[논문]종류별 감초의 라디칼 소거능 및 H2O2에 의한 C6 glial 세포의 산화적 스트레스 개선 효과

김지현; 조민지; 박찬흠; 조은주; 김현영

doi:10.3839/jabc.2020.043

종류별 감초의 라디칼 소거능 및 H2O2에 의한 C6 glial 세포의 산화적 스트레스 개선 효과
Free radical scavenging activity and protective effect of three glycyrrhiza varieties against hydrogen peroxide-induced oxidative stress in C6 glial cells 원문보기

Journal of applied biological chemistry, v.63 no.4, 2020년, pp.327 - 334

김지현 (Department of Food Science, Gyeongnam National University of Science and Technology) , 조민지 (Department of Food Science and Nutrition, Pusan National University) , 박찬흠 (Department of Herbal Crop Research, NIHHS, RDA) , 조은주 (Department of Food Science and Nutrition, Pusan National University) , 김현영 (Department of Food Science, Gyeongnam National University of Science and Technology)

초록
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산화적 스트레스는 신경퇴행성 질환 발병의 원인으로 알려져 있다. 본 연구는 대표적인 감초 종류인 Glycyrrhiza glabra, G. uralensis와 신품종 감초인 신원감(SW)의 in vitro free radical 소거능을 통한 항산화 활성과 H2O2 유도 산화적 스트레스에 대한 C6 glial cell 보호 효능을 확인하고자 하였다. In vitro assay에서 G. uralensis, G. glabra, SW 추출물은 농도유의적으로 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, ·OH, O2- radical 소거능이 증가하여 in vitro 항산화 활성을 확인하였다. 또한, SW 추출물은 G. uralensis, G. glabra 추출물에 비해 총 페놀 및 플라보노이드 함량이 가장 우수하였다. H2O2로 산화적 스트레스를 유도한 C6 glial cell에 3가지 감초 추출물을 각각 처리 시, 농도의존적으로 세포 생존율이 증가와 reactive oxygen species 소거능이 증가하여 3가지 감초 추출물의 산화적 손상에 대한 신경교세포 보호 효과를 확인하였다. 특히, SW 추출물은 G. uralensis, G. glabra 추출물에 비해 우수하게 C6 glial cell 보호 효과를 나타내었다. 또한, 3가지 감초 추출물의 신경교세포 보호 메커니즘을 확인하기 위해, 염증 관련 단백질 발현을 측정하였다. 3가지 감초 추출물은 H2O2만을 처리한 control군에 비해 inducible nitric oxide synthase 및 cyclooxygenase-2 발현 감소를 통해 염증반응 조절을 통한 신경교세포 보호 작용기전을 확인하였다. 본 연구는 G. uralensis, G. glabra, SW 등 3가지 감초 추출물이 산화적 손상이 유도된 신경교세포 보호에 유용한 소재로써의 가능성이 있는 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Oxidative stress is common cause of neurodegenerative diseases. The purpose of this study is to investigate the in vitro free radical scavenging activity and protective effect of three Glycyrrhiza species including Glycyrrhiza uralensis, G. glabra, and a new variety of Glycyrrihza (Shinwongam, SW) against hydrogen peroxide-induced oxidative stress in C6 glial cells. In vitro assays, radical scavenging activities of G. uralensis, G. glabra, and SW against 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, ·OH, and O2- increased as concentration-dependent manner. In addition, the SW was found to contain the highest polyphenol and flavonoid contents. The treatment of H2O2 to C6 glial cell induced oxidative stress, whereas G. uralensis, G. glabra, and SW significantly increased the cell viability as dose-dependent manner. In particular, SW exerted stronger protective effect on H2O2-induced cytotoxicity, than G. uralensis and G. glabra. Furthermore, reactive oxygen species (ROS) formation was significantly elevated by H2O2 in C6 glial cells. However, treatments of G. uralensis, G. glabra, and SW decreased ROS formation. In addition, SW decreased pro-inflammatory related protein expression levels such as inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2, compared to H2O2-treated control group. These results indicated that G. uralensis and G. glavra, especially SW, may be useful for preventing from oxidative stress-induced neuronal damage by regulating inflammatory reaction.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

