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문제 정의
- 본 연구는 불용성 근위축에 대방풍탕이 미치는 효과를 알아보기 위하여, 흰 쥐의 발목관절을 2주간의 고정을 통해 불용성 근 위축의 상황을 유도하고 대방풍탕을 투여하였다. 체중변화, 비복근 근육의 무게, 근섬유 단면적 변화, 그리고 apoptosis와 연관된 TNF-α 의 변화를 관찰한 결과, 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 본 연구에서는 불용성 근위축(disuse muscle atrophy)에 대 방풍 탕이 미치는 영향을 확인하기 위하여 2주간 casting tape를 이용, 고정하여 유발된 흰 쥐의 불용성 근위축 모델에 매일 동일량의대방풍탕을 경구투여 한 후 근육 증량의 측정, 해부조직학적 변화관찰 및 면역조직화학염색, 근육의 변화 과정과 관련된 사이토카인들이 포함된 양상을 관찰하여 근위축에 대한 유의성 있는 억제 효과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.
제안 방법
- 사용하였다. 23∼24℃의 온도와 40∼60%의 습도 및 12시간 명/암이 자동으로 조절되는 시설을 갖춘 사육실에서 무균 처리된 물과 사료를 공급하여 사육하였다. 흰 쥐들은 연구 이전 사육실 환경에 1주 이상 적응하게 한 후 연구모델로 사용하였다.
- 연구에 사용된 대방풍탕의 구성 약재12) 는 (주)나눔제약(경북 영천, 대한민국)을 통해 구입하였다. 4첩 분량인 200 g을 증류수 2 L와 함께 round flask에 담은 이후 냉각기를 부착한 전탕기에서 2시간 가량 전탕하였다. 이후 얻어진 추출액을 여과지로 여과 후 감압농축, 동결건조시켰다.
- Casting tape는 일주일에 한 번씩 교체하였다. 오른쪽 발목관절에는 아무런 처치도 하지 않았다.
- 2 USA)를 이용하여 해당 근육의 단면적 (cross sectional area)을 측정하였다. 각각의 근육조직의 근섬유를 최소 30개 이상 관찰, 측정한 것을 기준으로 각 실험군의 근섬유의 평균 단면적을 평가하였다.
- 쥐의 비복근 불용성 근위축 모델을 사용하였다. 대방풍탕을 경구로 투여한 실험군과 생리식염수를 투여한 대조군으로 나누어 근육 증량의 측정, 해부조직학적 변화 및 면역조직화학염색을 통한 TNF-α의 발현 정도를 관찰하여 대방풍탕의 근위축에 미치는 영향을 평가하였다.
- 대방풍탕을 투여하는 실험군(Daebangfung-tang group, 이하 DBFT 혹은 DBFT group)과 동일조건에서 동일량의 생리식염수를 투여하는 대조군(Control group 혹은 Control)으로 무작위로 흰쥐들을 10마리씩 배정하여 분리하였다. 전체 실험기간 동안 물과 사료는 두 군 모두에서 자유롭게 섭취할 수 있게 환경을 조성하였다.
- 따라서 본 연구에서는 불용성 근위축에 대방풍탕이 미치는 영향을 확인하기 위하여 2주간 casting tape를 이용, 고정하여 유발된 흰 쥐의 비복근 불용성 근위축 모델을 사용하였다. 대방풍탕을 경구로 투여한 실험군과 생리식염수를 투여한 대조군으로 나누어 근육 증량의 측정, 해부조직학적 변화 및 면역조직화학염색을 통한 TNF-α의 발현 정도를 관찰하여 대방풍탕의 근위축에 미치는 영향을 평가하였다.
- 또한 TNF-α의 발현 정도를 정량화하기 위해 면역양성반응 세포 수를 측정, 수치화하였다. 대조군의 경우 오른쪽 비복근에서 13.
- 면역반응 결과의 정량화 및 평가를 위해 200배 현미경 관찰 하에서 동일한 면적 내의 면역 양성반응 세포 수의 측정값을 수치화하였다.
- 실험 개시 2주 후 각 군별 양쪽 근육 비복근의 무게를 측정하고 그 값을 체중 100 g당으로 계산하여 비교하였다. 그 결과, 대조군에서는 오른쪽 비복근의 경우 512.
- 마지막 날에는 부검 직전에 시행하였다. 실험 개시 2주 후 실험 동물들의 안락사 과정을 거쳤으며, 이후 부검을 통해 실험동물의 양측 비복근을 분리 채취하여 중량을 측정하였다. 해당 실험동물의 체중을 측정한 이후 체중 100 g당 근육 무게를 계산하여 평가하였다.
