[논문]흑효모를 이용한 참도박 발효 추출물의 항산화 효과와 티로시나제 및 콜라게나제 저해효과

부반빈; 이경은; 강상구

doi:10.15230/scsk.2020.46.1.1

흑효모를 이용한 참도박 발효 추출물의 항산화 효과와 티로시나제 및 콜라게나제 저해효과
Evaluation of Antioxidant, Tyrosinase and Collagenase Inhibitory of Grateloupia elliptica Extracts after Aureobasidium pullulans Fermentation 원문보기

大韓化粧品學會誌 = Journal of the society of cosmetic scientists of Korea, v.46 no.1, 2020년, pp.1 - 9

부반빈 (영남대학교 생명응용과학대학 생명공학과) , 이경은 (영남대학교 생명응용과학대학 생명공학과) , 강상구 (영남대학교 생명응용과학대학 생명공학과)

초록
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연구에서는 흑효모(Aureobasidium pullulans)를 이용한 참도박(Grateloupia elliptica) 발효 열수와 에탄올 추출물 및 발효하지 않은 참도박 열수와 에탄올 추출물과 항산화, 티로시나제와 콜라게나제 저해효과, 세포독성 및 증식실험을 진행하였다. 흑효모 발효 참도박 추출물과 참도박 추출물은 농도가 증가함에 따라 농도의존적으로 DPPH와 ABTS 라디칼 소거활성이 높아졌으며, 발효에 관계없이 에탄올 추출물이 열수 추출물보다 항산화 활성이 높게 나타났다. 또한 모든 시료 중 참도박 발효 에탄올 추출물의 항산화 활성이 가장 높게 나타났다. Tyrosinase 저해효과는 1,000 ㎍/mL 농도에서 참도박 발효 에탄올 추출물(GEFEE)이 9.8%로 가장 높은 결과를 나타냈으나, 모든 추출물에서 10%이하의 낮은 tyrosinase 저해효과를 나타냈다. Collagenase 저해 효과를 조사한 결과 발효와 관계없이 열수추출물에서는 collagenase 저해 효과가 미미한 것으로 나타났으나, 에탄올 추출물의 경우 농도 의존적으로 collagenase 저해효과를 나타냈다. 또한 참도박 발효에탄올 추출물의 경우 1,000 ㎍/mL에서 50.3%의 시료 중 가장 높은 저해 효과를 나타냈다. 인간세포(HaCaT, keratinocytes)를 이용하여 세포독성 및 증식실험을 진행하였다. 참도박 및 참도박 발효추출물의 세포독성 및 증식률은 무처리 대조군과 비교한 결과 시료의 모든 농도에서 90% 이상의 결과를 나타냈다. 모든 시료 중 참도박 발효 에탄올추출물이 가장 높은 항산화 활성 및 주름개선 효과를 나타냈다. 따라서 참도박 발효추출물은 우수한 항산화 효과와 주름개선 효능을 가진 화장품의 생리활성 소재로 개발될 수 있을 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

In this experiment, the Grateloupia elliptica (G. elliptica) was fermented using the fungus Aureobasidium pullulans (A. pullulans) and its extract was obtained from hot water and 70% ethanol solution. The extract was studied for their biological activities such as antioxidant effect, Collagenase and tyrosinase inhibition in comparison to the nonfermented exatract in same solvents. Antioxidative activity test using 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) and 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) showed that ethanol extract had higher antioxidant activity than water extract. Among all of the samples, the antioxidant activity of G. elliptica fermented ethanol extracts (GEFEE) was highest. Tyrosinase inhibitory activity of GEFEE was highest with 9.8% at the 1,000 ㎍/mL concentration. No inhibition of collagenase from G. elliptica water extract (GEWE) and G. elliptica fermented water extract (GEFWE) was observed, but G. elliptica ethanol extracts (GEEE) and GEFEE showed increased collagenase inhibition activity with increasing concentrations of them. Collagenase inhibitory activity of GEFEE was highest with 50.3% at the 1,000 ㎍/mL concentration. MTS cell proliferation assay was conducted with the GEWE, GEEE, GEFWE, GEFEE and cell viability was over 90% at the 10 ㎍/mL ~ 1000 ㎍/mL concentrations for all of the samples, which suggested that the extracts were noncytotoxic. In conclusion, fermented extracts of G. elliptica could be developed to bioactive functional material for cosmetics with antioxidant and wrinkle improvement effects.

주제어

표/그림 (7)

그림 Figure 1. Diagram for preparation of algae extracts and fermented algae extracts.
그림 Figure 2. DPPH free radical scavenging activity of G. elliptica water extracts (GEWE), G. elliptica ethanol extracts (GEEE), G. elliptica fermented water extracts (GEFWE), G. elliptica fermented ethanol extracts (GEFEE).
표 Table 1. Yields Obtained from Extraction Methods
그림 Figure 3. ABTS radical scavenging activity of G. elliptica water extracts (GEWE), G. elliptica ethanol extracts (GEEE), G. elliptica fermented water extracts (GEFWE), G. elliptica fermented ethanol extracts (GEFEE).
그림 Figure 4. Tyrosinase inhibition activity of G. elliptica water extracts (GEWE), G. elliptica ethanol extracts (GEEE), G. elliptica fermented water extracts (GEFWE), G. elliptica fermented ethanol extracts (GEFEE).
그림 Figure 5. Collagenase inhibition activity of G. ellipticawater extracts (GEWE), G. elliptica ethanol extracts (GEEE), G. elliptica fermented water extracts (GEFWE), G. elliptica fermented ethanol extracts (GEFEE).
그림 Figure 6. Cell viability of G. elliptica water extracts (GEWE), G. elliptica ethanol extracts (GEEE), G. elliptica fermented water extracts (GEFWE), G. elliptica fermented ethanol extracts (GEFEE).

