[논문]장수풍뎅이 유충의 장내 미생물을 이용한 다양한 식물 균류병의 생물적 방제 및 생장촉진

김준영; 김병섭

doi:10.5423/rpd.2020.26.4.210

장수풍뎅이 유충의 장내 미생물을 이용한 다양한 식물 균류병의 생물적 방제 및 생장촉진
Plant Growth Promotion and Biocontrol Potential of Various Phytopathogenic Fungi Using Gut Microbes of Allomyrina dichotoma Larva 원문보기

Research in plant disease = 식물병연구, v.26 no.4, 2020년, pp.210 - 221

김준영 (강릉원주대학교 식물생명과학과) , 김병섭 (강릉원주대학교 식물생명과학과)

초록
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곤충은 장내에 서식하고 있는 미생물과 상호작용을 통해 공생하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 공생자는 공진화를 통하여 극한 환경에서도 서식을 가능하게 한다. 이러한 관점에서 토양 속에서 부엽토와 식물 잔재를 먹고 사는 장수풍뎅이 유충의 장내에 존재하는 공생자는 식물병원균을 방제하는 데 유용한 미생물이 존재할 것으로 생각된다. 따라서, 식물병원균에 대해 활성을 갖는 유용 미생물 10종을 장수풍뎅이 유충의 소화기관 전장, 중장, 후장으로부터 분리하였다. 분리된 10종의 유용 미생물은 유묘 검정을 통하여 토마토 잿빛곰팡이병, 배추 뿌리혹병, 고추 탄저병, 고추 역병에 대하여 강력한 항균 활성을 확인하였다. 10종의 항균활성 미생물은 형태적 특성과 16s rRNA gene 분석으로 Bacillus속 4종, Paenibacillus속 3종 및 Streptomyces속 3종으로 동정되었다. 유용 미생물은 인산 가용화, indole-3-acetic acid, siderophore 생성 활성이 우수하며 진균외막가수분해 효소인 β-1,3-glucanase, pretease 활성을 보였다. 10종의 유용 미생물 중, DM152 균주는 토마토와 고추 식물체의 모든 기관에서 생장을 촉진시켰다. 따라서, 장수풍뎅이 유충의 소화기관으로부터 분리된 10종의 장내 미생물은 생물학적 방제제 및 생물비료의 활용 가능성을 나타내었다.

Abstract ▼ AI-Helper

This research was executed to select beneficial antagonists from digestive organ of Allomyrina dichotoma larva that can be put on environment friendly control against phytopathogenic fungi. We screened 38 bacterial strains inhibiting mycelial growth against eight plant pathogens through dual culture assay. The 10 strains among 38 bacterial strains were selected as beneficial microbes showing antifungal activity against Botrytis cinerea, Plasmodiophora brassicae, Colletotrichum acutatum and Phytophthora capsici through under greenhouse pot trials. The 10 bacterial strains that shown strongest antifungal activity were classified into 3 genera and 10 species, and identified as the genus Bacillus (DM146, DM152, DH2, and DH16), Paenibacillus (DF30, DH14, and DM142) and Streptomyces (DF137, DM48, and DH92) by morphological characteristics and 16s rRNA gene sequence. The 10 bacterial strains had solubilizing activity of insoluble phosphates, production of IAA (indole-3-acetic acid), β-1,3-glucanase and protease. Among the 10 bacterial strains, DM152 strain was produced significant enhancement of all growth parameters of chili pepper and tomato seedlings under greenhouse condition. Thus, this study demonstrated that gut microbes of Allomyrina dichotoma larva will be useful as a potential biocontrol agent against plant pathogens and biofertilizer.

주제어

표/그림 (7)

표 Table 1. Antagonistic activity of microorganisms isolated from digestive organ of Allomyrina dichotoma larva against several phytopatho-genic fungi in dual culture assay
표 Table 2. Effect of antagonistic microorganisms on suppression of gray mold caused by Botrytis cinereal, clubroot caused by Plasmodiophora brassicae, anthracnose caused by Colletotrichum acutatum and phytophthora blight caused by Phytophthora capsici under greenhouse pot trials
그림 Fig. 1. Spore morphological characteristics by scanning electron microscopy and colony shape on potato dextrose agar medium: DF30 (A), DF137 (B), DM48 (C), DM142 (D), DM146 (E), DM152 (F), DH2 (G), DH14 (H), DH16 (I), and DH92 (J).
그림 Fig. 2. Phylogenetic relationship between antagonistic strains and representative species based on 16S rRNA gene sequences developed with the Clustal W program in MEGA 6.06 and constructed using the neighbor-joining method with 1,000 bootstrap replicates. The values indicate the percentage of clustering matches. The scale bar indicates the number of differences in base composition among sequences.
그림 Fig. 3. Evaluation of functional substance by selected bacterial strains. (A) Indole-3-acetic acid (IAA) production. (B) Siderophore production as: 0, no halo zone; 1, halo zone of 0.1-5 mm; 2, halo zone of 5.1-10.0 mm; 3, halo zone of 10.1-15.0 mm; 4, halo zone of 15.1 mm and above. (C) Phosphate solubilization as: 0, no halo zone; 1, slight halo zone; 2, clear halo zone. (D) Production of β-1,3-glucanase and protease.
표 Table 3. Effect of growth promotion by selected bacterial strains in tomato under greenhouse pot trials
표 Table 4. Effect of growth promotion by selected bacterial strains in red pepper under greenhouse pot trials

AI 본문요약
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문제 정의

이와 같이 곤충 장내 미생물의 우수성에 대해 다양한 사례에 의해 검증되었다. 따라서 본 연구는 생물적 방제제의 새로운 탐색의 가능성을 제시하였고, 화학농약과 비료를 대신할 수 있는 생물 비료의 가능성을 나타내었다
생각된다. 따라서 본 연구는 장수풍뎅이 유충의 소화기관으로부터 분리된 장내 미생물을 이용하여 다양한 식물 균류병에 대한 항균활성과 방제효과를 검정하였고, 식물의 생육과 병 방제에 직·간접적으로 관여하는 작용메커니즘과 식물생장촉진활성을 평가하였다.