- 실험 개시로부터 2주 동안 실험군에는 매일 오전 정해진 시간에 대 방풍 탕 물 추출액을 1회씩, 대조군에는 동일량의 생리식염수를 동일한 방식으로 경구투여 하였다. 투여량은 70 kg 체중의 일반성인이 하루에 2첩을 복용할 때를 기준으로 정하여 이를 흰 쥐 체중당 복용분으로 환산하여 사용하였다.
- 투여량은 70 kg 체중의 일반성인이 하루에 2첩을 복용할 때를 기준으로 정하여 이를 흰 쥐 체중당 복용분으로 환산하여 사용하였다. 위 방법에 따라 계산하여흰 쥐 체중 100 g 당 26.7 mg을 1 ml 음용수에 녹여 경구 투여용 주사기를 이용하여 경구 투여하였다.
- 냉동 절편하였다. 이후 H&E 염색법을 시행, 현미경 관찰하에 사진촬영 하였다. 이후 영상분석용 Axiovision LE software (Carl Zeiss Vision, ver 4.
- 이후 H&E 염색법을 시행, 현미경 관찰하에 사진촬영 하였다. 이후 영상분석용 Axiovision LE software (Carl Zeiss Vision, ver 4.2 USA)를 이용하여 해당 근육의 단면적 (cross sectional area)을 측정하였다. 각각의 근육조직의 근섬유를 최소 30개 이상 관찰, 측정한 것을 기준으로 각 실험군의 근섬유의 평균 단면적을 평가하였다.
- 유도하고 대방풍탕을 투여하였다. 체중변화, 비복근 근육의 무게, 근섬유 단면적 변화, 그리고 apoptosis와 연관된 TNF-α 의 변화를 관찰한 결과, 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 방식으로 경구투여 하였다. 투여량은 70 kg 체중의 일반성인이 하루에 2첩을 복용할 때를 기준으로 정하여 이를 흰 쥐 체중당 복용분으로 환산하여 사용하였다. 위 방법에 따라 계산하여흰 쥐 체중 100 g 당 26.
- 실험 개시 2주 후 실험 동물들의 안락사 과정을 거쳤으며, 이후 부검을 통해 실험동물의 양측 비복근을 분리 채취하여 중량을 측정하였다. 해당 실험동물의 체중을 측정한 이후 체중 100 g당 근육 무게를 계산하여 평가하였다. 각 실험군 별 비복근 근위축의 정도는 아래 계산식13) 으로 측정하였다.
- 흰 쥐의 왼쪽 발목관절을 2주 간 신전시켜 casting tape (type 82002A, 3M, USA)를 이용하여 고정, 불용성 근위축을 유발하였다. Casting tape는 일주일에 한 번씩 교체하였다.
대상 데이터
- 10주령, 약 250 g 가량의 Sprague-Dawley 흰 쥐 수컷을 (주)샘 타코(경기도 오산, 대한민국)에서 구입하여 모델로 사용하였다. 23∼24℃의 온도와 40∼60%의 습도 및 12시간 명/암이 자동으로 조절되는 시설을 갖춘 사육실에서 무균 처리된 물과 사료를 공급하여 사육하였다.
- 연구에 사용된 대방풍탕은 ≪東醫寶鑑≫11)에 기재된 용량에 준하여 사용하였다(Table 1). 연구에 사용된 대방풍탕의 구성 약재12) 는 (주)나눔제약(경북 영천, 대한민국)을 통해 구입하였다.
- 사용하였다(Table 1). 연구에 사용된 대방풍탕의 구성 약재12) 는 (주)나눔제약(경북 영천, 대한민국)을 통해 구입하였다. 4첩 분량인 200 g을 증류수 2 L와 함께 round flask에 담은 이후 냉각기를 부착한 전탕기에서 2시간 가량 전탕하였다.
데이터처리
- SAS (version 9.1.3, SAS Institute Inc., U.S.A.)를 사용하여 측정된 모든 자료를 통계 분석하였으며, Student’s t-test를 통해 p< 0.05 및 p<0.01의 유의수준으로 검증하였다. 평균±표준편차 (mean±standard deviation)로 모든 값을 표기하였다.
- 01의 유의수준으로 검증하였다. 평균±표준편차 (mean±standard deviation)로 모든 값을 표기하였다.