뿐만 아니라, 감초의 대표적인 활성성분인 glycyrrhizic acid, liquiritin, liquiritigenine LPS로 신경염증이 유도된 신경교세포에서 iNOS, COX-2와 같은 염증매개인자 발현을 감소시켰으며, TNF-α, IL-1β, IL-6 등의 염증성 cytokines 발현을 유의적으로감소시켜 신경교세포 보호 효과를 나타냄이 보고되었다[46]. 따라서 본 연구에서 3가지 감초 추출물의 항산화 및 신경교세포보호 효과는 이들 활성성분의 생리활성 작용으로 인한 것으로사료된다.
그러나 종류별 감초추출물의 in vitro 라디칼 소거능과 산화적 스트레스로부터 신경교세포 보호 효과에 대한 연구는 전무한 실정이다. 따라서 본연구에서는 G. uralensis, G. glabra 및 SW 추출물의 radical 소거능 측정을 통해 in vitro 항산화 활성을 확인하고, H₂O₂로산화적 스트레스로가 유도된 C₆ glial cell에서 3가지 감초 추출물의 신경교세포의 보호 효과를 알아보고자 하였다.
관한 연구가 활발히 이루어지고 있다[1, 5, 6]. 본 연구에서는 G. uralensis, G. glabra, SW 등 3가지 감초 추출물의 in vitro에서 DPPH, ·OH, O₂⁻ radical 소거능과 H₂O₂로 산화적 손상이 유도된 신경교세포 보호 효과를 확인하고자 하였다. DPPH assay는 시료 중의 항산화 물질과 반응 시 DPPH radical이 환원되면서 변화하는 색깔의 차이를 이용한 측정법으로, 시료의 항산화 활성을 평가하는데 주로 이용된다[21].

가설 설정

05) between different samples within same concentration, while Means with the different capital letters are significantly different between different concentration within same sam- ple by Duncan’s multiple range test. _·IC⁵⁰ is the concentration in μg/mL required to inhibit the formation of OH radical by 50%. GU, Glycyr- rhiza uralensis; GB, Glycyrrhiza glabra; SW, Shinwongam

