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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 대전지역의 3차 병원에 입원한 요로감염 환자의 소변에서 분리된 E. coli를 대상으로, 다좌위 서열 형별 분석(multilocus sequence typing, MLST)를 통한 역학조사 를 실시하여 각 ST를 비교 분석하고, 이를 토대로 항균제 내성과 의 관계를 조사하고자 한다.
제안 방법
- 7 U Taq DNA polymerase (Solgent) 및 증류수를 혼합하여 총 부피 25 μL의 반응용액을 만들었다. 7개의 housekeeping gene (adk, fumC, gyrB, icd, mdh, purA, recA)은 Gene Amp PCR System 9600 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA)을 사용하여 95℃에서 2분간 반응시킨 후, 95℃에서 1분, annealing temperature에서 1분, 72℃에서 2분으로 30회 증폭 반응시 키고, 72℃에서 5분간 연장 반응시켰다(Table 1). 각각의 PCR 반응산물은 ethidium bromide가 포함된 1% agarose gel에서 30분간 전기영동하여 밴드를 확인하였다.
- 증폭산물은 PCR purification kit (Solgent)로 분리한 후, BigDye Terminator cycle sequencing kit (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)와 ABI PRISM 3730xl DNA analyzer (PE Applied Biosystems)를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 7개의 housekeeping gene에 대한 각각의 염기서열 분석 결과는 MLST database에 입력하여 allelic number와 sequence type (ST)를 확인하였다.
- 정도관리를 위해 Escherichia coli ATCC 25922와 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853을 동시에 시험하여 허용범위 내에 있는지 확인하였다. Magiorakos 등[10]의 연구를 참고하여, aminoglycosides, 광범위 cephalosporins, carbapenems 및 fluoroquinolones 계열 등의 항균제 중 3계열 이상의 항균 제에 내성을 보인 균주를 다제내성 E. coli로 하였다.
- 7개의 housekeeping gene (adk, fumC, gyrB, icd, mdh, purA, recA)은 Gene Amp PCR System 9600 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA)을 사용하여 95℃에서 2분간 반응시킨 후, 95℃에서 1분, annealing temperature에서 1분, 72℃에서 2분으로 30회 증폭 반응시 키고, 72℃에서 5분간 연장 반응시켰다(Table 1). 각각의 PCR 반응산물은 ethidium bromide가 포함된 1% agarose gel에서 30분간 전기영동하여 밴드를 확인하였다. 증폭산물은 PCR purification kit (Solgent)로 분리한 후, BigDye Terminator cycle sequencing kit (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)와 ABI PRISM 3730xl DNA analyzer (PE Applied Biosystems)를 이용하여 염기서열을 분석하였다.
- uk/mlst/dbs/Ecoli)에 설명된 방법에 따라 분석하였다. 먼저, 대상 균주는 brain heart infusion broth (Difco)에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후, Genomic DNA Prep Kit (Solgent, Daejeon, Korea)을 사용하여 DNA 를 추출하였다. DNA 추출액(5 μL), 10x Taq buffer (2.
- 이 중 동일 환자에서 반복 분리된 균주는 수집대 상에서 제외하였다. 임상검체로부터 분리 배양된 균주는 Vitek 2 automated ID system (BioMerieux, Hazelwood, MO, USA)을 이용하여 동정하였다.
- Clinical and laboratory standards institute (CLSI) 지침 에 따라, amikacin, gentamicin, ceftazidime, cefotaxime, cefepime, aztreonam, ertapenem, imipenem, ciprofloxacin, piperacillin-tazobactam 및 trimethoprimsulfamethoxazole (BioMerieux)에 대한 항균제 감수성 검사는 Mueller-Hinton 한천배지(Difco, Cockeysville, MD, USA)를 사용하여 E-test법으로 확인하였다[16]. 정도관리를 위해 Escherichia coli ATCC 25922와 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853을 동시에 시험하여 허용범위 내에 있는지 확인하였다. Magiorakos 등[10]의 연구를 참고하여, aminoglycosides, 광범위 cephalosporins, carbapenems 및 fluoroquinolones 계열 등의 항균제 중 3계열 이상의 항균 제에 내성을 보인 균주를 다제내성 E.
