[논문]황토노각플러스 추출물의 항산화, 항염 및 항미생물 효능

조준희; 이지안

doi:10.22156/cs4smb.2020.10.12.183

황토노각플러스 추출물의 항산화, 항염 및 항미생물 효능
Anti-oxidant, Anti-inflammation and Anti-microbial Effects of Hoangtonogak Plus Extracts 원문보기

융합정보논문지 = Journal of Convergence for Information Technology, v.10 no.12, 2020년, pp.183 - 190

조준희 (서경대학교 일반대학원 미용예술학과) , 이지안 (서경대학교 일반대학원 미용예술학과)

초록
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본 연구에서는 황토노각플러스 추출물의 생리활성 평가를 통해 화장품 원료로서의 가능성을 조사하였다. 황토노각 플러스 추출물에 대한 항산화 효과는 DPPH/ABTS 라디컬 소거능 활성 및 FRAP 분석, 세포 생존율은 MTT assay, 항염증 효과는 nitric oxide(NO) 생성억제 및 iNOS 단백질 발현 수준, 항균 효과는 총 3종 균주 Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis 및 Escherichia coli에 대한 한천 확산법을 측정하였다. 메탄올추출물(MN)과 열수추출물(WN)의 총폴리페놀 함량은 각각 2.92±0.01 mgGAE/g, 1.67±0.02 mgGAE/g로 나타났다. MN 추출물의 DPPH, ABTS 및 FRAP 값은 모든 농도에서 WN 추출물보다 높게 나타났다. RAW264.7 세포에 대한 두 추출물의 세포 독성은 관찰되지 않았다. 더욱이 1 mg/mL농도에서 MN과 WN 추출물의 NO 생성량은 11.69 μM과 20.4 μM로 측정되었으며, MN 추출물의 iNOS 단백질 발현 수준은 추출물 농도 의존적으로 억제되었다. 또한 MN 추출물은 S. epidermidis 균주에서만 항균효능을 보였다. 이러한 결과들로 황토노각플러스 추출물은 항산화, 항염, 항균효능을 지닌 천연물질 후보로써 가능성이 높다고 판단된다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study evaluated the possibility of Hoangtonogak Plus extracts as a bioactive ingredients for cosmetic products. Methanol(MN) and hot-water(WN) extracts were analysed by DPPH/ABTS radical scavenging activity, FRAP value for anti-oxidant activity, MTT assay for cell viability, inhibition of NO production and iNOS protein expression for anti-inflammatory effect, paper disc diffusion method for anti-microbial activity against Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis and Escherichia coli.. The contents of total polyphenol of MN and WN extracts were 2.92±0.01 mgGAE/g and 1.67±0.02 mgGAE/g, respectively. DPPH, ABTS and FRAP values of MN extracts were higher than WN at each concentration. No significant cytotoxicity was observed in RAW264.7 cells. Furthermore, NO production of MN and WN at 1 mg/mL concentration was measured as 11.69 μM, 20.4 μM, respectively. In addition, MN extracts showed anti-microbial effect only on S. epidermidis. Also MN extracts suppressed iNOS protein level in a concentration-dependent manner. According to our results, the MN extracts demonstrated its potential as a natural source of antioxidant with anti-microbial and anti-inflammatory properties.

주제어

표/그림 (8)

그림 Fig. 1. Effect of the concentration of various Hoangtonogak Plus extracts on DPPH radical scavenging. Results are the mean±S.D. from three independent experiments.
그림 Fig. 2. Effect of the concentration of various Hoangtonogak Plus extracts on ABTS radical scavenging. Results are the mean±S.D. from three independent experiments.
그림 Fig. 3. Ferric reducing antioxidant power assay of Hoangtonogak Plus extracts. Results are the mean±S.D. from three independent experiments.
그림 Fig. 4. Effect of Hoangtonogak Plus extracts on cytotoxicity in RAW264.7 cells. Results are the mean±S.D. from three independent experiments. ^*p<0.05 compared to the negative control.
그림 Fig. 5. Inhibitory effect on NO production of Hoangtonogak Plus extracts in LPS-stimulated RAW264.7 cells. Results are the mean±S.D. from three independent experiments. ^*p<0.05; ^**p<0.001 compared to the positive control.
표 Table 1. Total polyphenol contents of Hoangtonogak Plus extracts.
그림 Fig. 6. Inhibitory effect on the protein level of iNOS in RAW264.7 macrophage cells. Cells were stimulated with LPS in the presence of Hoangtonogak Plus extracts. The β-actin was used as an internal control.
표 Table 2. Anti-microbial activity of Hoangtonogak Plus extracts on several microorganisms.