제안 방법

(Seoul, Korea)에 의뢰하여 16S rRNA gene 염기서열을 결정하였고, 결정된 염기서열은 SeqMan (DNASTAR, Madison, WI, USA)을 이용하여 정리하였다. 16S rRNA gene 염기서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information) BlastN database를 통하여 상동성을 비교하였다. MEGA 6의 Cluster W를 이용하여 염기서열을 정렬하여 neighbor-joining 방법에 따라 계통도를 작성하였고, bootstrappinge 1,000회 반복하였다.
식물생장촉진활성 검정. 3주 동안 키운 토마토, 고추 유묘를 포트(15×15 cm diameter)에 이식 후 길항균 현탁액을 100 ml씩 7일 간격으로 3회 관주 처리하였다. 마지막 처리 7일 후, 줄기 직경, 길이, 생체 중량, 건조 중량과 뿌리 길이, 생체 중량, 건조 중량 그리고 엽록소 함량을 측정하였다.
효소 검정. IAA (indole-3-acetic acid) 생성활성은 IAA의 전구물질인 L-tryptophan 0.1% 첨가한 King’s B broth 배지에 배양된 배양액과 Salkowsky reagent (35% perchloric acid 50 ml, 0.5 M ferric chloride 1 ml)를 1:2 (v/v)로 혼합하여 반응시켜 확인 후 530 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 인산 가용화 (phosphate solubilizing) 활성은 Pikovskaya’s agar [glucose 10.
16S rRNA gene 염기서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information) BlastN database를 통하여 상동성을 비교하였다. MEGA 6의 Cluster W를 이용하여 염기서열을 정렬하여 neighbor-joining 방법에 따라 계통도를 작성하였고, bootstrappinge 1,000회 반복하였다.
2. Phylogenetic relationship between antagonistic strains and representative species based on 16S rRNA gene sequences developed with the Clustal W program in MEGA 6.06 and constructed using the neighbor-joining method with 1,000 bootstrap replicates. The values indicate the percentage of clustering matches.
0 M NaCl로 3번 세척하여 투명환 형성을 diameter (mm)로 활성 능력을 조사하였다. Protease 활성은 protease 활성배지(skim milk [Sigma Aldrich Co., St. Louis, MO, USA] 10 g, nutrient broth [Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA] 2 g, agar 15 g, distilled water 1 l) 배지에 배양하여 투명환 형성을 diameter (mm)로 활성 능력을 조사하였다.
5 g, Ca3(PO4)2 5 g, agar 15 g, distilled water 1 l] 배지(Zaidi 등, 2006)에서 검정하였으며, 투명환(clear zone)을 형성하는 것이 활성이 있는 것으로 간주하였다. Siderophore 생성활성은 Chrome azourol S (CAS) agar 배지(Schwyn와 Neilands, 1997)를 이용하여 검정하였다. CAS 평판배지에 5 mm 의 cork borrer를 이용하여 배지 중앙에 disc를 제거한 후, 선발된 균주 배양액을 20 μl를 pipetting하여 접종하였다.
식물병원균의 세포벽을 분해하는 효소 활성은 β-1, 3-glucanase 활성과 protease 활성 통해 검정하였다. β-1, 3-glucanase 활성은 1% carboxymethyl- cellulose를 함유한 casein-yeast extract agar (casein 5 g, yeast extract 2.5 g, glucose 1 g, agar 18 g, distilled water 1 l) 배지에서 배양하여 Congo red 용액(1 mg/ml)을 이용하여 15분 동안 염색 후 1.0 M NaCl로 3번 세척하여 투명환 형성을 diameter (mm)로 활성 능력을 조사하였다. Protease 활성은 protease 활성배지(skim milk [Sigma Aldrich Co.
가수분해효소(β-1, 3-glucanase, protease) 활성 검정. 생물적 방제능과 식물생장촉진능을 가지는 유용 미생물의 특징 중 하나는 식물병원균으로부터 식물을 보호할 수 있는 β -1, 3-glucanase, protease 같은 진균 외막 가수분해 효소의 활성이다.
해부세트를 이용하여 장수풍뎅이 3령 유충의 몸통 부분에서 배를 절개하여 체표 부분을 제외한 장을 취하여 전장(foregut), 중장(midgut), 후장(hindgut)으로 연결된 소화기관을 무균적으로 분리하였다. 각각 분리된 소화기관의 시료를 1 g을 채취하여 멸균수 9 ml에 넣고 충분히 균질화한 후, 단계적으로 희석하여 potato dextrose agar (PDA), tryptic soy agar, starch casein agar 배지에 각각 도말하여 25oC에서 3-10일간 배양하면서 평판배지에 형성된 colony를 순수 분리하였다.
0×103 zoosporangia/ml 조정 후 유주자가 방출되도록 유도하였다. 각각의 포트에 길항균 현탁액 20 ml씩 관주처리 24시간 후에 유주포자 현탁액을 10 ml씩 관주처리하여 고습도 습실상(95% RH, 25oC)에서 24시간 동안 습실 처리하고 10일 동안발병 시킨 후 발병도를 조사하였다. 발병도는 6단계(0, 발병하지 않음; 1, 지제부가 무르고 갈변하기 시작; 2, 30‒50% 정도의병 발생; 3, 50‒70% 정도의 병 발생; 4, 70‒90% 정도의 병 발생; 5, 고사)로 조사하였다.