이론/모형
- Primary antibody는 anti-TNF-α (ab7977, 1:200 dilution, rabbit polyclonal; ABcam)를 사용, PBS와 Triton X-100을 섞은 용액으로 희석하였다. 이를 4℃에서 12시간 반응시킨 후 조직을 PBS 로 씻어낸 다음, avidin-biotin immunoperoxidase의 방법(ABC Vectastain Kit)15)을 통해 각 조직을 1시간 씩 반응시켰다.
- 자유부유(free floating)법14)을 사용하여 염색을 시행하였다. Primary antibody는 anti-TNF-α (ab7977, 1:200 dilution, rabbit polyclonal; ABcam)를 사용, PBS와 Triton X-100을 섞은 용액으로 희석하였다.
성능/효과
- 1. 대방풍탕은 흰 쥐에서 왼쪽 비복근의 고정 이후 나타난 체중의 변화에 영향을 미치지 않았다.
- 2. 대방풍탕은 비복근 근육 무게의 감소를 유의성 있게 억제하였다.
- 2주 간의 고정 후 채취한 비복근을 8 μm 두께로 냉동 절편 한 후, H&E 염색과정을 거쳐 근육 단면을 관찰한 결과, 대조군에서 오른쪽에 비해 왼쪽 비복근 근섬유의 크기가 감소된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 근섬유 주변에 핵(nucleus)의 응집이 다수 확인되어 전형적인 근위축 소견이 관찰되었다.
- 2주 간의 실험 기간동안 두 군에서 체중 변화에 유의성 있는 차이는 보이지 않았다(Fig. 1). 또한 대조군과 실험군에서 모두 오른쪽 비복근에 비해 왼쪽 비복근 무게가 유의성 있는 감소를 보였다.
- 3. 대방풍탕은 비복근 근섬유의 단면적 감소를 유의성 있게 억제하였다.
- 4. 대방풍탕은 TNF-α의 발현을 유의성 있게 억제하였다.
- 각 실험군의 흰 쥐에 발목고정 후 2주간의 실험기간 동안 대조군과 실험군 모두에서 시간에 따라 체중이 증가하는 양상을 보였다. 실험 시작일 평균 체중값은 대조군에서 247.
- 값을 체중 100 g당으로 계산하여 비교하였다. 그 결과, 대조군에서는 오른쪽 비복근의 경우 512.7±25.1 mg/100 g로, 왼쪽 비복근의 경우 378.9±25.8 mg/100 g로 측정되었으며, 이는 유의성 있는 감소로 나타났다(p<0.01). 오른쪽에 대한 왼쪽의 근육 무게의 감소량은 26.
- 대조군과 실험군에서 채취한 왼쪽 비복근의 해부조직학적 변화를 관찰한 결과에서도 실험군이 대조군에 비해 상대적으로 근섬유 크기의 감소가 적고, 근섬유 주변 핵의 응집도 비교적 적게 나타나는 결과를 보였다(Fig. 3). 비복근 단면적의 변화를 측정, 비교한 결과에서는 대조군은 왼쪽 비복근이 오른쪽 비복근에 비해 유의성 있는 단면적 감소율을 보였으며, 실험군도 대조군에 비해 더 낮은, 유의성 있는 단면적의 감소를 보였다.
- 01). 대조군과 실험군을 비교한 결과, 오른쪽 비복근에서는 두 군 간 발현의 유의성 있는 차이는 나타나지 않았으나, 왼쪽 비복근에서는 실험군이 대조군에 비해 유의성 있는 차이가 나타났다(p<0.05) (Fig. 6).
- 대조군과 실험군의 근육 단면적의 감소를 비교해보면 실험군 이대 조 군에 비해 근위축의 정도에 유의성 있는 차이가 나타났다(p< 0.05) (Fig. 4).
- 1). 또한 대조군과 실험군에서 모두 오른쪽 비복근에 비해 왼쪽 비복근 무게가 유의성 있는 감소를 보였다. 또한 왼쪽 비복근의 무게는 실험군에서 대조군에 비해 근육 무게의 감소가 유의성 있게 억제되었음을 알 수 있었다(Fig.
- 또한 대조군과 실험군에서 모두 오른쪽 비복근에 비해 왼쪽 비복근 무게가 유의성 있는 감소를 보였다. 또한 왼쪽 비복근의 무게는 실험군에서 대조군에 비해 근육 무게의 감소가 유의성 있게 억제되었음을 알 수 있었다(Fig. 2). Shibaguchi 등13)의 방법에 따른 오른쪽에 대한 왼쪽 비복근 무게를 평가하기 위하여 근위축 비율을 계산 후 비교한 결과에서도 유의성 있는 차이를 보였다(Fig.
