[논문]칡소 동결 정액 생산을 위한 스티로폼상자와 액체질소 이용 방법

김성우; 고응규; 이재영; 김찬란; 황인설

doi:10.5762/kais.2020.21.4.490

[국내논문] 칡소 동결 정액 생산을 위한 스티로폼상자와 액체질소 이용 방법
The Use of Styrofoam Box for Chikso (Korean Brindled Cattle) Semen Cryopreservation with Liquid Nitrogen 원문보기

한국산학기술학회논문지 = Journal of the Korea Academia-Industrial cooperation Society, v.21 no.4, 2020년, pp.490 - 496

김성우 (농촌진흥청 국립축산과학원 가축유전자원센터) , 고응규 (농촌진흥청 국립축산과학원 가축유전자원센터) , 이재영 (농촌진흥청 국립축산과학원 가축유전자원센터) , 김찬란 (농촌진흥청 국립축산과학원 가축유전자원센터) , 황인설 (농촌진흥청 국립축산과학원 동물바이오공학과)

초록
AI-Helper

가축유전자원으로서 동결정액을 생산하는 가장 쉬운 방법은 스티로폼박스를 이용한 간이동결법으로 알려져 있다. 본 연구에서는 스티로폼 동결박스를 제작하여 가축의 동결정액 생산에 활용하는 방법을 검토하였으며 칡소 동결정액 생산을 최적화 할 수 있는 방법을 제시하고자 박스의 크기, 액체질소와 노출된 정액 스트로와 거리, 노출시간 및 생산량을 검토하였다. 2가지 동결박스를 비교하여 자료를 확보하였으며 내부 크기는 세로×가로×높이가 23.5×30.5×22.5 cm와 25.5×46.5×26.5 cm로 측정되었다. 액체질소를 5cm 높이로 채우고 액체질소 위 2, 5 및 8cm 높이에서 동결하여 융해 후 생존성을 조사하였다. 칡소 정액을 동결할 경우, 액체질소와의 노출시간은 모두 10분이 적절하였으며 25.5×46.5×26.5 cm 크기의 상자가 높은 생존율을 보여주었다(60.4±5.3% 대 67.2±3.1%). 동결 상자의 최적화 공간은 정자 동결에 가장 중요한 요소로 판단되며 1회 동결 시 최대 생산 가능한 칡소 동결정액은 60개 이상으로 증가시킬 수 있었다. 이러한 정보를 활용하면, 축종에 따라 동결 정액 생산량 결정하고 목적에 맞는 용기를 활용하여 효율적인 동결정액 생산이 가능할 것으로 판단된다.

Abstract ▼ AI-Helper

A styrofoam box is used as a simple and easy freezing method to preserve animal semen as a livestock genetic source. This study optimized the methods of freezing chikso brindled cattle semen. To test the freezing box, the motility of spermatozoa was compared between two box sizes (length×width×heigh) with the dimensions of 23.5×30.5×22.5 cm and 25.5×46.5×26.5 cm. The motility of thawed sperm from brindled Korean bulls was used to confirm the efficiency of the freezing boxes. The box having a larger inner space with larger horizontal and height measurements supported better motility after thawing (60.4±5.3% vs 67.2±3.1%) with 10 min of exposure time in liquid nitrogen vapor. The optimized freezing space is estimated to be an essential element for successful freezing results and the larger box could be used for production of more than 60 frozen semen straws. These properties are also helpful to optimize the cryopreservation techniques that would control the quality and quantity of semen straws according to different animal species.

주제어

표/그림 (6)

그림 Fig. 1. The image of freezing box with supporting rods
그림 Fig. 2. The freezing box containing 44 straws without liquid nitrogen
표 Table 1. The effect of exposure time freezing box size on the motility of Chickso spermatozoa with different exposure time on the vapour of liquid nitrogen and 5 cm distance.
표 Table 2. The effect of exposure distance between liquid nitrogen surface and straw holding place with 10 min exposure time.
표 Table 3. The effect of box height on the motility of frozen chikso semen.
표 Table 4. The effect of box size on the productivity of frozen semen straw.