발병도는 5단계(0, 뿌리혹 없음; 1, 1‒9% 정도의 병 발생; 2, 10‒30% 정도의 병 발생; 3, 31‒60% 정도의 병 발생; 4, 60‒100% 정도의 병 발생)로 조사하였다. 고추 역병검정을 위해 P. capsici 균주를 oatmeal agar에 접종하여 25oC, 명조건에서 10일간 배양하였다. 배지 표면에 생성된 역병균을 4oC 차가운 멸균수를 이용하여 유주자낭을 회수하여 농도를 1.
발병도는 6단계(0, 발병하지 않음; 1, 지제부가 무르고 갈변하기 시작; 2, 30‒50% 정도의병 발생; 3, 50‒70% 정도의 병 발생; 4, 70‒90% 정도의 병 발생; 5, 고사)로 조사하였다. 고추 탄저병 검정을 위해 C. acutatum 균주를 PDA 배지에 접종하여 25o C, 14일 동안 명조건에서 배양하여 포자 형성을 유도하였다. 배지 표면에 형성된 탄저병균을 멸균수로 회수하여 1.
오염원이 제거된 고추 과실을 건조 후 멸균된 바늘을 이용하여 인위적으로 상처를 낸 후 길항세균 현탁액을 20 μl씩 pipetting하였다. 길항균 현탁액 처리 24시간 후에 탄저병균 포자 현탁액 10 μl씩 pipetting한 후 고습도 습실상(95% RH, 20oC)에서 5일간 배양한 후 병반 부위를 diameter (mm) 길이를 조사하였다. 방제가 (%)는 아래 공식에 따라 산출하였다.
0 ×106 spore/ml로 조정하였다. 길항균 현탁액을 토마토 잎에 충분히 적시도록 분무처리하였고, 24시간 후에 포자 현탁액을 분무 접종한 후 고습도 습실상(95% relative humidity [RH], 20o C)에서 5일간 배양한 후 병 발생을 조사하였다. 발병도는 5단계 (0, 발병하지 않음; 1, 0.
3주 동안 키운 토마토, 고추 유묘를 포트(15×15 cm diameter)에 이식 후 길항균 현탁액을 100 ml씩 7일 간격으로 3회 관주 처리하였다. 마지막 처리 7일 후, 줄기 직경, 길이, 생체 중량, 건조 중량과 뿌리 길이, 생체 중량, 건조 중량 그리고 엽록소 함량을 측정하였다.
길항균 현탁액을 토마토 잎에 충분히 적시도록 분무처리하였고, 24시간 후에 포자 현탁액을 분무 접종한 후 고습도 습실상(95% relative humidity [RH], 20o C)에서 5일간 배양한 후 병 발생을 조사하였다. 발병도는 5단계 (0, 발병하지 않음; 1, 0.1‒5% 정도의 병 발생; 2, 5.1‒20% 정도의 병 발생; 3, 20.1‒40% 정도의 병 발생; 4, 40.1‒100% 정도의 병 발생)로 조사하였다. 배추 뿌리혹병 검정을 위해 성숙한 뿌리혹을 채집하여 blender로 마쇄하여 현탁액을 만든 후 원예용상토(Chologi, Nongwoobio)와 섞어서 오염토를 만들었다(5 l/20 kg).
배추 뿌리혹병 오염토를 포트(10 cm diameter)에 넣고, 길항균 현탁액이 처리된 배추 유묘를 이식 후 40일간 육묘한 후 병 발생을 조사하였다. 발병도는 5단계(0, 뿌리혹 없음; 1, 1‒9% 정도의 병 발생; 2, 10‒30% 정도의 병 발생; 3, 31‒60% 정도의 병 발생; 4, 60‒100% 정도의 병 발생)로 조사하였다. 고추 역병검정을 위해 P.
각각의 포트에 길항균 현탁액 20 ml씩 관주처리 24시간 후에 유주포자 현탁액을 10 ml씩 관주처리하여 고습도 습실상(95% RH, 25oC)에서 24시간 동안 습실 처리하고 10일 동안발병 시킨 후 발병도를 조사하였다. 발병도는 6단계(0, 발병하지 않음; 1, 지제부가 무르고 갈변하기 시작; 2, 30‒50% 정도의병 발생; 3, 50‒70% 정도의 병 발생; 4, 70‒90% 정도의 병 발생; 5, 고사)로 조사하였다. 고추 탄저병 검정을 위해 C.
capsici 균주를 oatmeal agar에 접종하여 25oC, 명조건에서 10일간 배양하였다. 배지 표면에 생성된 역병균을 4oC 차가운 멸균수를 이용하여 유주자낭을 회수하여 농도를 1.0×103 zoosporangia/ml 조정 후 유주자가 방출되도록 유도하였다. 각각의 포트에 길항균 현탁액 20 ml씩 관주처리 24시간 후에 유주포자 현탁액을 10 ml씩 관주처리하여 고습도 습실상(95% RH, 25oC)에서 24시간 동안 습실 처리하고 10일 동안발병 시킨 후 발병도를 조사하였다.
1‒100% 정도의 병 발생)로 조사하였다. 배추 뿌리혹병 검정을 위해 성숙한 뿌리혹을 채집하여 blender로 마쇄하여 현탁액을 만든 후 원예용상토(Chologi, Nongwoobio)와 섞어서 오염토를 만들었다(5 l/20 kg). 배추 뿌리혹병 오염토를 포트(10 cm diameter)에 넣고, 길항균 현탁액이 처리된 배추 유묘를 이식 후 40일간 육묘한 후 병 발생을 조사하였다.
배추 뿌리혹병 검정을 위해 성숙한 뿌리혹을 채집하여 blender로 마쇄하여 현탁액을 만든 후 원예용상토(Chologi, Nongwoobio)와 섞어서 오염토를 만들었다(5 l/20 kg). 배추 뿌리혹병 오염토를 포트(10 cm diameter)에 넣고, 길항균 현탁액이 처리된 배추 유묘를 이식 후 40일간 육묘한 후 병 발생을 조사하였다. 발병도는 5단계(0, 뿌리혹 없음; 1, 1‒9% 정도의 병 발생; 2, 10‒30% 정도의 병 발생; 3, 31‒60% 정도의 병 발생; 4, 60‒100% 정도의 병 발생)로 조사하였다.
선발 균주의 동정. 생물활성 검정을 통해 최종 선발된 10 종의 장내 미생물을 동정하기 위해 주사전자현미경을 통해 형태학적 특징을 검정하였고, 16S rRNA gene 염기서열을 분석하였다. 선발된 균주의 total genomic DNA의 추출은 Nishiguchi 등(2002)의 방법을 이용하였다.