제안 방법

배양 후 세포가 부착되면 농도별로 희석한 시료를(5, 10, 25, 50, 100μg/mL) 각 well에 처리하고 1시간 재배양한 후 산화적 스트레스 유발을 위한 H₂O₂(400μM)를 첨가하여 24시간 배양하였다. 24시간 뒤, 80μM DCF-DA용액을 각 well에 처리하고 30분간 배양 후 FLUO star OPTIMA (BMG labtech, Ortenberg, Germany) excitation-480nm, emission-535nm로 측정하였다 [20].
24시간 배양 후, 각 well의 배지를 제거하고 5mg/mL의 MTT solution 200μL씩 첨가하여 37^oC에서 4시간동안 재배양하였다. 4시간 뒤, MTT solution을 제거하고 생성된 formazan 결정을 빛이 차단된 상태에서 DMSO에 30분간녹여 540nm에서 흡광도를 측정하였다[19].
각각의 시료를 10 또는 13% sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리한 후, nitrocellulose membrane에 transfer하였다. 5% skim milk로 상온에서 50분 동안 blocking 하여 1차 항체인 inducible nitric oxide synthase (iNOS, Calbiochem, Darmstedt, Germany)와 cyclooxygenase-2 (COX-2, Merk, Darmstedt, Germany)를 PBS-T와 각각 1:2000, 1:1000의 비율로 희석하여 4^oC에서 overnight 반응시킨 후, 2차 항체인 anti-rabbit IgG HRP-linked antibody (Cell signaling, Bevely, MA, USA)를 1:1000의 비율로 PBS-T와 희석하여 상온에서 1시간 반응시켰다. 이후 PBS- T로 15분간 4번 세척 후 enhanced chemiluminescence solution과 반응시킨 후 Chemi imaging system Q6 (Davinch- Chemi^TM, Seoul, Korea)을 이용하여 단백질 발현을 확인하였다.
각 농도별 추출물(5, 10, 25, 50, 100μg/mL)을 EtOH에 녹인 시료 100μL와 60μM DPPH용액 100μL를 96-well plate에 혼합하여 30분간 실온에서 반응시킨 후, 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조군과 시료를 첨가한 실험군을 비교하여 DPPH radical 소거능을 다음의 계산식을 이용하여 백분율(%)로 나타내었다[14].
각 농도별 추출물(5, 10, 25, 50, 100μg/mL)을 증류수에 녹인시료 500μL와 0.1M tris-Hcl (pH 7.4) 100μL, 0.1mM PMS 200μL, 0.5mM NBT 200μL, 0.5mM NADH 500 μL를 혼합하여 실온에서 10분간 반응시킨 뒤, 560nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조군과 시료를 첨가한 실험군을 비교하여 O₂⁻radical 소거능을 다음의 계산식을이용하여 백분율(%)로 나타내었다[16].
glabra 및 SW의 추출물은 농촌진흥청 국립원예특작과학원 인삼특작부(Eumseong, Korea)에서 제공받아 사용하였으며, voucher specimene 한국약용자원표본관에 보관되어 있다. 건조시킨 G. uralensis, G. glabra 및 SWe 50% ethanol을 이용하여 상온에서 72시간 동안 침지 후, 여과 및 감압 농축하여 시료를 조제하였다. 각 추출물은 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma Co.
배양 후 세포가 부착되면 농도별로 희석한 시료를(5, 10, 25, 50, 100μg/mL) 각 well에 처리하고 1시간 재배양한 후 산화적 스트레스 유발을 위한 H₂O₂(400μM)를 첨가하여 24시간 배양하였다. 24시간 뒤, 80μM DCF-DA용액을 각 well에 처리하고 30분간 배양 후 FLUO star OPTIMA (BMG labtech, Ortenberg, Germany) excitation-480nm, emission-535nm로 측정하였다 [20].
특히 O₂⁻는 ·OH, H₂O₂ 등의 반응성이 강한 radical 생성에 관여하여 조직을 손상시킨다[24]. 본 연구에서 PMS/NADH로 유발된 O₂⁻ radical에 의해 NBT가 자주색의 formazan으로 환원되는 원리를 이용한 O₂⁻ radical assay를 통해 3가지 감초 추출물의 O₂⁻ radical 소거능을 측정하였다[16]. G.
따라서 뇌 손상으로부터 신경교세포를 보호 할 수 있는 여러 천연물 소재 개발에 관한 연구가 활발히 이루어지고 있다[35, 36]. 본 연구에서 ROS의 일종인 H₂O₂로 산화적 손상이 유도된 C₆ glial cell을 이용하여 G. uralensis, G. glabra, SW 등 3가지 감초 추출물의 신경교세포보호 효과를 확인하였다. 세포 생존율을 측정한 결과(Fig.
COX-1은 체내 대부분의 조직에 항상 발현되어 있어 혈소판 형성, 위장 세포 보호 및 신장 기능 유지 등의 생리적인 역할을 통해 체내 항상성을 조절하는 기능을 하며, COX- 2는 손상시 발현된 염증성 cytokine에 유도되어 염증 관련 PGs 인 prostglandin E2 를 과량 생성시켜 염증반응을 악화시킨다 [42, 43]. 본 연구에서는 H₂O₂로 산화적 손상을 유도한 C₆ glial cell에 50μg/mL의 농도로 G. uralensis, G. glabra 및 SW 추출물을 처리하여 염증성 단백질인 iNOS 및 COX-2 단백질 발현을 확인하였다(Fig. 3). Normal군에 비해 H₂O₂만을 처리한 control군에서 iNOS, COX-2와 같은 염증성 인자 발현이 유의적으로 증가하여 염증성 자극이 유발되었음을 확인하였다.
세포가 80% 이상 confluence 상태가 되면 96-well plate에 3×10⁴ cells/well 농도로 seeding하여 37^oC에서 24시간 동안 배양한 다음 세포가 잘 부착되면, 농도별로 희석한 시료를(5, 10, 25, 50, 100μg/mL) 각 well에 처리하여 1시간 배양한 뒤, 산화적 스트레스를 유발하기 위해 H₂O₂(400μM)를 처리하여 24 시간 배양하였다. 24시간 배양 후, 각 well의 배지를 제거하고 5mg/mL의 MTT solution 200μL씩 첨가하여 37^oC에서 4시간동안 재배양하였다.
배양된 세포는 1-2일에 한번 배양액을 바꾸어 주면서 배양하였다. 세포가 T75-flask에 80% 이상 분화되었을 때, PBS (pH 7.4)으로 세포를 세척 한 후, 0.05% trypsin과 0.02% EDTA 혼합액으로 부착된 세포를 분리하고 원심 분리를 통해 집적시킨 후, 피펫을 이용하여 세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
시료를 첨가하지 않은 대조군과 시료를 첨가한 실험군을 비교하여 DPPH radical 소거능을 다음의 계산식을 이용하여 백분율(%)로 나타내었다[14].
5mM NADH 500 μL를 혼합하여 실온에서 10분간 반응시킨 뒤, 560nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조군과 시료를 첨가한 실험군을 비교하여 O₂⁻radical 소거능을 다음의 계산식을이용하여 백분율(%)로 나타내었다[16].
0% TBA solution 1mL를 첨가하여 20분 동안 100^oC로 가열하고 실온에서 냉각시킨 뒤 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조군과 시료를 첨가한 실험군을 비교하여 ·OH radical 소거능을 다음의 계산식을 이용하여 백분율(%) 로나타내었다[15].
염증 관련 단백질 발현을 확인하기 위하여 배양한 세포에 RIPA buffer를 첨가하여 4^oC, 12,000rpm에서 30분간 원심분리하고 상층액의 단백질을 분리하였다. 단백질 정량은 Bio-Rad protein assay kit (Hercules, CA, USA)를 이용하였고, sample buffer (Bio-Rad)와 혼합하여 sample을 제조하여 실험에 사용하였다.
5% skim milk로 상온에서 50분 동안 blocking 하여 1차 항체인 inducible nitric oxide synthase (iNOS, Calbiochem, Darmstedt, Germany)와 cyclooxygenase-2 (COX-2, Merk, Darmstedt, Germany)를 PBS-T와 각각 1:2000, 1:1000의 비율로 희석하여 4^oC에서 overnight 반응시킨 후, 2차 항체인 anti-rabbit IgG HRP-linked antibody (Cell signaling, Bevely, MA, USA)를 1:1000의 비율로 PBS-T와 희석하여 상온에서 1시간 반응시켰다. 이후 PBS- T로 15분간 4번 세척 후 enhanced chemiluminescence solution과 반응시킨 후 Chemi imaging system Q6 (Davinch- Chemi^TM, Seoul, Korea)을 이용하여 단백질 발현을 확인하였다.
10% AlCl₃ 30μL를 더하여 6분간 방치 후, 4% NaOH 400μL를더하여 15분간 방치 후, 510nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정한 결과는 quercetin을 시료와 동일한 방법으로 분석하여 작성한 표준 검량선으로부터 시료의 총 플라보노이드 함량을 산출하였다.