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 건조된 황토노각플러스의 껍질과 과육을 실험소재로 하여 다양한 성분의 추출이 가능하고, 추출 후 분리 정제 가용이 하여 식물체의 생리활성 물질 추출에 유기용매로써 가장 많이 활용되고 있는 메탄올과 추출 시 유기용매와 달리 독성 잔존 가능성이 없는 정제수, 두 가지 용매를 사용하여 각 황토노각플러스 추출물의 항산화, 세포 안전성, 항염, 항균 등을 포함한 생리활성을 비교·평가하였다. 또한 이러한 활성을 나타내는 유효성분의 분리 및 규명을 통한 체계적이고, 효율적인 미용제품 개발 연구에 기초자료를 제시하고자 하였다.
본 연구에서 사용된 황토노각플러스는 국립종자원에 등록된 (등록번호 5288) 신품종을 이용하여 천연 화장품 원료로서 가능성을 조사하고자 메탄올 또는 정제수두 가지 용매에 따른 추출물의 항산화, 세포 안전성, 항염, 항균 활성을 평가하였다.

제안 방법

1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) radical 소거활성을 측정하기 위해 Blios[14]법을 변형하여 사용하였다. 각 시료 100 ㎕에 200 μM DPPH 100 ㎕를 넣고 vortex 한 후 15분 동안 반응시킨 다음 ELISA re ader(SpectraMax 340, Bioteck, Italy)를 이용하여 5 17 nm에서 흡광도를 측정하였다.
단백질을 정량화하여, 10% SDS-PAGE에 전기영동한 후, PVDF membrane으로 이송하여 5% BSA에 1시간 blocking하였다. 1차 항체로는 Rabbit 항-iNOS(San ta Cruz Biotechnology, CA, USA)와 Mouse 항-β-act in을 2차 항체로는 항-rabbit IgG, HRP-linked antibo dy(Cell Signaling Technology, MA, USA)와 항-mous e IgG, HRP-linked antibody를 사용한 후, Chemilum inescence detection kit (EZ-Western Lumi Pico, D oGen, Seoul, Korea)로 단백질을 검출하였다[19].
Nitric oxide (NO)는 RAW264.7 cell에서 nitric oxide synthase에 의해 발현되며 세포배양 상층액으로 분비된 NO의 생성 정도를 Griess 시약을 사용하여 NO₂^-의 형태로 측정하였다[18]. 세포를 96 well plate 에서 5X10⁴cells/well이 되도록 계수하여 배양한 후추출물을 농도별로 처리하고, 1시간 경과 후 LPS(100 ng/mL)를 처리하였고 24시간 배양하였다.
세포에 각 추출물을 농도별로 처리하여 2시간 동안 배양한 후 염증유도물질 LPS(100 ng/mL)를 처리하고 배양하였다. 단백질 발현 수준을 측정하기 위해 24시간 후, 배지를 제거하고 차가운 PBS로 세척한 다음 cell lys ates에 RIPA lysis buffer를 첨가하여 단백질을 추출하였다. 단백질을 정량화하여, 10% SDS-PAGE에 전기영동한 후, PVDF membrane으로 이송하여 5% BSA에 1시간 blocking하였다.
4에서 보는 바와 같이 추출물 최고농도 1 mg/mL에서 세포독성이 나타나지 않는 것을 확인하였다. 따라서 본 연구에서는 항염증 활성에서 추출물의 농도를 세포 독성이 나타나지 않은 유효농도 1 mg/mL 이하에서 진행하였다.
마우스 대식세포주, RAW264.7 cell을 이용하여 황토노각플러스 추출물의 세포 독성을 측정하였다. 추출물을 농도 0.
평판배지에 배양된 3가지 균주를 액체 배지 10 mL에서 18~24시간 배양하여 활성화시킨 후 멸균 된 면봉으로 균일하게 도말하였다. 멸균된 8 mm의 paper disc(Advactec, Japan)를 평판배지에 올려놓고 0.03 mL/disc가 되도록 각 추출물을 농도별로 흡수시켜 37℃에서 18~24시간 배양하여 disc 주위의 clear zone(mm, disc 포함)의 직경을 측정하였다.
kr) 품종보호권 등록번호 5288로 등록된 신품종으로 생리활성 물질 탐색에 관한 기초연구가 아직 보고된 바가 없다. 본 연구에서는 건조된 황토노각플러스의 껍질과 과육을 실험소재로 하여 다양한 성분의 추출이 가능하고, 추출 후 분리 정제 가용이 하여 식물체의 생리활성 물질 추출에 유기용매로써 가장 많이 활용되고 있는 메탄올과 추출 시 유기용매와 달리 독성 잔존 가능성이 없는 정제수, 두 가지 용매를 사용하여 각 황토노각플러스 추출물의 항산화, 세포 안전성, 항염, 항균 등을 포함한 생리활성을 비교·평가하였다. 또한 이러한 활성을 나타내는 유효성분의 분리 및 규명을 통한 체계적이고, 효율적인 미용제품 개발 연구에 기초자료를 제시하고자 하였다.
배지 제거 후, 형성된 formazan 결정을 100 ㎕의 DMSO 용액에 용해시켜 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성은 세포만 배양한 음성대조군의 100% 생존율을 기준으로 시료 처리군의 상대적인 세포 생존율을 계산하였다.
황토노각플러스 메탄올과 열수추출물에 의한 철 이온의 환원력 측정은 Benzie의 방법을 변형하여 수행하였다[16]. 표준물질 Iron(II) sulfate (FeSO₄, 7H₂O)를 농도별로 제조하여 표준검량곡선을 작성하였다.
황토노각플러스 추출물에 대한 NO 생성억제 정도를 알아보기 위해 NO 유도물질로 알려진 LPS를 처리하여 생성된 NO 양을 Griess 시약을 이용하여 측정하였다. 그 결과 Fig.
황토노각플러스 추출물은 0.1~1 mg/mL의 농도 범위에서 쥐의 대식세포주, RAW264.7 세포에서 세포 안전성이 확보되었으며 이러한 농도조건하에서 메탄올 또는 열수추출물의 항염 효능을 평가하기 위해 염증 매개 물질인 NO와 NO형성을 위한 효소 iNOS의 단백질 발현 수준을 확인하였다. 그 결과 메탄올추출물 농도 0.

