25923, M. luteus ATCC 4698와 E. faecalis ATCC 29212에 대해 MIC가 각각 1.25~5 mg/ml이며, K. pneumoniae ATCC 13883, P. aeruginosa ATCC 27853과 A. niger I1에 활성을 나타내지 못한 결과(Ayed et al., 2015)와 비교하여 DS381 균주의 단백질성 항균물질은 10배 더 많은 대상 미생물에 더낮은 수치의 MIC값을 나타내어 더 우수한 항균활성임을 알 수 있었다. 또한 이 연구에서 양성 대조군으로 사용했던 bacitracinzinc가 E.
- niger)에 대해서도 23 mm 이상의 높은 항진균 활성을 나타내었다. 이러한 결과로 미루어 보아 DS381은 다양한 그람양성, 음성세균, 효모, 진균을 모두 저해하는 높은 항균활성을 나타낸다고 할 수 있다. 이는 같은 종의 Paenibacilus elgii BG6 균주가 다양한 그람양성과 그람음성 세균 및 진균에 항균활성을 나타내었던 보고(Wu et al.
- DS381 균주는 그람양성 간균의 특성을 지니며, 30°C, 호기성 조건, sorbitol, D-manitol, glycerol의 탄소원, ammoniumsulfate, tryptone, malt extract 등의 질소원 조건 하에서 높은 생장과 활성을 나타내었다. 이러한 결과와 API kit (50CHB, 20E)를 이용한 생리 생화학적 특성(결과 미제시)을 통해서 DS381 균주를 Paenibacillus elgii DS381로 명명하였다. 이 균주의 염기서열은 GenBank에 등록하였으며(Accession No.
- 이를 토대로 basalsalt 배지에서 chitinase 활성을 정량분석한 결과 DS381 균주는 배양 24시간 후 1.560 ± 0.002 U/ml로 chitinase를 생산하였다(Fig. 2).
- 다양한 대상 미생물에 DS381 균주의 단백질성 항균물질을 1 MIC로 처리하고 세포질 내 nucleotide가 유출되는 결과는 대부분이 time kill assay에서 대상 미생물이 사멸되는 양상과 일치하는 경향을 나타내었다(Table 4). 특히 C. albicans ATCC10231, E. faecalis, S. epidermidis의 경우 배양 4시간째 상당량의 nucleotide가 유출되었으며, 이를 제외한 균주에 대해서는 배양 8시간 또는 24시간째 높은 nucleotide 유출이 나타났다. 이는 Sigella dysenteriae와Streptococcus pneumoniae에 대한 time kill assay에서 균 개체가 배양 1~2시간째의 상당한 사멸 및 nucleotide 유출(Lou et al.
- elgii DS381 배양 상등액의 항균활성을 조사하였을 때, DS381 균주는 다양한 그람 양성과 그람 음성 세균, 효모를 포함한 모든 대상 미생물에 항균활성을 나타내었다. 특히 M. luteus GNUH-NCCP2922에 대하여 최대 26 mm 이상 직경의 생장 저해대를 나타내었으며, C. albicans, B. subtilis, S. aureus, E. coli, L. monocytogenes, S.epidermidis에 대하여 20 mm 이상의 억제직경을 나타내었다(Table 1). 이는 B.
후속연구
- Paenibacillus sp.가 생산하는 lipopeptide 성 항균물질은 항균, 항진균, 항암, 항바이러스 등 폭넓은 활성을 나타내며 polymyxins, octapeptins, polypeptins, iturins, surfactins, fengycins 등이 있는 것으로 보고되었는데(Cochraneand Vederas, 2016) DS381이 생성하는 lipopeptide의 종류에 대한 추가적인 분석이 필요하다.
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