- 각각의 PCR 반응산물은 ethidium bromide가 포함된 1% agarose gel에서 30분간 전기영동하여 밴드를 확인하였다. 증폭산물은 PCR purification kit (Solgent)로 분리한 후, BigDye Terminator cycle sequencing kit (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)와 ABI PRISM 3730xl DNA analyzer (PE Applied Biosystems)를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 7개의 housekeeping gene에 대한 각각의 염기서열 분석 결과는 MLST database에 입력하여 allelic number와 sequence type (ST)를 확인하였다.
대상 데이터
- 본 연구는 2017년 3월부터 12월까지 대전지역의 3차 병원에 입원한 요로감염 환자의 소변에서 분리된 E. coli 84 균주를 대상으로 하였다. 이 중 동일 환자에서 반복 분리된 균주는 수집대 상에서 제외하였다.
- coli는 많은 항균제에 대한 내성이 점차 증가하고 있어, 최근 요로감염의 항균제 치료에 큰 우려를 낳고 있는 실정이다. 본 연구는 2017년 3월부터 12월까지, 대전지역의 요로감 염 환자에서 분리된 요로병인성 E. coli 84 균주를 대상으로 역 학관계와 항균제 내성 양상을 조사하였다. 역학 관계를 확인하기 위해 다좌위 서열 형별분석(MLST)를 실시하였고, 항균제 감 수성 시험은 E-test법으로 확인하였다.
데이터처리
- coli 84 균주를 대상으로 역 학관계와 항균제 내성 양상을 조사하였다. 역학 관계를 확인하기 위해 다좌위 서열 형별분석(MLST)를 실시하였고, 항균제 감 수성 시험은 E-test법으로 확인하였다. 본 연구 결과, 요로감염 은 남성(26.
이론/모형
- Clinical and laboratory standards institute (CLSI) 지침 에 따라, amikacin, gentamicin, ceftazidime, cefotaxime, cefepime, aztreonam, ertapenem, imipenem, ciprofloxacin, piperacillin-tazobactam 및 trimethoprimsulfamethoxazole (BioMerieux)에 대한 항균제 감수성 검사는 Mueller-Hinton 한천배지(Difco, Cockeysville, MD, USA)를 사용하여 E-test법으로 확인하였다[16]. 정도관리를 위해 Escherichia coli ATCC 25922와 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853을 동시에 시험하여 허용범위 내에 있는지 확인하였다.
- MLST는 E. coli MLST database website (http://mlst. warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli)에 설명된 방법에 따라 분석하였다. 먼저, 대상 균주는 brain heart infusion broth (Difco)에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후, Genomic DNA Prep Kit (Solgent, Daejeon, Korea)을 사용하여 DNA 를 추출하였다.
성능/효과
- coli 84 균주를 대상으로 MLST를 시행한 결과, 총 16개의 ST를 확인하였다(Table 2). 16개의 ST 중 가장 높은 빈도의 유형은 ST131이었고, 총 84 균 주 중 44 균주(52.4%)에서 확인되었다. ST1193이 19 균주 (22.
- 2017년 3월부터 12월까지 대전지역의 3차 병원에 입원한 요 로감염 환자 84명을 대상으로 성별 분포를 확인한 결과, 남성 22명(26.2%), 여성 62명(73.8%)으로, 여성이 남성보다 2.8배 높은 분포를 보였다(Table 3). 또한, 연령별 분포를 확인한 결과, 70대에서 총 84명 중 31명(36.