대상 데이터

본 실험에 사용된 세포주는 마우스 대식세포, RAW2 64.7 cell(mouse leukaemic monocyte macrophag e cell line, KCLB 40071)을 사용하였으며, 세포배양을 위해 10% FBS(fetal bovine serum, Gibco., USA)와 1% penicillin-streptomycin을 포함하는 DMEM을 사용하였고, 세포는 37℃, 5%CO₂조건에서 배양하였다.
방법을 사용하였다. 즉, 14 mM 2, 2-azino-b is(3-ethylbenzthiazokine-6-sulfonic acid) 10 mL 와 4.90 mM K2S2O₈을 동량으로 혼합하여 암소에서 14~16시간 반응시키고, 최종적으로 대조군의 흡광도 값이 734 nm에서 약 0.7±0.02 를 나타내도록 ABTS solution을 제조하였다. 추출물 20 ㎕에 ABTS soluti on 180 ㎕를 첨가하여, 30분간 반응한 후, 734 nm에서 흡광도를 측정하였다.
표준물질 Iron(II) sulfate (FeSO₄, 7H₂O)를 농도별로 제조하여 표준검량곡선을 작성하였다. FRAP 용액(0.
각 시료 100 ㎕에 200 μM DPPH 100 ㎕를 넣고 vortex 한 후 15분 동안 반응시킨 다음 ELISA re ader(SpectraMax 340, Bioteck, Italy)를 이용하여 5 17 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 L-Asco rbic acid(Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) 를 사용하였다.
추출물 20 ㎕에 ABTS soluti on 180 ㎕를 첨가하여, 30분간 반응한 후, 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 L-Ascorbic a cid를 사용하였다.
항균력 검색 실험에 사용한 공시균주는 그람양성균 Staphylococcus epidermidis(KCTC No. 1917), St aphylococcus aureus(KCTC No. 1621) 및 그람음성균 Escherichia coli(KCTC No. 1039)을 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Ty pe Cultures, KCTC, Korea)에서 분양받아 37℃, nut rient broth(Difco, USA)에서 배양하였다.
황토노각플러스는 평택시 농업기술센터 (https://ag ri.pyeongtaek.go.kr)에서 제공받아 사용하였다. 껍질을 포함한 황토노각플러스 과육 건조중량 122 g에 6 0% 메탄올 5L를 첨가하여 60℃에서 15시간 또는 추출 전 건조중량 102 g에 5L의 정제수를 첨가한 80℃ 조건에서 15시간 추출하여 여과 후 농축하였다.