대상 데이터

2016년 재배된 G. uralensis, G. glabra 및 SW의 추출물은 농촌진흥청 국립원예특작과학원 인삼특작부(Eumseong, Korea)에서 제공받아 사용하였으며, voucher specimene 한국약용자원표본관에 보관되어 있다. 건조시킨 G.
(Toronto, Canada)사에서 구매하여 실험에 사용하였다. C₆ glial celle 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 구입하여 실험에 사용하였다. 세포 배양을 위해 사용된 Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) 배지, fetal bovine serum (FBS)과 100 units/mL penicillin streptomycin, trypsin EDTA 용액은 Welgene (Daegu, Korea)에서 구입하여사용하였다.
C₆ glial celle 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 구입하여 실험에 사용하였다. 세포 배양을 위해 사용된 Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) 배지, fetal bovine serum (FBS)과 100 units/mL penicillin streptomycin, trypsin EDTA 용액은 Welgene (Daegu, Korea)에서 구입하여사용하였다. 세포의 산화적 스트레스를 유도하기 위해 사용한 H₂O₂는 Junsei (Tokyo, Japan)사에서 구입하여 사용하였고, cell viability를 측정하기 위해 사용한 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)- 2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 및 ROS 생성량 측정을위한 2'-7'-dichlorofluorescin diacetate (DCF-DA)는 Sigma사에서구입하여 사용하였다.
세포 배양을 위해 사용된 Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) 배지, fetal bovine serum (FBS)과 100 units/mL penicillin streptomycin, trypsin EDTA 용액은 Welgene (Daegu, Korea)에서 구입하여사용하였다. 세포의 산화적 스트레스를 유도하기 위해 사용한 H₂O₂는 Junsei (Tokyo, Japan)사에서 구입하여 사용하였고, cell viability를 측정하기 위해 사용한 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)- 2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 및 ROS 생성량 측정을위한 2'-7'-dichlorofluorescin diacetate (DCF-DA)는 Sigma사에서구입하여 사용하였다.
실험에 사용한 C₆ glial celle 100units/mL penicillin-streptomycin 과 10% FBS가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37^oC, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다. 배양된 세포는 1-2일에 한번 배양액을 바꾸어 주면서 배양하였다.