선발 균주의 IAA, 인산 가용화, siderophore 생성 활성, 가수분해 효소 검정. IAA (indole-3-acetic acid) 생성활성은 IAA의 전구물질인 L-tryptophan 0.
식물생장촉진 활성 검정. 선발된 10종의 균주를 토마토와 고추 유묘를 대상으로 식물생장촉진 활성을 검정하였다. 토마토 유묘에 처리한 길항균 중 DF30, DM152, DH16 균주가 토마토 식물체의 모든 기관에서 생장촉진활성이 가장 우수하게 나타냈다.
항균활성 검정. 순수 분리된 장내 미생물들을 대상으로 식물 병원균에 대한 항균활성을 검정하고자 8종의 식물 병원균 토마토 잿빛곰팡이병(Botrytis cinerea), 토마토 시들음병(Fusarium. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici), 벼 도열병(Magnaporthe grisea), 벼 잎집무늬마름병(Rhizoctonia solani AG-1(1A)), 고추 탄저병(Colletotrichum acutatum), 고추 역병(Phytophthora capsici), 마늘 흑색썩음균핵병(Sclerotium cepivorum), 배추 밑둥썩음병(R. solani)과 PDA 배지 상에서 대치배양(dual culture) 하여 25oC에서 10일간 배양한 후 병원균의 균사체의 생장억제 정도 (inhibition zone)를 조사하여 형성된 clear zone (mm)의 길이로 항균 활성을 조사하였다. 사용된 식물병원균은 강릉원주대학교 식물병리실험실에서 분리 동정하여 사용하거나, 농업유전자원센터에서 분양 받아 사용하였다.
접종 후 28oC에서 14일 동안 배양하면서 orange halo zone의 형성 유무로 siderophore의 활성을 조사하였다. 식물병원균의 세포벽을 분해하는 효소 활성은 β-1, 3-glucanase 활성과 protease 활성 통해 검정하였다. β-1, 3-glucanase 활성은 1% carboxymethyl- cellulose를 함유한 casein-yeast extract agar (casein 5 g, yeast extract 2.
정식 후 10주된 고추(Supermanita, Nongwoobio)에서 수확한 빨간 과실을 1% sodium hypochlorite solution (NaOCl)에 표면 살균한 후 멸균수에 2회 세척하였다. 오염원이 제거된 고추 과실을 건조 후 멸균된 바늘을 이용하여 인위적으로 상처를 낸 후 길항세균 현탁액을 20 μl씩 pipetting하였다. 길항균 현탁액 처리 24시간 후에 탄저병균 포자 현탁액 10 μl씩 pipetting한 후 고습도 습실상(95% RH, 20oC)에서 5일간 배양한 후 병반 부위를 diameter (mm) 길이를 조사하였다.
장내세균 분리 및 항균활성 검정. 장수풍뎅이 유충의 소화기관 전장, 중장, 후장에서 총 265종의 장내 미생물을 분리하였고, 분리한 미생물을 8종의 식물병원균 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 시들음병, 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병(R.
CAS 평판배지에 5 mm 의 cork borrer를 이용하여 배지 중앙에 disc를 제거한 후, 선발된 균주 배양액을 20 μl를 pipetting하여 접종하였다. 접종 후 28oC에서 14일 동안 배양하면서 orange halo zone의 형성 유무로 siderophore의 활성을 조사하였다. 식물병원균의 세포벽을 분해하는 효소 활성은 β-1, 3-glucanase 활성과 protease 활성 통해 검정하였다.
선발된 균주의 total genomic DNA의 추출은 Nishiguchi 등(2002)의 방법을 이용하였다. 추출된 genomic DNA는 universal primer 27F (5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)와 1492R (5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′) 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물을 정제하여, Solgent Co.
0×108‒109 cfu/ml 조정하여 사용하였고, 방선균은 starch casein broth 배지에 180 rpm으로 25oC, 7일 동안 배양한 배양액을 사용하였다. 토마토 잿빛곰팡이병 검정을 위해 B. cinerea 균주를 명조건에서 3주간 배양하여 0.5% glucose, 0.25% K2HPO4 현탁액으로 수확하여 포자 농도를 1.0 ×106 spore/ml로 조정하였다. 길항균 현탁액을 토마토 잎에 충분히 적시도록 분무처리하였고, 24시간 후에 포자 현탁액을 분무 접종한 후 고습도 습실상(95% relative humidity [RH], 20o C)에서 5일간 배양한 후 병 발생을 조사하였다.
통계분석. 항균활성과 효소활성 검정은 3반복 3회 수행하였으며, 생물활성과 생장촉진활성 검정은 처리구당 5포트씩 3 반복 완전임의배치법으로 수행하였다. 실험으로 얻어진 결과는 SAS system (SAS Institute Inc.
장수풍뎅이 3령 유충을 멸균된 70% 에탄올로 1‒2분 동안 침지하여 총체 표면의 오염원을 제거한 후, 멸균수로 2회 세척하였다. 해부세트를 이용하여 장수풍뎅이 3령 유충의 몸통 부분에서 배를 절개하여 체표 부분을 제외한 장을 취하여 전장(foregut), 중장(midgut), 후장(hindgut)으로 연결된 소화기관을 무균적으로 분리하였다. 각각 분리된 소화기관의 시료를 1 g을 채취하여 멸균수 9 ml에 넣고 충분히 균질화한 후, 단계적으로 희석하여 potato dextrose agar (PDA), tryptic soy agar, starch casein agar 배지에 각각 도말하여 25oC에서 3-10일간 배양하면서 평판배지에 형성된 colony를 순수 분리하였다.