- 8%)에서 더 흔한 분포를 보였고, 70대가 가장 높은 분포의 연령대로 확인되었다. 84 균주의 요로 병인성 E. coli 중, 59 균주(70.2%)가 다제내성이었으며, 주요 seqeunce typee ST131 (44 균주, 52.4%)임을 확인하였다. 흥미롭게도, non-ST131에서 다제내성의 비율(72.
- 4%)에서 확인되었다. ST1193이 19 균주 (22.6%)로 두 번째로 높은 빈도를 차지하였고, 순차적으로 ST648이 4 균주(4.8%), ST5150이 3 균주(3.6%), ST1148과 ST2003이 각각 2 균주(2.4%)로 확인되었다. 나머지 10개의 ST (ST38, ST69, ST93, ST224, ST410, ST450, ST1177, ST2179, ST2599, ST4204)는 각각 1 균주(1.
- 5%, 22명) 모두 70 대에서 가장 높은 분포를 보였으며, 여성의 경우 모든 연령대에서 분포가 확인되었다. ST131과 non-ST131에 따른 성별 분포 에서 ST131이 확인된 환자 44명 중 남성은 12명(27.3%), 여성 은 32명(72.7%)이었고, non-ST131이 확인된 환자 40명 중 남 성은 10명(25.0%), 여성은 30명(75.0%)으로, 모두 여성이 남 성보다 각각 2.7배, 3배 높은 분포를 보였다. 또한, ST131과 non-ST131에 따른 성별 및 연령별 분포에서 ST131과 non-ST131이 확인된 환자의 남성과 여성 모두 70대에서 가장 높은 분포를 보였으나, ST131이 확인된 환자의 경우, 여성이 46.
- 앞서 Norouzian 등[5]과 Cheung 등[20]의 연구에서 fluoroquinolone과 trimethoprim-sulfamethoxazole에 높은 내성을 확인하였 고, amikacin, piperacillin-tazobactam, carbapenem에 낮은 내성과 감수성을 확인하여, 요로감염 치료제로써의 적합 성과 유용성을 보고하였다. ST131과 non-ST131에서 10개의 항균제에 대한 내성율은 거의 유사한 결과를 보였으나, cefepime의 경우, ST131이 약 2.3배 높은 내성율을 보였다. 이러한 결과는 2020년 우리나라에서 발표한 Kim 등의 연구에서도 ST131의 cefepime 내성율이 non-ST131보다 2.
- 3%로 확인되어 이전 연구와 다른 결과를 보였다. ST131과 non-ST131의 성별, 연 령별 분포는 모두 여성과 70대에서 가장 높은 분포가 확인되어 큰 차이점은 발견되지 않았다.
- ST131과 non-ST131의 항균제 감수성 결과에서, 11개의 항균제 중 10개의 항균제에 대한 내성율은 유사하였으나, cefepime의 경우, ST131의 내성율(34.1%)이 non-ST131의 내성율(15.0%)보다 2.3배 높은 결과를 보였다. 이러한 결과를 토대로, 총 84 균주 중 59 균주(70.
- 7% (35 균주)의 내성율을 보였다 (Table 4). amikacin과 piperacillin-tazobactame 각각 3.6% (3 균주)와 6.0% (5 균주)로 비교적 낮은 내성율을 보였으며, ertapenem과 imipenem에는 84 균주 모두 내성을 보이지 않았다.
- 4%)로 확인되었다. 나머지 10개의 ST (ST38, ST69, ST93, ST224, ST410, ST450, ST1177, ST2179, ST2599, ST4204)는 각각 1 균주(1.2%)에서 확인되었다.
- 7배, 3배 높은 분포를 보였다. 또한, ST131과 non-ST131에 따른 성별 및 연령별 분포에서 ST131과 non-ST131이 확인된 환자의 남성과 여성 모두 70대에서 가장 높은 분포를 보였으나, ST131이 확인된 환자의 경우, 여성이 46.9%의 분포를 보인 반면, non-ST131이 확인된 환자의 경우, 남성이 50.0%의 분포를 보였다.