데이터처리

Values are means±SD (n=6). Means with the different letters are sig- nificantly different (p <0.05) by Duncan’s multiple range test. GU, Gly- cyrrhiza uralensis; GB, Glycyrrhiza glabra; SW, Shinwongam
Values are means±SD (n=6). Means with the different letters are sig- nificantly different (p <0.05) by Duncan’s multiple range test. GU, Gly- cyrrhiza uralensis; GB, Glycyrrhiza glabra; SW, Shinwongam
Values are means±SD (n=6). Means with the different small letters are significantly different _A(_-p_E<0.05) between different samples within same concentration, while Means with the different capital letters are significantly different between different concentration within same sam- ple by Duncan’s multiple range test. IC⁵⁰ is the concentration in ìg/mL required to inhibit the formation of DPPH radical by 50%.
대조군과 각 시료들로부터 얻은 실험 결과들은 평균±표준편차로 나타내었고, 결과 분석은 SPSS 20 (IBM, Armonk, NY, USA) 프로그램을 이용하여 각 실험 결과로부터 ANOVA (analysis of variance)를 구한 후 Duncan’s multiple test (p<0.05) 를 이용하여 각 군의 평균 간의 유의성 검정을 하여 결과를 분석하였다.

이론/모형

이는 H₂O₂, ONOO⁻ 등에 의해 생성되며, 지질, DNA 등 생체 분자를 손상시켜 신경퇴행성질환을 포함한 다양한 질환 발병에 관여하는 것으로 보고되었다[25]. In vitro ·OH radical assay는 H₂O₂와 O₂⁻로부터 ·OH radical이형성되는 Fenton 반응의 원리를 이용하여 측정하였다[26]. 본연구에서 G.
·OH radical 소거능 측정은 Fenton 반응을 따랐으며, 0.2M phosphate buffer saline (PBS)에 농도별 시료 용액 1400μL에 10mM FeSO₄·7H₂O-EDTA 200μL, 10mM 2-deoxyribose solution 200μL, 10mM H₂O₂ 200μL를 첨가하였다. 그 후 4 시간 동안 37^oC에서 배양 한 뒤, 2.
총 페놀 함량은 Folin과 Denis의 방법에 따라 측정하였다[17]. 증류수에 녹인 시료 200μL와 증류수 1800μL를 혼합 후, phenol reagent 200μL를 혼합하여 실온에서 5분간 방치한 뒤, 2mL의 7% Na₂CO₃를 혼합하여 실온에서 90분간 방치시킨 후, 750nm 에서 흡광도를 측정하였다.
총 플라보노이드 함량은 Moreno 등의 방법에 따라 측정하였다 [18]. 증류수에 녹인 시료 100μL와 증류수 400μL를 혼합 한 뒤, 5% NaNO₂ 용액 30μL를 가하여 6분간 방치하였다.