대상 데이터

길항 미생물의 생물활성 검정. 대치배양을 통해 선발된 38종의 장내 미생물의 생물활성은 온실에서 토마토 잿빛곰팡이병, 배추 뿌리혹병(Plasmodiophora brassicae), 고추 탄저병, 고추 역병을 대상으로 수행하였다. 식물 재료 준비는 토마토 (Superdotaerang, Koregon, Anseong, Korea), 고추(Supermanita, Nongwoobio, Suwon, Korea), 배추(Chunkwang, Sakata Korea, Seoul, Korea)의 각각의 종자를 원예용상토(Chologi, Nongwoobio)로 채워진 162 plug trays에 파종하여 3주 동안 육묘하여 사용하였고, 3주된 육묘를 포트(10 cm diameter)에 이식하여 활착시킨 육묘를 사용하였다.
따라서 유용 미생물의 적용은 난용성 인산염을 분해하여 식물이 흡수할 수 있게 도움을 줄 수 있으며, 화학비료의 사용을 줄이고 토양 불균형을 막을 수 있다(Hameeda 등, 2008; Rajan 등, 1996). 본 연구에서 선발된 10종의 장내 미생물 모두 불용성 인산이 포함된 Pikovskaya’s agar 배지에서 투명환을 형성하였다. DF137, DM48, DM152, DH14 균주는 7일, 14일 후 모두 높은 활성을 보였으며, DH2, DH92 균주는 14일 후에도 낮은 활성을 보였다(Fig.
solani)과 PDA 배지 상에서 대치배양(dual culture) 하여 25oC에서 10일간 배양한 후 병원균의 균사체의 생장억제 정도 (inhibition zone)를 조사하여 형성된 clear zone (mm)의 길이로 항균 활성을 조사하였다. 사용된 식물병원균은 강릉원주대학교 식물병리실험실에서 분리 동정하여 사용하거나, 농업유전자원센터에서 분양 받아 사용하였다.
식물 병원균에 대한 항균활성을 가지는 장내 미생물의 탐색에 이용된 장수풍뎅이 유충은 강원도 강릉시 인근 임산 부산물에서 채집한 3령 유충을 이용하였다. 장수풍뎅이 3령 유충을 멸균된 70% 에탄올로 1‒2분 동안 침지하여 총체 표면의 오염원을 제거한 후, 멸균수로 2회 세척하였다.
대치배양을 통해 선발된 38종의 장내 미생물의 생물활성은 온실에서 토마토 잿빛곰팡이병, 배추 뿌리혹병(Plasmodiophora brassicae), 고추 탄저병, 고추 역병을 대상으로 수행하였다. 식물 재료 준비는 토마토 (Superdotaerang, Koregon, Anseong, Korea), 고추(Supermanita, Nongwoobio, Suwon, Korea), 배추(Chunkwang, Sakata Korea, Seoul, Korea)의 각각의 종자를 원예용상토(Chologi, Nongwoobio)로 채워진 162 plug trays에 파종하여 3주 동안 육묘하여 사용하였고, 3주된 육묘를 포트(10 cm diameter)에 이식하여 활착시킨 육묘를 사용하였다. 길항세균 현탁액 준비를 위해 일반 세균은 tryptic soy broth에 180 rpm으로 28oC, 24시간 동안 배양하여 1.
식물 병원균에 대한 항균활성을 가지는 장내 미생물의 탐색에 이용된 장수풍뎅이 유충은 강원도 강릉시 인근 임산 부산물에서 채집한 3령 유충을 이용하였다. 장수풍뎅이 3령 유충을 멸균된 70% 에탄올로 1‒2분 동안 침지하여 총체 표면의 오염원을 제거한 후, 멸균수로 2회 세척하였다. 해부세트를 이용하여 장수풍뎅이 3령 유충의 몸통 부분에서 배를 절개하여 체표 부분을 제외한 장을 취하여 전장(foregut), 중장(midgut), 후장(hindgut)으로 연결된 소화기관을 무균적으로 분리하였다.