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

또한, 동결정액 생산용 간이동결법을 최적화하기 위하여 적절한 냉각 속도와 공간을 제공할 수 있는 상자에 대한 자료가 적으며, 이를 비교 검토한 연구는 찾아보기 힘들다. 그러므로 본 연구는 시중에서 쉽게 구입할 수 있는 스티로폼 박스 2종을 선택하여 가축 동결유전자원의 생산에 이용 가능한 최적의 방법을 찾아내기 위하여 연구를 수행하였다.
정자 동결에 이용되는 용기는 흔히 스티로폼박스를 이용하 지만, 시중에는 다양한 크기의 박스가 판매되고 있으므로 적절한 상자를 선택하는데 어려움이 존재한다. 또한, 동결정액 생산용 간이동결법을 최적화하기 위하여 적절한 냉각 속도와 공간을 제공할 수 있는 상자에 대한 자료가 적으며, 이를 비교 검토한 연구는 찾아보기 힘들다. 그러므로 본 연구는 시중에서 쉽게 구입할 수 있는 스티로폼 박스 2종을 선택하여 가축 동결유전자원의 생산에 이용 가능한 최적의 방법을 찾아내기 위하여 연구를 수행하였다.
본 연구에서는 가축의 동결정액 생산을 위하여 손쉽게 수행할 수 있는 간이동결법을 최적화하기 위한 방법을 강구하였다. 가장 흔하게 구입할 수 있는 2종의 스티로폼 박스를 이용하여 칡소 동결정액 생산에 활용하여 동결정액 최적화 조건을 탐색하였다.