데이터처리

본 연구에 제시된 모든 결과는 평균±표준편차로 나타내었고, 평균값 사이에 대한 유의성은 student's t-t est를 이용하여 p-value값을 계산하여 통계적 유 의성 검증을 실시하였다. p<0.

이론/모형

ABTS radical 소거능을 측정하기 위해 Fellegrini 등[15]의 방법을 사용하였다. 즉, 14 mM 2, 2-azino-b is(3-ethylbenzthiazokine-6-sulfonic acid) 10 mL 와 4.
마우스 대식 세포주, RAW264.7 세포에 LPS로 염증반응을 유도한 다음 황토노각플러스 추출물을 처리한 후 iNOS의 단백질 발현 수준을 immunoblotting 분석법으로 측정하였다. 그 결과 Fig.
추출물에 대한 세포독성을 알아보기 위하여 MTT 방법을 이용하여 측정하였다. RAW 264.
폴리페놀 함량은 AOAC[17]의 방법을 변형한 Folin -Denis법으로 수행하였다. 각 추출물을 농도별로 제조한 시료 200 ㎕에 Folin-Denis reagent 200 ㎕를 첨가하여 상온에서 5분간 반응시킨 후, 최종농도 5%가 되도록 Na2CO₃를 넣어 암소에서 방치하였다.
항균활성 측정 방법으로는 paper disc diffusion 에 의하여 실시하였다. 평판배지에 배양된 3가지 균주를 액체 배지 10 mL에서 18~24시간 배양하여 활성화시킨 후 멸균 된 면봉으로 균일하게 도말하였다.