데이터처리

항균활성과 효소활성 검정은 3반복 3회 수행하였으며, 생물활성과 생장촉진활성 검정은 처리구당 5포트씩 3 반복 완전임의배치법으로 수행하였다. 실험으로 얻어진 결과는 SAS system (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 통계분석을 하였으며, Duncan의 다중검정(Duncan’s multiple range test)를 이용하여 P≤0.05 수준에서 각 처리 간의 유의성을 검증하였다.

이론/모형

생물활성 검정을 통해 최종 선발된 10 종의 장내 미생물을 동정하기 위해 주사전자현미경을 통해 형태학적 특징을 검정하였고, 16S rRNA gene 염기서열을 분석하였다. 선발된 균주의 total genomic DNA의 추출은 Nishiguchi 등(2002)의 방법을 이용하였다. 추출된 genomic DNA는 universal primer 27F (5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)와 1492R (5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′) 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하였다.

성능/효과

분리된 10종의 유용 미생물은 유묘 검정을 통하여 토마토 잿빛곰팡이병, 배추 뿌리혹병, 고추 탄저병, 고추 역병에 대하여 강력한 항균 활성을 확인하였다. 10종의 항균활성 미생물은 형태적 특성과 16s rRNA gene 분석으로 Bacillus속 4종, Paenibacillus속 3종 및 Streptomyces속 3종으로 동정되었다. 유용 미생물은 인산 가용화, indole-3-acetic acid, siderophore 생성 활성이 우수하며 진균외막 가수분해 효소인 β-1, 3-glucanase, pretease 활성을 보였다.
본 연구에서 선발된 10종의 장내 미생물 모두 불용성 인산이 포함된 Pikovskaya’s agar 배지에서 투명환을 형성하였다. DF137, DM48, DM152, DH14 균주는 7일, 14일 후 모두 높은 활성을 보였으며, DH2, DH92 균주는 14일 후에도 낮은 활성을 보였다(Fig. 3B).
본 연구에서 선발된 10종의 유용 장내 미생물은 다양한 수준의 β-1, 3-glucanase, protease 활성 효과를 보였다. DF30, DF137, DM142, DM146, DM152, DH14, DH16 균주는 10.0 mm 이상의 투명환을 형성하여 높은 활성을 나타냈다. DH2 균주는 β-1, 3-glucanase 효소 활성은 우수하였지만, protease 활성은 나타내지 않았다(Fig.
본 연구에서 선발된 10종의 장내 미생물 모두 CAS agar 배지에서 오렌지 색깔로 변색되어 halo zone을 형성하였다. DM146, DH2, DH16 균주가 CAS agar 배지에서 15.1 mm 이상의 halo zone을 형성하여 siderophore 생성능이 우수한 것으로 평가되었다. DM152, DH92 균주는 0.
sp. radicis-lycopersici와 R. solani에 대한 활성을 지닌 길항균의 분리비는 낮게 나타났고, S. cepivorum 와 M. grisea에 활성을 가진 길항균의 분리비는 높게 나타났다. 대치배양을 통해 선발된 38종의 길항균은 대부분의 식물 병원균에 대한 항균활성을 보여, 스펙트럼이 넓은 것을 확인하였다 (Table 1).
장수풍뎅이 유충의 소화기관 전장, 중장, 후장에서 총 265종의 장내 미생물을 분리하였고, 분리한 미생물을 8종의 식물병원균 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 시들음병, 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병(R. solani AG-1(1A)), 고추 탄저병, 고추 역병, 마늘 흑색썩음균핵병, 배추 밑둥썩음병에 대하여 대치배양 결과, 총 148종의 길항균을 스크리닝하였다. 전장에서 33종으로 가장 낮은 길항균의 분리비를 보였고, 중장에서 52종, 후장에서 63종으로 가장 많은 길항균의 분리비를 나타냈다.
velezensis, DH16 균주는 B. subtilis subsp. subtilis와 99.93% 상동성을 보였고, DH2 균주는 B. atrophaeus와 100% 상동성을 보였다. 또한, DF30, DH14 균주는 P.
2%의 방제효과를 보였다. 고추 역병에 대한 길항균의 생물활성을 검정한 결과, DM152, DH16의 균주는 83.0% 이상의 방제가를 보였으며, 미생물제품 EXTN-1과 화학농약 dimetomorphe 각각 65.5%, 98.9%의 방제효과를 보였다. 따라서, B.
3%의 방제효과를 보였다. 고추 탄저병에 대한 길항균의 생물활성을 검정한 결과, DF30, DM142, DM146, DM152 균주는 82.3% 이상의 높은 방제가를 보였으며, 미생물제품 EXTN-1과 화학농약 propineb는 각각 86.6%, 47.2%의 방제효과를 보였다. 고추 역병에 대한 길항균의 생물활성을 검정한 결과, DM152, DH16의 균주는 83.
Lee 등(2013)은 장수풍뎅이 유충의 분변에서 다양한 방선균이 분리되었고, 그 중 Streptomyces spp.는 식물병원균 C. gloeosporioides, F. oxysporum에 대하여 균사 생장 억제를 보여 강한 항균활성을 보였으며, 또한 카제인, 셀룰로오스, 키틴의 분해능에 대한 강한 활성을 보여 유용한 생물 소재의 활용 가능성을 보였다. 또한, Nam 등(2016)은 장수풍뎅이 3령 유충의 분변에서 분리한 B.