성능/효과

본 연구에서 PMS/NADH로 유발된 O₂⁻ radical에 의해 NBT가 자주색의 formazan으로 환원되는 원리를 이용한 O₂⁻ radical assay를 통해 3가지 감초 추출물의 O₂⁻ radical 소거능을 측정하였다[16]. G. uralensis, G. glabra, SW 등 3가지 감초 추출물의 농도별O₂⁻ radical 소거능을 측정한 결과(Table 3), 3가지 감초 추출물은 농도의존적으로 O₂⁻ radical 소거능이 증가함을 확인하였다. 특히 G.
3). Normal군에 비해 H₂O₂만을 처리한 control군에서 iNOS, COX-2와 같은 염증성 인자 발현이 유의적으로 증가하여 염증성 자극이 유발되었음을 확인하였다. 그러나, 감초 3종 추출물을 각각 처리한 군의 경우 control군에 비해 유의적으로 낮은 단백질 발현을 나타내어 염증반응에 대한보호 효과를 확인하였다.
glabra, SW 등 3가지 감초 추출물의 DPPH 소거 능을 측정한 결과(Table 1), 각 추출물은 농도가 증가할수록 유의적으로 DPPH 소거능이 증가함을 알 수 있었다. SW 추출물의 DPPH 소거능 측정 결과, 5, 10, 25, 50, 100μg/mL의 농도에서 각각 5.00, 12.09, 24.45, 39.78, 62.69%의 수치를 나타내었으며, 특히 100μg/mL 농도에서 60% 이상의 DPPH 소거 능을 나타내었다. 특히 모든 농도에서 SW 추출물이 G.
Normal군에 비해 H₂O₂만을 처리한 control군에서 iNOS, COX-2와 같은 염증성 인자 발현이 유의적으로 증가하여 염증성 자극이 유발되었음을 확인하였다. 그러나, 감초 3종 추출물을 각각 처리한 군의 경우 control군에 비해 유의적으로 낮은 단백질 발현을 나타내어 염증반응에 대한보호 효과를 확인하였다. iNOS 단백질의 경우 SW 처리군이 가장 낮은 발현을 나타내었으며, COX-2 단백질은 G.
uralensis 처리군이 가장 낮은 단백질 발현을 나타내었다. 따라서 G. uralensis, G. glabra 및 SW 등 3가지 감초 추출물은 iNOS 및 COX-2 단백질 발현 조절을 통한 염증반응 개선 효과가 있음을확인하였다. 이전 연구에 의하면, G.
또한 H₂O₂로 산화적 스트레스로가 유도된 C₆ glial cell에서 SW 추출물은 다른 감초 추출물에 비해 ROS 생성 억제 및 iNOS 단백질 발현 억제 효과가 높은 것을 알 수 있었다. 따라서 G. uralensis, G. glabra 및 SW 등 감초 추출물은 산화적 스트레스에 대한 신경교세포 보호 효과가 있는 것으로 사료된다.
glabra,SW 등 3가지 감초 추출물의 총 페놀 및 총 플라보노이드 함량을 측정한 결과(Table 4), 3가지 감초 추출물 중 SW 추출물은 가장 높은 페놀 및 플라보노이드 함량을 갖는 것을 확인하였다. 따라서, 다른 감초 추출물에 비해 SW 추출물은 총 페놀및 플라보노이드 함량이 높아 항산화 활성이 우수한 것으로 사료된다.
glabra 및 SW 등 3가지 감초추출물의 DPPH, ·OH, O₂⁻ radical 소거능 측정을 통해 in vitro 항산화 활성을 확인하였고, 특히 SW 추출물은 다른 추출물에 비해 페놀 및 플라보노이드 함량이 높음을 확인하였다. 또한 H₂O₂로 산화적 스트레스로가 유도된 C₆ glial cell에서 SW 추출물은 다른 감초 추출물에 비해 ROS 생성 억제 및 iNOS 단백질 발현 억제 효과가 높은 것을 알 수 있었다. 따라서 G.
glabra, SW 등 3가지 감초 추출물을 처리하였을 때, control군보다 유의적으로 낮은 ROS 생성량을 나타내었고, 특히 50과 100μg/mL의 농도에서 SW추출물은 다른 감초 추출물에 비해 유의적으로 가장 낮은 ROS 생성량을 확인하였다. 또한, 본 연구에서 5, 100μg/mL의 농도에서 G. uralensis 추출물은 G. glabra 추출물에 비해 유의적으로 ROS 생성량이 낮았다. 이는 이전 연구에서 G.
02%의 낮은 세포 생존율을 나타내어 H₂O₂에 의한 C₆ glial cell의 산화적 손상을 확인하였다. 반면 G. uralensis, G. glabra, SW 등 3가지 감초 추출물을 처리하였을 경우, control군에 비해 높은 세포 생존율 수치를 확인하였으며 특히 100μg/mL 에서 50% 이상의 세포 생존율 수치를 나타내어 산화적 손상에 대한 보호 효과가 있음을 알 수 있었다. 특히 50과 100μg/mL의 농도에서 SW 추출물은 다른 감초 추출물에 비해 각각 66.