성능/효과

메탄올추출물은 2. 92±0.01 mgGAE/g, 열수추출물은 1.67±0.02 mgG AE/g으로 메탄올추출물의 폴리페놀함량이 열수 추출물에 비해 1.75배 높게 나타났다. 2012년 Abu-Reidah 는 오이 과육에는 약 73 종의 폴리페놀화합물이 함유되어 있다고 보고한 바 있다[23].
시료의 항산화 활성 평가에 유용하다[22]. Fig. 2에서 보는 바와 같이 ABTS 라디컬 소거능 결과 최고 농도 1 mg/mL에서 메탄올추출물의 ABTS 라디컬 소거 활성은 40.83±0.24%로 열수 추출물(26.71±0.14%)보다 1.53배 높게 나타났다. 또한 DPPH와 ABTS 결과에서 확인된 각 추출물 농도 의존적 라디컬 소거능 증가는 황토노각플러스 메탄올과 열수추출물 내 항산화 활성에 기여하는 유효 성분의 가능성을 시사한다.
aureus와S. epidermidis 또는 Gram 음성균 E. coli 를 대상으로 한천 평판 확산법을 수행한 결과 S. epidermidis 균주에 대해 항균 활성이 확인되었다.
황토노각플러스 추출물에 대한 NO 생성억제 정도를 알아보기 위해 NO 유도물질로 알려진 LPS를 처리하여 생성된 NO 양을 Griess 시약을 이용하여 측정하였다. 그 결과 Fig. 5에서 보는 바와 같이 LPS 처리한 후 NO 생성량은 대조군에 비해 약 3배 증가되었으며, 또한 모든 추출물에서 농도 의존적으로 NO 생성을 억제하였다. Agatemor et al.
7 세포에 LPS로 염증반응을 유도한 다음 황토노각플러스 추출물을 처리한 후 iNOS의 단백질 발현 수준을 immunoblotting 분석법으로 측정하였다. 그 결과 Fig. 6에서 보는 바와 같이 단독으로 LPS 처리 시 iNOS 단백질 발현이 현저히 증가하였으며, 황토노각플러스 메탄올추출물의 처리 농도에 의하여 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인하였다. 따라서 황토노각플러스의 피부에 대한 염증 완화 효과가 있을 가능성을 확인할 수 있다.
7 세포에서 세포 안전성이 확보되었으며 이러한 농도조건하에서 메탄올 또는 열수추출물의 항염 효능을 평가하기 위해 염증 매개 물질인 NO와 NO형성을 위한 효소 iNOS의 단백질 발현 수준을 확인하였다. 그 결과 메탄올추출물 농도 0.5 mg/mL부터 최고농도 1 mg/mL로 추출물 농도가 높아질수록 억제 효능이 증가하였으며, 이러한 NO 생성억제 결과는 immunoblotting을 통해 iNOS의 단백질 발현 수준이 메탄올추출물 처리에 따라 감소하는 것으로 확인되었다.
47%로 두 가지 용매 차이에 따른 수율은 큰 차이를 나타내지 않았다. 그러나 항산화 효능을 평가하기 위해 라디컬 소거 원리를 이용한 DPPH와 ABTS 분석 결과, 메탄올추출물 농도에 비례하여 라디컬 소거 활성이 증가하는 것을 확인하였다. 메탄올추출물은 열수추출물보다 철의 환원을 더욱 증가시켰으며, 총폴리페놀 함량 측정 결과 메탄올 추출물이 2.
53배 높게 나타났다. 또한 DPPH와 ABTS 결과에서 확인된 각 추출물 농도 의존적 라디컬 소거능 증가는 황토노각플러스 메탄올과 열수추출물 내 항산화 활성에 기여하는 유효 성분의 가능성을 시사한다.
그러나 항산화 효능을 평가하기 위해 라디컬 소거 원리를 이용한 DPPH와 ABTS 분석 결과, 메탄올추출물 농도에 비례하여 라디컬 소거 활성이 증가하는 것을 확인하였다. 메탄올추출물은 열수추출물보다 철의 환원을 더욱 증가시켰으며, 총폴리페놀 함량 측정 결과 메탄올 추출물이 2.92±0.01 mgGAE/g, 열수추출물이 1.67±0.02 mgGAE/g으로 메탄올추출물의 항산화 활성이 탁월함을 확인하였다.
2 mm로 항균효과가 증가하였다. 이러한 결과를 토대로 황토노각플러스 메탄올추출물 10 mg/mL 이상의 고농도 조건에서 피부 여드름균인 S. epidermi dis의 생장이 억제되는 것을 확인하였다.
7 cell을 이용하여 황토노각플러스 추출물의 세포 독성을 측정하였다. 추출물을 농도 0.1, 0.2, 0.5, 1 mg/mL로 24시간 처리한 결과 Fig. 4에서 보는 바와 같이 추출물 최고농도 1 mg/mL에서 세포독성이 나타나지 않는 것을 확인하였다. 따라서 본 연구에서는 항염증 활성에서 추출물의 농도를 세포 독성이 나타나지 않은 유효농도 1 mg/mL 이하에서 진행하였다.
표준물질 ferrous sulfate(FeSO₄)의 농도로 표기된 황토노각각 추출물의 환원력은 Fig. 3에서 보는 바와 같이 메탄올 또는 열수추출물 처리농도(0.1, 0. 2, 0.5, 1 mg/mL)에 비례하여 증가하였으며, 메탄올 추출물이 열수추출물보다 높게 나타나 황토노각플러스메탄올추출은 우수한 항산화 물질로 사료된다.
황토노각의 메탄올추출물(MN) 또는 열수추출물(WN)의 라디컬 소거능을 측정한 결과 양성대조군인 L-Ascorbic acid (1 mg/mL)의 경우 94.7±0.10%로 나타났으며, Fig. 1에서 보는 바와 같이 각 추출물 농도 증가에 따른라디컬 소거능이 증가함을 확인하였다. 2002년 Kaur 는 아시아의 여러 채소를 대상으로 용매에 따른 항산화 활성 결과를 보고하였으며[21], 그 중 오이는 본 연구에서 사용된 메탄올과 같은 유기 용매인 에탄올을 사용하여 항산화능이 34.

후속연구

0%)보다 높다고 보고하였다. DPPH 라디컬 소거능 결과를 통해 황토노각플러스 추출물이 천연식물자원 유래 항산화제 후보물질로서 가능성이 높을 것으로 기대된다.
2012년 Abu-Reidah 는 오이 과육에는 약 73 종의 폴리페놀화합물이 함유되어 있다고 보고한 바 있다[23]. 따라서 껍질과 과육을 혼합한 황토노각플러스 메탄올과 열수추출물의 항산화 유효성분 분석연구 또한 필요할 것으로 사료된다.
본 연구에서는 화장품 원료로서 가능한 천연 소재발굴 탐색을 위해 기존 천연식물 자원으로부터 개발된 신품종을 탐색 소재로 한 화장품 원료 연구를 통해 황토노각플러스의 메탄올과 열수추출물의 항산화, 항균, 항염 활성에 기여하는 유효성분을 이용한 화장품, 의료, 식품 등 다양한 산업분야에서 활용 가치가 높을 것으로 판단된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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