grisea에 활성을 가진 길항균의 분리비는 높게 나타났다. 대치배양을 통해 선발된 38종의 길항균은 대부분의 식물 병원균에 대한 항균활성을 보여, 스펙트럼이 넓은 것을 확인하였다 (Table 1).
길항 미생물의 생물활성 검정. 대치배양을 통해 선발된 길항균을 대상으로 토마토 잿빛곰팡이병에 대한 생물활성을 검정한 결과, DF30, DF137, DM48, DH2, DH16 균주는 80.4% 이상의 높은 방제가를 보였으며, 미생물제품 EXTN-1 (B. vallismortis EXTN-1)과 화학농약 fludioxonile 각각 35.1%, 95.8%의 방제효과를 보였다. 배추 뿌리혹병에 대한 길항균의 생물활성을 검정한 결과, DF30, DM142, DM146, DM152, DH2 균주는 83.
9%의 방제효과를 보였다. 따라서, B. cinerea, P. brassicae, C. acutatum, P. capsici에 대하여 생물활성이 우수한 10종의 길항균을 선발하였고, 생물적 방제제로 활용 가능성을 확인하였다(Table 2).
이러한 관점에서 토양 속에서 부엽토와 식물 잔재를 먹고 사는 장수풍뎅이 유충의 장내에 존재하는 공생자는 식물병원균을 방제하는데 유용한 미생물이 존재할 것으로 생각된다. 따라서, 식물병원균에 대해 활성을 갖는 유용 미생물 10종을 장수풍뎅이 유충의 소화기관 전장, 중장, 후장으로부터 분리하였다. 분리된 10종의 유용 미생물은 유묘 검정을 통하여 토마토 잿빛곰팡이병, 배추 뿌리혹병, 고추 탄저병, 고추 역병에 대하여 강력한 항균 활성을 확인하였다.
10종의 유용 미생물 중, DM152 균주는 토마토와 고추 식물체의 모든 기관에서 생장을 촉진시켰다. 따라서, 장수풍뎅이 유충의 소화기관으로부터 분리된 10종의 장내 미생물은 생물학적 방제제 및 생물비료의 활용 가능성을 나타내었다.
jamilae와 100% 상동성이 일치하였다. 또한, DF137 균주는 S. misionensis와 99.85% 상동성을 보였고, DM48 균주는 S. costaricanus와 99.93% 상동성이 일치하였다. DH92 균주는 genomic DNA를 획득하는데 실패하여 16S rRNA gene 염기서열을 분석하지 못하였지만, 형태적 특성에 따라 Streptomyces sp.
atrophaeus와 100% 상동성을 보였다. 또한, DF30, DH14 균주는 P. polymyxa와 99.86% 상동성이 일치하였고, DM142 균주는 P. jamilae와 100% 상동성이 일치하였다. 또한, DF137 균주는 S.
있다(Huo 등, 2010; Lee 등, 2006; Li 등, 2012). 또한, 본 연구에서 분리된 장내미생물은 Bacillus속, Paenibacillus속 균주가 제일 많은 분리비를 보였다(data not shown). 이러한 Bacillus속, Paenibacillus속 균주들은 endospore를 형성하기 때문에 고온, 방사선, 건조 등 불리한 환경에서 생장을 가능하게 한다(McSpadden Gardener, 2004; Nicholson 등, 2000).
8%의 방제효과를 보였다. 배추 뿌리혹병에 대한 길항균의 생물활성을 검정한 결과, DF30, DM142, DM146, DM152, DH2 균주는 83.0% 이상의 높은 방제가를 보였으며, 미생물제품 EXTN-1과 화학농약 cyazopamid는 각각 73.5%, 99.3%의 방제효과를 보였다. 고추 탄저병에 대한 길항균의 생물활성을 검정한 결과, DF30, DM142, DM146, DM152 균주는 82.
생물적 방제능과 식물생장촉진능을 가지는 유용 미생물의 특징 중 하나는 식물병원균으로부터 식물을 보호할 수 있는 β -1, 3-glucanase, protease 같은 진균 외막 가수분해 효소의 활성이다. 본 연구에서 선발된 10종의 유용 장내 미생물은 다양한 수준의 β-1, 3-glucanase, protease 활성 효과를 보였다. DF30, DF137, DM142, DM146, DM152, DH14, DH16 균주는 10.
이는 유용 미생물에 의해 제한된 철(Fe3+) 성분 결합물질인 siderophore를 생산하여 다양한 식물병원균의 생육을 저해하거나 직간접적으로 작물의 생장을 촉진할 수 있다. 본 연구에서 선발된 10종의 장내 미생물 모두 CAS agar 배지에서 오렌지 색깔로 변색되어 halo zone을 형성하였다. DM146, DH2, DH16 균주가 CAS agar 배지에서 15.
특히, Bacillus속 균은 생물적 방제에 중요한 역활을 하는 iturin, surfactin, bacillomycin, fengycin 등의 lipopeptide계를 포함한 항생물질을 분비한다고 알려져있다(Ntushelo 등, 2019; Zeriouh 등, 2011). 본 연구에서도 선발된 4종의 Bacillus속 균은 iturin A와 surfactin과 같은 항생물질을 생산할 것으로 추정된다.
따라서, 식물병원균에 대해 활성을 갖는 유용 미생물 10종을 장수풍뎅이 유충의 소화기관 전장, 중장, 후장으로부터 분리하였다. 분리된 10종의 유용 미생물은 유묘 검정을 통하여 토마토 잿빛곰팡이병, 배추 뿌리혹병, 고추 탄저병, 고추 역병에 대하여 강력한 항균 활성을 확인하였다. 10종의 항균활성 미생물은 형태적 특성과 16s rRNA gene 분석으로 Bacillus속 4종, Paenibacillus속 3종 및 Streptomyces속 3종으로 동정되었다.