제안 방법

5 및 10 cm로 조절하였다. 10분간 질소 가스에 노출하고 액 체질소에 침지하였고 융해 후 정자의 운동성을 조사하였 다. 표 2에서 보는 바와 같이 희석 후 정자의 운동성은 모두 90% 이상이 관찰 되었으며, 액체 질소와 스트로 사이의 거리에 따라 서로 다른 정자 운동성을 관찰할 수 있었다.
1차 희석 후 5분 후에 Makler® counting chamber(Sefi-medical Instruments Ltd) 를 이용하여 정자의 농도를 측정하였으며 2차 희석을 동 일한 희석제를 투입하여 최종 정자농도가 60~80×106 개/ml 이 되도록 조절하였다.
1회 동결을 실시 할 때 사용되는 액체질소를 이용하여 얼마나 많은 양의 동결정액을 생산할 수 있는가를 추정 하기 위하여 스테인리스 지지대 위에 적재되는 동결 스 트로의 수를 조절하였다. 정액 스트로의 양을 5개, 15개, 30개의 정자를 23.
0 cm인 박스를 동결 상자를 제조하였다. Fig. 1에서 보는 바와 같이 동결 상자의 높이를 조절하기 위하여 스티로폼 열선 절단기를 활용하여 높이를 각각 20과 26.5 cm로 조절하여 동결상자의 공간 을 조절하였다. 또한 측면 양쪽에는 잘라낸 스티로폼의 일부를 공업용 실리콘 접착제를 이용하여 질소 위 공간을 마련하는 지지대를 제조하였다.
본 연구에서는 가축의 동결정액 생산을 위하여 손쉽게 수행할 수 있는 간이동결법을 최적화하기 위한 방법을 강구하였다. 가장 흔하게 구입할 수 있는 2종의 스티로폼 박스를 이용하여 칡소 동결정액 생산에 활용하여 동결정액 최적화 조건을 탐색하였다. 본 연구의 결과에 따르면, 칡소의 정액 동결은 기존에 밝혀진 바와 같이, 질소 표면과 노출되는 스트로의 거리가 5 cm와 10분간 노출시간을 유지하는 것이 우수한 결과를 얻을 수 있었다.
내부 공간의 크기(세로×가로×높이)가 23.5×30.5×22.5 cm와 25.5×46.5×30.0 cm인 박스를 동결 상자를 제조하였다.
5 cm의 동결상자를 이용하였다. 높이를 20, 25 및 35 cm 로 동결상자의 내부 높이(Height)를 조절하고, 5 cm의 질소 위 높이와 10분간 노출시간으로 동결 보존하였다. 표 3에서 보는 바와 같이 융해된 칡소의 정자 운동성은 20 cm에서는 41.
동결된 정자는 37℃에서 1분간 융해하였으며 10배 암시야 대물렌즈가 장착된 정립현미경(Nikon ECLIPSE Ci, Japan)으로 관찰하였다. 정자의 운동성을 유지하기 위하여 온도 조절장치가 장착된 현미경 재물대에 정자를 관찰하면서 디지털 정자자동분석기(computer assisted sperm analysis, ISAS, Poiser R&D, Spain)를 이용하 여 정자의 운동성을 분석하였다.
동결상자 내 액체질소의 양을 조절하거나 측면 스티리폼 높이를 조절하여 액체질소표면과 정액 스트로 사이의 거리를 조절하였다. 정액이 동결되는 위치는 액체질소 위 2.
동결상자에서 질소 표면과 정치되는 정액 스트로 사이의 높이를 5 cm로 고정하고 노출되는 시간을 5, 10, 15 및 20분으로 조절하여 동결을 실시하였으며, 융해 후 운동성을 관찰하였다.
동결상자의 내부 공간이 25.5×46.5×30.0 cm인 스티로폼박스를 스티로폼 절단기로 재단하여 높이를 20, 25 및 30.0 cm 로 조절하였다.
5 cm로 조절하여 동결상자의 공간 을 조절하였다. 또한 측면 양쪽에는 잘라낸 스티로폼의 일부를 공업용 실리콘 접착제를 이용하여 질소 위 공간을 마련하는 지지대를 제조하였다. 수정란 이식에 사용하는 플라스틱 커버(embryo transfer sheaths)내부에 2 mm 굵기의 직선 스테인리스 철사를 끼워 양 측면 지지 대 위에 올려 정액스트로가 질소 위에 유지되도록 고안 하였다.