- 2%가 다제내성으로 확인되어, 제한적인 항 균제의 선택과 사용이 불가피한 실정이다. 또한, ST131과 non-ST131은 성별, 연령별 분포에서 모두 여성과 70대에서 가장 높은 분포를 보여 큰 차이가 확인되지 않았다. 그러나 흥미 롭게도 ST131과 non-ST131에서 MDR의 분포는 ST131보다 non-ST131에서 더 높은 결과를 보임에 따라 non-ST131에서 MDR의 발달과 확산이 우려되고 있다.
- 8%)가 non-MDR로 확인되었다 (Table 5). 또한, ST131에서 MDRe 68.2% (30 균주)인 반면, non-ST131에서 MDRe 72.5% (29 균주)로, ST131보다 1.1 배 높은 결과를 보였으며, 11개의 ST가 확인되었다.
- 8배 높은 분포를 보였다(Table 3). 또한, 연령별 분포를 확인한 결과, 70대에서 총 84명 중 31명(36.9%)이 확인되어 가장 높은 분포를 보였다. 순차적으로 60대가 13명(15.
- 이전 많은 연구에서 다제내성의 출현과 확산에 기여하는 범 유행적 클론으로 ST131에 대한 연구가 집중되었으나, 본 연구 결과, 최근 non-ST131에서 MDR의 발전 및 확산 가능성이 우 려되므로, 이에 대한 많은 연구가 요구된다. 본 연구 결과, 대전 지역의 3차 병원에 입원한 요로감염 환자는 대다수가 여성으로, 남성보다 2.8배 높았으며, 70대에서 가장 높은 분포를 확인하였다. 요로감염 환자의 소변에서 분리된 E.
- 역학 관계를 확인하기 위해 다좌위 서열 형별분석(MLST)를 실시하였고, 항균제 감 수성 시험은 E-test법으로 확인하였다. 본 연구 결과, 요로감염 은 남성(26.2%)보다 여성(73.8%)에서 더 흔한 분포를 보였고, 70대가 가장 높은 분포의 연령대로 확인되었다. 84 균주의 요로 병인성 E.
- coli의 항균제에 대한 내성이 증가함에 따라, 요로감염의 치료를 위한 항균제의 선택과 사용 이 전 세계적으로 문제가 되고 있다[9, 25]. 본 연구에서 gentamicin (54.8%), cefotaxime (58.3%), ciprofloxacin (100.0%), trimethoprim-sulfamethoxazole (60.7%)은 50% 이상의 높은 내성을 보였고, amikacin (3.6%), piperacillintazobactam (6.0%)은 10% 이하의 낮은 내성을 보였으며, imipenem과 ertapeneme 감수성을 보였다. 앞서 Norouzian 등[5]과 Cheung 등[20]의 연구에서 fluoroquinolone과 trimethoprim-sulfamethoxazole에 높은 내성을 확인하였 고, amikacin, piperacillin-tazobactam, carbapenem에 낮은 내성과 감수성을 확인하여, 요로감염 치료제로써의 적합 성과 유용성을 보고하였다.
- 본 연구에서 요로감염의 성별에 따른 유병율을 확인한 결과, 여성(73.8%)이 남성(26.2%)보다 약 2.8배 높은 결과를 보였다. 미국, 포르투갈, 멕시코, 나이지리아, 대만, 인도, 파키스탄과 같은 세계 다른 지역에서 이전 연구한 결과와 일치하였다.
- 5%가 MDR로 확인되었으며, 2015년 이란에서 발표한 Iranpour 등[28]의 연구에서도 82%가 MDR로 확인되었다. 본 연구에서는 총 84 균주 중 70.2% (59 균주)가 MDR로 확인되어 이전 연구 결과보다 비교적 낮은 결과를 확인하였다. 또한, 사우 디아라비아에서 발표한 Alqasim 등[15]의 이전 연구에서 ST131과 non-ST131에서의 MDRe 각각 83.