2), 60분 기준으로 H₂O₂만을 처리한 control군의 경우 normal군보다 유의적으로 높은 ROS 생성량을 나타내어 세포의 산화적 손상이 유발되었음을 확인하였다. 반면 G. uralensis, G. glabra, SW 등 3가지 감초 추출물을 처리하였을 때, control군보다 유의적으로 낮은 ROS 생성량을 나타내었고, 특히 50과 100μg/mL의 농도에서 SW추출물은 다른 감초 추출물에 비해 유의적으로 가장 낮은 ROS 생성량을 확인하였다. 또한, 본 연구에서 5, 100μg/mL의 농도에서 G.
ROS는 체내 정상적인 산화과정 중에 생성되나, 과량 생성 시높은 반응성을 갖는 성질로 인해 세포의 지질, 단백질, 핵산 등의 손상을 일으킨다[3]. 본 연구에서 DCF-DA assay를 이용하여 산화적 손상이 유도된 C₆ glial cell의 ROS 생성량을 측정한 결과(Fig. 2), 60분 기준으로 H₂O₂만을 처리한 control군의 경우 normal군보다 유의적으로 높은 ROS 생성량을 나타내어 세포의 산화적 손상이 유발되었음을 확인하였다. 반면 G.
본 연구에서 G. uralensis, G. glabra 및 SW 등 3가지 감초추출물의 DPPH, ·OH, O₂⁻ radical 소거능 측정을 통해 in vitro 항산화 활성을 확인하였고, 특히 SW 추출물은 다른 추출물에 비해 페놀 및 플라보노이드 함량이 높음을 확인하였다. 또한 H₂O₂로 산화적 스트레스로가 유도된 C₆ glial cell에서 SW 추출물은 다른 감초 추출물에 비해 ROS 생성 억제 및 iNOS 단백질 발현 억제 효과가 높은 것을 알 수 있었다.
DPPH assay는 시료 중의 항산화 물질과 반응 시 DPPH radical이 환원되면서 변화하는 색깔의 차이를 이용한 측정법으로, 시료의 항산화 활성을 평가하는데 주로 이용된다[21]. 본 연구에서 G. uralensis, G. glabra, SW 등 3가지 감초 추출물의 DPPH 소거 능을 측정한 결과(Table 1), 각 추출물은 농도가 증가할수록 유의적으로 DPPH 소거능이 증가함을 알 수 있었다. SW 추출물의 DPPH 소거능 측정 결과, 5, 10, 25, 50, 100μg/mL의 농도에서 각각 5.
특히 페놀 및 플라보노이드는 우수한 항산화 활성을 나타내며, 이들 함량이 높을수록 항산화 활성이 높다고 알려져 있다[29, 30]. 본 연구에서 G. uralensis, G. glabra,SW 등 3가지 감초 추출물의 총 페놀 및 총 플라보노이드 함량을 측정한 결과(Table 4), 3가지 감초 추출물 중 SW 추출물은 가장 높은 페놀 및 플라보노이드 함량을 갖는 것을 확인하였다. 따라서, 다른 감초 추출물에 비해 SW 추출물은 총 페놀및 플라보노이드 함량이 높아 항산화 활성이 우수한 것으로 사료된다.
5, 5, 10, 20μg/mL의 농도로 처리 시 유의적으로 세포 생존율이 증가되어 감초 추출물의 신경교세포 보호 효과가 보고된 바 있다[37, 38]. 본 연구에서도 이와 유사하게 감초 추출물의 처리 시 세포 생존율이 증가하여 신경교세포 보호효과를 확인하였고, 특히 다른 감초 추출물에 비해 SW 추출물의 세포 생존율 개선 효과가 가장 우수함을 알 수 있었다. ROS는 체내 정상적인 산화과정 중에 생성되나, 과량 생성 시높은 반응성을 갖는 성질로 인해 세포의 지질, 단백질, 핵산 등의 손상을 일으킨다[3].
In vitro ·OH radical assay는 H₂O₂와 O₂⁻로부터 ·OH radical이형성되는 Fenton 반응의 원리를 이용하여 측정하였다[26]. 본연구에서 G. uralensis, G. glabra, SW 등 3가지 감초 추출물의 ^·OH radical 소거능을 측정한 결과(Table 2), 모든 감초 추출물이 농도 의존적으로 ·OH radical 소거 효과가 증가하는 것을 확인하였다. 특히 25μg/mL의 농도에서 70% 이상의 소거효과를 나타내어 3가지 감초 추출물의 우수한 ^·OH radical 소거 효과를 확인할 수 있었다.