선정된 2가지 크기의 동결상자를 이용하여 칡소의 신선정액을 액체질소 표면 위 10cm에서 동결을 실시하고 질소 증기에 노출되는 시간을 5, 10, 15 및 20분간 노출 하여 동결하였다. 표 1에서 보는 바와 같이 희석 후 운동 성은 모두 90% 이상의 수치를 보여주었으나 동결 후 융 해된 정자의 성적은 스티로폼상자가 큰 경우에 최대 67.
선정된 2가지 크기의 동결상자에서 생산 가능한 동결 정액 최대 생산량을 추정하기 위하여 정액 스트로의 개수에 따른 정자 생존율을 조사하였다. 표 3에서 보는 바 와 같이, 크기가 작은 동결상자의 경우, 5개와 15개 사이에 유의적 차이는 없었으나, 30개 이상의 스트로를 동결 할 경우, 52.
또한 측면 양쪽에는 잘라낸 스티로폼의 일부를 공업용 실리콘 접착제를 이용하여 질소 위 공간을 마련하는 지지대를 제조하였다. 수정란 이식에 사용하는 플라스틱 커버(embryo transfer sheaths)내부에 2 mm 굵기의 직선 스테인리스 철사를 끼워 양 측면 지지 대 위에 올려 정액스트로가 질소 위에 유지되도록 고안 하였다. 스트로 지지대는 열수축튜브를 잘라 철사에 끼운 후 열풍기로 가열하여 플라스틱 위에 요철부분을 나타나 도록 성형하였다.
정액 스트로의 양을 5개, 15개, 30개의 정자를 23.5×30.5×22.5 cm 크기 상자로 동결하고 융해 후 정자 운동성을 분석하였으며 25.5×46.5×30.0 cm 크기의 상자에는 15, 30 및 80개 정자 스트로를 정 치하여 동결한 후 융해 후 정자 운동성을 분석하였다.
동결상자 내 액체질소의 양을 조절하거나 측면 스티리폼 높이를 조절하여 액체질소표면과 정액 스트로 사이의 거리를 조절하였다. 정액이 동결되는 위치는 액체질소 위 2.5, 5, 7.5 및 10 cm로 조절하여 동결을 실시하였으며 융해 후 정자의 운동성을 관찰하였다.
정자의 운동성을 유지하기 위하여 온도 조절장치가 장착된 현미경 재물대에 정자를 관찰하면서 디지털 정자자동분석기(computer assisted sperm analysis, ISAS, Poiser R&D, Spain)를 이용하 여 정자의 운동성을 분석하였다.
0 cm 로 조절하였다. 질소 위 5cm 위치에 동결 스트로를 10분 간 노출하여 동결정액을 제조하였고, 융해 후 정자의 운동성을 관찰하였다.
칡소의 정액을 희석하고 실험실로 10분 이내로 이송 하였으며 30~32℃로 가온된 희석액과 동일한 온도로 조절하였으며 Triladyl 희석액을 정액에 점적하여 천천히 희석하였다. 희석액은 Triladyl 원액(Mini tube^® , Germany): 세포배양용물:난황의 부피 비율이 1:3:1로 구성되었으며 난황 1부피에 초순수 3부피를 천천히 투입하면서 교반을 실시하였으며 약 1시간 동안 상온에서 교반한 후 Triladyl 원액 1부피를 투입하여 약 30-40분간 더 교반 하여 희석액을 제조하였다.
포장된 칡소의 정액 스트로는 동일한 스티로폼 동결상 자에서 액체 질소 표면과 스트로의 거리를 2.5, 5, 7.5 및 10 cm로 조절하였다. 10분간 질소 가스에 노출하고 액 체질소에 침지하였고 융해 후 정자의 운동성을 조사하였 다.
5 cm 에서는 크기가 다른 두 동결상자에서 모두 차 이가 나타나지 않았다. 휘발된 질소 증기가 머무르는 공 간이 미치는 영향을 조사하기 위하여 냉각되는 공간을 박스의 높이를 조절하여 변화를 유도하였다. 이 때, 동결 정액의 운동성을 조사해 보면, 적절한 높이는 25~30 cm가 되어야 휘발된 질소가스의 열전달이 균일할 것으 로 판단되었다.
희석액은 Triladyl 원액(Mini tube® , Germany): 세포배양용물:난황의 부피 비율이 1:3:1로 구성되었으며 난황 1부피에 초순수 3부피를 천천히 투입하면서 교반을 실시하였으며 약 1시간 동안 상온에서 교반한 후 Triladyl 원액 1부피를 투입하여 약 30-40분간 더 교반 하여 희석액을 제조하였다.