- 2%)의 분포를 보였다. 연령에 따른 성별 분포를 확인하면 남성(40.9%, 9명)과 여성(35.5%, 22명) 모두 70 대에서 가장 높은 분포를 보였으며, 여성의 경우 모든 연령대에서 분포가 확인되었다. ST131과 non-ST131에 따른 성별 분포 에서 ST131이 확인된 환자 44명 중 남성은 12명(27.
- 요로감염 환자의 소변에서 분리된 E. coli 84 균주를 대상으로 MLST를 시행한 결과, 총 16개의 ST를 확인하였다(Table 2). 16개의 ST 중 가장 높은 빈도의 유형은 ST131이었고, 총 84 균 주 중 44 균주(52.
- 3배 높은 결과를 보였다. 이러한 결과를 토대로, 총 84 균주 중 59 균주(70.2%)가 MDR로 확인되었으 며, 나머지 25 균주(29.8%)가 non-MDR로 확인되었다 (Table 5). 또한, ST131에서 MDRe 68.
- 29%), 유럽(60∼90%) 및 북미, 라틴 아메리카 국가(75∼90%)에서 요 로감염을 유발하는 가장 흔한 원인균으로 보고되고 있다[17, 20]. 이러한 요로병인성 E. coli 중 전 세계적으로 ST131이 유 행하고 있는 가운데, 본 연구에서도 ST131이 52.4%의 가장 높은 빈도로 확인되었다. Phylogenetic group B2에 속하는 E.
- 9%로 확인되어 ST131에서의 MDR이 non-ST131보다 높은 결과를 확인하였다. 이에 반해, 본 연구에서 ST131과 non-ST131에 서의 MDRe 각각 68.2%와 72.5%로, non-ST131에서의 MDR이 ST131보다 높은 결과를 확인하였으며, 이러한 결과는 non-ST131에서의 MDR이 점차 증가하고 있는 것으로 사료된다. 이전 많은 연구에서 다제내성의 출현과 확산에 기여하는 범 유행적 클론으로 ST131에 대한 연구가 집중되었으나, 본 연구 결과, 최근 non-ST131에서 MDR의 발전 및 확산 가능성이 우 려되므로, 이에 대한 많은 연구가 요구된다.
- 총 84 균주의 E. coli를 대상으로 항균제 감수성 검사를 실시한 결과, gentamicin에 54.8%(46 균주), cefotaxime에 58.3% (49 균주), ciprofloxacin에 100.0% (84 균주), trimethoprim– sulfamethoxazole에 60.7% (51 균주)의 높은 내성율을 보였 으며, ceftazidime에 26.2% (22 균주), cefepime에 25.0% (21 균주), aztreonam에 41.7% (35 균주)의 내성율을 보였다 (Table 4). amikacin과 piperacillin-tazobactame 각각 3.
- 4%)임을 확인하였다. 흥미롭게도, non-ST131에서 다제내성의 비율(72.5%)이 ST131 (68.2%)보다 더 높은 결과를 확인하였다. 이러한 연구 결과는 non-ST131에서의 다제내성의 발달과 확산 가능성을 의미하는 것으로 해석된다.
후속연구
- 이러한 연구 결과는 non-ST131에서의 다제내성의 발달과 확산 가능성을 의미하는 것으로 해석된다. 다제내성 non-ST131의 출현과 국 제적인 확산을 예방하기 위해, 전 세계적으로 효과적인 감시 체 계와 지속적인 연구가 수행되어야 할 것으로 사료된다.
- 그러나 흥미 롭게도 ST131과 non-ST131에서 MDR의 분포는 ST131보다 non-ST131에서 더 높은 결과를 보임에 따라 non-ST131에서 MDR의 발달과 확산이 우려되고 있다. 향후 non-ST131에서 MDR의 발달 및 확산을 예방하기 위한 효과적인 감시 체계와 실 질적인 연구가 개발되어야 할 것으로 사료된다
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