특히 25μg/mL의 농도에서 70% 이상의 소거효과를 나타내어 3가지 감초 추출물의 우수한 ^·OH radical 소거 효과를 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라 G. uralensis, G. glabra, SW 추출물은 50μg/mL의 농도에서 각각 83.15, 81.81, 81.08%의 수치를 나타내었고, 100μg/mL의 농도에서는 각각 83.32, 84.07, 84.34%의 수치를 나타내어 50 및 100μg/mL의 농도에서 3가지 감초 추출물의 ·OH radical 소거능이 비슷한 활성을 나타냄을 알 수 있었다.
uralensis 추출물의 ROS 소거능이 더욱 우수하게 나타나 본 결과와 유사함을 알 수 있었다[39]. 뿐만 아니라 본 연구에서 SW 추출물은 G. uralensis 및 G. glabra 추출물에 비해 유의적으로 낮은 ROS 생성량을 나타내어, ROS 생성 억제 효과를 통한 항산화 활성을 확인할 수 있었다. 감초의 대표적인 활성성분은 glycyrrhizic acid, liquiritin, liquiritigenin, isoliquiritigenin, licochalcone A 등의 생리활성성분을 함유하는 것으로 보고되었다[7, 12-13].
glabra, SW 등 3가지 감초 추출물의 신경교세포보호 효과를 확인하였다. 세포 생존율을 측정한 결과(Fig. 1), 아무것도 처리하지 않은 normal군을 100%라고 하였을 때, H₂O₂만을 처리한 control군의 경우 36.02%의 낮은 세포 생존율을 나타내어 H₂O₂에 의한 C₆ glial cell의 산화적 손상을 확인하였다. 반면 G.
glabra추출물의 DPPH radical 소거능이 우수함이 보고되어, 본 결과와 유사한 결과를 나타냄을 알 수 있었다[22]. 열처리한 감초 추출물의 DPPH 소거능 측정을 통해 IC₅₀을 계산한 결과 0.86-2.36 g/L의 수치를 나타내어, 본 연구에서 사용한 SW 추출물은 열처리한 감초 추출물에 비해 높은 DPPH radical 소거능을 나타냄을 알 수 있었다[23].
증류수에 녹인 시료 200μL와 증류수 1800μL를 혼합 후, phenol reagent 200μL를 혼합하여 실온에서 5분간 방치한 뒤, 2mL의 7% Na₂CO₃를 혼합하여 실온에서 90분간 방치시킨 후, 750nm 에서 흡광도를 측정하였다. 측정한 결과는 garlic acid를 시료와동일한 방법으로 분석하여 작성한 표준 검량선으로부터 시료의총 페놀 함량을 산출하였다.
glabra, SW 등 3가지 감초 추출물의 ^·OH radical 소거능을 측정한 결과(Table 2), 모든 감초 추출물이 농도 의존적으로 ·OH radical 소거 효과가 증가하는 것을 확인하였다. 특히 25μg/mL의 농도에서 70% 이상의 소거효과를 나타내어 3가지 감초 추출물의 우수한 ^·OH radical 소거 효과를 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라 G.
glabra, SW 등 3가지 감초 추출물을 처리하였을 경우, control군에 비해 높은 세포 생존율 수치를 확인하였으며 특히 100μg/mL 에서 50% 이상의 세포 생존율 수치를 나타내어 산화적 손상에 대한 보호 효과가 있음을 알 수 있었다. 특히 50과 100μg/mL의 농도에서 SW 추출물은 다른 감초 추출물에 비해 각각 66.56, 76.42%의 수치를 나타내어 우수한 세포 생존율 개선 효과를 확인하였다. H₂O₂로 산화적 손상이 유도된 신경교세포에서 감초추출물을 5, 10, 25μg/ mL 농도의 처리 시 유의적으로 세포 생존율이 증가하였으며, lipopolysaccharide (LPS)로 신경염증이 유도된 신경교세포에서 감초추출물을 2.
69%의 수치를 나타내었으며, 특히 100μg/mL 농도에서 60% 이상의 DPPH 소거 능을 나타내었다. 특히 모든 농도에서 SW 추출물이 G. uralensis, G. glabra추출물에 비해 유의적으로 높은 DPPH radical 소거능을 나타내었으며, 가장 낮은 IC₅₀ 수치를 나타내어 SW 추출물의 우수한 DPPH radical 소거능을 확인하였다. 이전 연구에 의하면, 종류별 감초 추출물의 100μg/mL 농도에서 DPPH radical 소거능을 측정한 결과, G.

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