대상 데이터

국립축산과학원 가축유전자원센터에서 유전자원으로 보유하고 있는 칡소 5두를 공시동물로 사용하였고 승가 를 유도하여 인공질로 정액 사출을 실시한 후 정자의 운동성이 우수한 시료를 이용하였다.
동결 상자의 공간이 칡소 동결 정자의 생존성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 바닥 내부의 넓이가 25.5×46.5 cm의 동결상자를 이용하였다.
시중에서 흔히 사용되고 있는 스티로폼 박스를 구입하였으며 내부 공간이 2가지 형태의 동결박스를 사용하였다. 내부 공간의 크기(세로×가로×높이)가 23.

데이터처리

융해된 정자의 운동성은 One-way ANOVA test를 실시하여 분석하였으며 분석된 자료의 평균 간 유의성은 Duncan의 다중검증법(Duncan’s multiple range test)로 분석을 실시하였다.

성능/효과

그러나 작은 크기 상자는 그림 1 및 2에서 보는 바와 같이 스트로 지지대를 받쳐주는 공간은 좌우 너비 가 약 3 cm로서 내부 공간을 차지하고 있어 동결정액 생산량이 더 낮은 것으로 추정되었다. 그러므로 균일한 성 적을 얻기 위하여 직사각형의 스티로폼 동결 상자가 동 결정액 생산에 보다 효율적일 것으로 판단되며 증발 질소의 냉각 효율성을 위하여 높이가 최소 25 cm 이상의 용기가 적절할 것으로 판단된다. 특히, 동결정액 생산량이 많은 소와 돼지의 경우, 큰 용적의 스티로폼 박스가 필요할 것으로 보이며 더 효율적일 것으로 판단된다.
5 cm 거리를 두고 동결해야 한다는 것을 알 수 있었다. 동결상자의 세로 길이에 대한 내부 높이가 중요하며 정액 스트로가 정치되는 위쪽 공 간이 어느 정도 충분해야 할 것으로 판단되었다. 또한 축종에 따라 적절한 시간과 동결상자의 깊이를 고려해야 하며, 동결 상자의 깊이는 최소 약 25 cm 이상이 확보되는 용기가 필요할 것으로 판단되며 이때 휘발하는 질소 증기가 머무르는 시간이 충분할 것으로 판단되었다.
또한 동결박스의 내부 공간에 따라 1회당 생산 가능한 최대 생산량을 조사하였을 때, 생산 수량은 차이가 있었으며 작은 형태 (23.5×30.5×22.5 cm)의 경우 최대 생산 가능한 스트 로 수량이 약 20개 정도 일 것으로 추정되었다.
동결상자의 세로 길이에 대한 내부 높이가 중요하며 정액 스트로가 정치되는 위쪽 공 간이 어느 정도 충분해야 할 것으로 판단되었다. 또한 축종에 따라 적절한 시간과 동결상자의 깊이를 고려해야 하며, 동결 상자의 깊이는 최소 약 25 cm 이상이 확보되는 용기가 필요할 것으로 판단되며 이때 휘발하는 질소 증기가 머무르는 시간이 충분할 것으로 판단되었다.
본 실험을 종합해 보면, 동결 정액을 생산에는 질소 용기가 큰 것이 효율적인 것으로 추정된다. 소 및 돼지의 경우 약 200~300여점이 생산해야 하므로 최소한 2개 이상의 대형 질소상자를 사용하여야 할 것으로 판단된다.
가장 흔하게 구입할 수 있는 2종의 스티로폼 박스를 이용하여 칡소 동결정액 생산에 활용하여 동결정액 최적화 조건을 탐색하였다. 본 연구의 결과에 따르면, 칡소의 정액 동결은 기존에 밝혀진 바와 같이, 질소 표면과 노출되는 스트로의 거리가 5 cm와 10분간 노출시간을 유지하는 것이 우수한 결과를 얻을 수 있었다. 이러한 결과는 이미 보고된 간이동결법을 활용한 성적과 크게 다르지 않았다.
작은 형태의 스티로폼 상자에서 액체 질소에 10 및 15분 처리하여 동결한 성적이 5분 및 20분 보다 우수하였으며 (56.9%, 52.8% 대 44.0%, 49.1%) 유의적 차이가 존재하였고 큰 상자에서 도 동일한 결과(67.4%, 65.8% 대 38.8%, 53.6%)를 얻을 수 있었다(p<0.05).
염소나 말의 경우, 50~80개 내외의 정액을 생산할 수 있으므로 1개의 박스로 동결이 가능하다고 판단된다. 정액을 동결하는 시간은 10~15 분이 적절하며 노출 높이는 액체질소 표면에서 5~7.5 cm 거리를 두고 동결해야 한다는 것을 알 수 있었다. 동결상자의 세로 길이에 대한 내부 높이가 중요하며 정액 스트로가 정치되는 위쪽 공 간이 어느 정도 충분해야 할 것으로 판단되었다.
표 1에서 보는 바와 같이 희석 후 운동 성은 모두 90% 이상의 수치를 보여주었으나 동결 후 융 해된 정자의 성적은 스티로폼상자가 큰 경우에 최대 67.4% 로 우수하였으며 유의적 차이가 존재하였다(p<0.05).
10분간 질소 가스에 노출하고 액 체질소에 침지하였고 융해 후 정자의 운동성을 조사하였 다. 표 2에서 보는 바와 같이 희석 후 정자의 운동성은 모두 90% 이상이 관찰 되었으며, 액체 질소와 스트로 사이의 거리에 따라 서로 다른 정자 운동성을 관찰할 수 있었다. 10분으로 노출시간을 고정할 때, 작은 스티로폼 상 자의 경우 5 cm에서 가장 높은 성적(6.

후속연구

동결정액을 생산하는데 제한적 사항으로서 스티로폼 박스가 크면 클수록 질소표면의 안정화에 걸리는 시간이 더 많이 필요하다. 박스 내부 공간 비율에 따라 증발하는 질소가스의 양과 공간에 머무르는 냉각 가스의 정치 시간도 서로 다를 것으로 추정되므로 원하는 축종과 동결정액 생산량에 따라 동결상자의 최적화가 필요할 것으 로 판단된다. 흥미롭게도, 크기가 25.
그러므로 균일한 성 적을 얻기 위하여 직사각형의 스티로폼 동결 상자가 동 결정액 생산에 보다 효율적일 것으로 판단되며 증발 질소의 냉각 효율성을 위하여 높이가 최소 25 cm 이상의 용기가 적절할 것으로 판단된다. 특히, 동결정액 생산량이 많은 소와 돼지의 경우, 큰 용적의 스티로폼 박스가 필요할 것으로 보이며 더 효율적일 것으로 판단된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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