22 g으로 가장 높았다. 뿌리기관의 경우 길이는 DF137 균주 처리구가 가장 높았으며, 생체중량과 건조 중량에서는 DM152 균주 처리구가 8.84 g, 0.55 g 으로 가장 좋은 활성을 보였다. 엽록소 함량에서는 DM142 균주 처리구가 37.
지금까지 IAA, cytokinins, gibberellins 같은 식물호르몬을 생산하는 유용 미생물의 효과에 대한 많은 보고가 있다(Kavamura 등, 2013; Son 등, 2014). 선발된 10종의 균주에 대한 IAA 생성 활성조사를 위해 흡광도를 측정한 결과, 1.2‒26.9 μg/ml의 우수한 IAA 생성능을 보였다. 후장에서 분리한 DH92 균주가 26.
22 spad units로 가장 좋은 활성을 보였다(Table 4). 선발된 10종의 장내 미생물 중에서, DM152 균주는 인산 가용화 활성은 우수하지만 IAA, siderophore 생성활성이 다른 균주와 비교하여 저조함에도 불구하고 고추와 토마토 식물체 모두에서 가장 강력한 식물 생장 촉진 활성을 보였다. 이는 다양한 메커니즘이 상호작용하거나 하나의 독립된 메커니즘이 식물 생장 촉진하는 효과에 관여했을 것으로 추정된다.
55 g 으로 가장 좋은 활성을 보였다. 엽록소 함량에서는 DM142 균주 처리구가 37.63 spad units로 가장 좋은 활성을 보였다(Table 3). 고추 유묘의 경우, 처리구 중에서 DM142, DM152가 처리된고추의 모든 기관에서 생장촉진활성이 가장 우수하게 나타냈다.
47 g으로 가장 높았다. 엽록소 함량에서는 유의차이는 없었지만 DM152 균주가 56.22 spad units로 가장 좋은 활성을 보였다(Table 4). 선발된 10종의 장내 미생물 중에서, DM152 균주는 인산 가용화 활성은 우수하지만 IAA, siderophore 생성활성이 다른 균주와 비교하여 저조함에도 불구하고 고추와 토마토 식물체 모두에서 가장 강력한 식물 생장 촉진 활성을 보였다.
10종의 항균활성 미생물은 형태적 특성과 16s rRNA gene 분석으로 Bacillus속 4종, Paenibacillus속 3종 및 Streptomyces속 3종으로 동정되었다. 유용 미생물은 인산 가용화, indole-3-acetic acid, siderophore 생성 활성이 우수하며 진균외막 가수분해 효소인 β-1, 3-glucanase, pretease 활성을 보였다. 10종의 유용 미생물 중, DM152 균주는 토마토와 고추 식물체의 모든 기관에서 생장을 촉진시켰다.
solani AG-1(1A)), 고추 탄저병, 고추 역병, 마늘 흑색썩음균핵병, 배추 밑둥썩음병에 대하여 대치배양 결과, 총 148종의 길항균을 스크리닝하였다. 전장에서 33종으로 가장 낮은 길항균의 분리비를 보였고, 중장에서 52종, 후장에서 63종으로 가장 많은 길항균의 분리비를 나타냈다. 이러한 길항균의 분리비는 곤충의 섭식 구조와 소화기관에 따른 특징으로 보여진다.
토마토 유묘에 처리한 길항균 중 DF30, DM152, DH16 균주가 토마토 식물체의 모든 기관에서 생장촉진활성이 가장 우수하게 나타냈다. 줄기 기관의 길이와 직경은 DF30 균주 처리구가 54.32 cm, 7.30 mm로 가장 높았으며, 생체 중량과 건조 중량에서는 DM152 균주 처리구가 56.56 g, 3.22 g으로 가장 높았다. 뿌리기관의 경우 길이는 DF137 균주 처리구가 가장 높았으며, 생체중량과 건조 중량에서는 DM152 균주 처리구가 8.
고추 유묘의 경우, 처리구 중에서 DM142, DM152가 처리된고추의 모든 기관에서 생장촉진활성이 가장 우수하게 나타냈다. 줄기의 길이와 중량에서는 DM142 균주가 32.78 cm, 6.90 mm로 가장 높았으며, 생체 중량과 건조 중량에서는 DM152 균주가 22.96 g, 2.91 g, DM142 균주가 21.62 g, 3.37 g으로 가장 높았다. 뿌리 기관의 경우 길이는 DM152 균주가 19.
선발된 10종의 균주를 토마토와 고추 유묘를 대상으로 식물생장촉진 활성을 검정하였다. 토마토 유묘에 처리한 길항균 중 DF30, DM152, DH16 균주가 토마토 식물체의 모든 기관에서 생장촉진활성이 가장 우수하게 나타냈다. 줄기 기관의 길이와 직경은 DF30 균주 처리구가 54.

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Zaidi, S., Usmani, S., Singh, B. R. and Musarrat, J. 2006. Significance of Bacillus subtilis strain SJ-101 as a bioinoculant for concurrent plant growth promotion and nickel accumulation in Brassica juncea. Chemosphere 64: 991-997.

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Zeriouh, H., Romero, D., Garcia-Gutierrez, L., Cazorla, F. M., de Vicente, A. and Perez-Garcia, A. 2011. The iturin-like lipopeptides are essential components in the biological control arsenal of Bacillus subtilis against bacterial diseases of cucurbits. Mol. Plant-Microbe Interact. 24: 1540-1552.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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