- 면역조직화학 염색을 통해 TNF-α의 발현을 관찰한 결과, 대조군의 경우 고정했던 왼쪽 비복근에서 오른쪽에 비해 TNF-α의 발현의 증가가 나타났다. 실험군에서도 마찬가지로 왼쪽 비복근에서 오른쪽에 비해 TNF-α의 발현이 증가된 결과를 보였으나 대조군에 비해 유의성 있는 차이가 나타났다(Fig.
- 3). 비복근 단면적의 변화를 측정, 비교한 결과에서는 대조군은 왼쪽 비복근이 오른쪽 비복근에 비해 유의성 있는 단면적 감소율을 보였으며, 실험군도 대조군에 비해 더 낮은, 유의성 있는 단면적의 감소를 보였다. 대조군과 실험군을 비교했을 때 실험군이 대조군에 비해 근육 단면적 감소를 유의성 있게 억제하였다고 사료된다(Fig.
- 수 있다. 실험 결과 상 체중의 변화에는 유의성 있는 차이가 없었으며, 왼쪽 비복근을 비교한 근위축 비율에서 실험군에 유의성 있는 억제 효과가 나타났다. 이로 보았을 때 비복근 무게의 감소는 체중으로 인한 것이 아니며, 대방풍탕이 비복근 무게의 감소를 유의성 있게 억제하였기 때문이라고 사료된다.
- 증가가 나타났다. 실험군에서도 마찬가지로 왼쪽 비복근에서 오른쪽에 비해 TNF-α의 발현이 증가된 결과를 보였으나 대조군에 비해 유의성 있는 차이가 나타났다(Fig. 5).
- 01). 실험군의 경우에서도 오른쪽 비복근에서 14.6±1.4/105 μm2, 왼쪽 비복근에서 19.6± 3.4/105 μm2로 관찰되어 대조군에서도 마찬가지로 유의성 있는 증가를 보였다(p<0.01). 대조군과 실험군을 비교한 결과, 오른쪽 비복근에서는 두 군 간 발현의 유의성 있는 차이는 나타나지 않았으나, 왼쪽 비복근에서는 실험군이 대조군에 비해 유의성 있는 차이가 나타났다(p<0.
- 위와 같이 본 연구에서 흰 쥐의 불용성 근위축 모델에 대 방풍 탕을 경구투여 한 후, 체중변화, 비복근 근육의 무게, 근섬유 단면적 변화, 그리고 apoptosis와 연관된 TNF-α의 변화를 관찰한 결과, 대방풍탕은 근위축에 대한 유의성 있는 억제 효과가 있는 것으로 사료된다.
- 채취한 비복근을 영상분석을 통해서 근섬유 단면적을 비교한 결과, 대조군의 오른쪽 비복근의 경우 4, 426.2±81.3 μm2로 측정된 반면, 고정했던 왼쪽 비복근의 경우 3, 630.7±99.1 μm2로 측정되어 유의성 있는 감소를 보였다(p<0.01). 오른쪽에 대한 왼쪽의 평균 근육 단면적 감소량은 18.
후속연구
- 근위축에 대한 다른 기전들이 지속적으로 보고되고 있는 실정에서, 대방풍탕의 근위축을 억제하는 다른 기전에 대한 추가적인 연구도 필요하다. 본 연구에서 논한 TNF-α 및 그 수용체와 관련된 기전, 그 이외 기전에 대해서도 대방풍탕의 구체적인 기전 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 본 연구에서 논한 TNF-α 및 그 수용체와 관련된 기전, 그 이외 기전에 대해서도 대방풍탕의 구체적인 기전 연구가 필요할 것으로 사료된다. 동물 실험에서 불용성 근위축은 apoptosis 및 단백질 가수분해의 증가, 근재생 감소의 두 가지가 주된 원인이며, 인체에서는 단백질 합성의 감소가 근위축의 주된 원인이라는 연구결과27)가 있어 대방풍탕의 단백질 합성에 관한 연구 또한 필요할 것으로 사료된다.
- 필요하다. 본 연구에서 논한 TNF-α 및 그 수용체와 관련된 기전, 그 이외 기전에 대해서도 대방풍탕의 구체적인 기전 연구가 필요할 것으로 사료된다. 동물 실험에서 불용성 근위축은 apoptosis 및 단백질 가수분해의 증가, 근재생 감소의 두 가지가 주된 원인이며, 인체에서는 단백질 합성의 감소가 근위축의 주된 원인이라는 연구결과27)가 있어 대방풍탕의 단백질 합성에 관한 연구 또한 필요할 것으로 사료된다.
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