AI 본문요약
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문제 정의

하지만 아직까지 참도박에 대한 화장품 소재로써의 연구는 미흡한 상태이며, 또한 흑효모를 이용한 참도박 발효물에 대한 연구는 이루어지지 않았다. 따라서 본 연구에서는 참도박 및 참도박 발효추출물의 항산화 활성, 미백, 주름개선, 세포 독성 및 증식률에 대한 연구를 수행하여 화장품 원료로써의 가능성을 평가하고자 한다.
본 연구에서는 참도박 추출물들의 보다 자세한 항산화능을 조사하기 위하여 ABTS를 이용하여 라디칼 소거 활성을 측정하였다. ABTS 라디칼 소거활성측정 방법은 DPPH 방법보다 더 민감하게 항산화 능력을 알아볼 수 있는 방법으로 알려져 있다[33].
본 연구에서는 화장품 기능성 소재로 개발하기 위해 참도박 추출물과 참도박 발효 추출물에 대한 항산화, 미백, 주름개선, 세포독성 및 증식 효과를 검증하고자 하였다. 항산화 실험인 DPPH radical 소거 활성에 대한 측정 결과는 추출물을 각각 처리하였을 때 농도 의존적으로 증가였으나 열수 추출물의 경우 발효 전후 항산화 활성은 유사한 결과를 나타냈다.

제안 방법

1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거활성 측정은 Blois (1958)의 방법을 변형하여 분석하였다. 각 농도별로 희석된 시료 200 μL에 에탄올로 용해시킨 0.
2,2’-Azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) 라디칼 소거활성 측정은 Dong Hwa Park 등의 방법[28]을 변형하여 측정하였다.
Collagenase 저해활성 측정은 Tamsyn 의 방법[30]을 변형하여 측정하였다. 즉 반응구는 0.
Tyrosinase의 활성을 저해하는 정도를 측정하기 위하여 in vitro tyrosinase inhibition assay를 실시하였다. In vitro tyrosinase inhibition assay는 Jin 등의 방법[29]을 변형하여 측정하였다. 실험방법은 0.
Tyrosinase의 활성을 저해하는 정도를 측정하기 위하여 in vitro tyrosinase inhibition assay를 실시하였다. In vitro tyrosinase inhibition assay는 Jin 등의 방법[29]을 변형하여 측정하였다.
각 농도별로 희석된 시료 200 μL에 에탄올로 용해시킨 0.2mM DPPH (Sigma Aldrich, USA) 용액 100 μL를 혼합하여 실온에서 30 min 동안 반응시킨 후 ELISA reader(Infinite™ F200, TECAN, Switzerland)를 이용하여 517nm에서 흡광도를 측정하였다.
2mM DPPH (Sigma Aldrich, USA) 용액 100 μL를 혼합하여 실온에서 30 min 동안 반응시킨 후 ELISA reader(Infinite™ F200, TECAN, Switzerland)를 이용하여 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로 DPPH 대신 에탄올을 처리하였다. 또한 양성 대조군은 ascorbic acid를 사용하였다.
대조군으로 DPPH 대신 에탄올을 처리하였다. 또한 양성 대조군은 ascorbic acid를 사용하였다. DPPH radical 소거 활성은 다음의 식에 따라 계산하였다.
5)을 사용하였다. 또한 양성 대조군은 알부틴을 사용하였다. Tyrosinase 활성 저해율은 다음의 식에 따라 계산하였다.
멸균된 참도박을 식힌 다음에 2 × 106 cfu/mL 흑효모 현탁액을 접종하고 혼합물을 30 ℃에서 168 h 동안 발효시켰다. 발효한 후 흑효모의 균체 등을 제거하기 위하여 121 ℃에서 20 min 동안 멸균시켜 발효에 사용된 미생물을 완전히 사멸시켰다. 이 참도박 발효물을 기존의 열수 및 에탄올 추출 방식과 동일하게 추출하였다.
세포독성 및 증식시험은 Terry 등의 방법[31]을 변형하여 측정하였다. 세포독성 및 증식을 측정하기 위해 배양된 인간세포(HaCaT)를 96 well plate에 1 × 10⁴ cell/well로 균일하게 분주한 다음 24 h 후 각 추출물을 10, 100, 250, 500, 1000 μg/mL 농도로 처리하여 48 h 동안 배양하였다.
세포독성 및 증식을 측정하기 위해 배양된 인간세포(HaCaT)를 96 well plate에 1 × 104 cell/well로 균일하게 분주한 다음 24 h 후 각 추출물을 10, 100, 250, 500, 1000 μg/mL 농도로 처리하여 48 h 동안 배양하였다.
실험방법은 0.1 M 인산염완충액(pH 6.5) 220 μL와 각 농도별로 희석된 시료 20 μL, mushroom tyrosinase (2000 U/mL) (Sigma Aldrich, USA) 20 μL와 1.5 mM tyrosine (Sigma Aldrich, USA) 40 μL를 순서대로 첨가한 후 37 ℃에서 10 min 동안 반응시켰다.
이 균체 배양을 위해 malt extract (MBcell, Korea), Dextrin (Daejung chemical & metals co., ltd, Korea), soy peptone (MBcell, Korea)과 정제수를 투입하여 배지를 제조하였다.
참도박 추출물과 참도박 발효추출물이 인간의 피부에서 유래한 인간세포(HaCaT, keratinocytes)에 세포독성 및 증식에 대한 영향을 조사하기 위해 세포 배양액에 다양한 농도의 참도박 추출물과 참도박 발효추출물을 첨가하여 48 h 배양한 후 세포 독성 및 증식시험을 실시하고 그 결과를 나타냈다(Figure 6). 참도박 추출물과 참도박 발효추출물을 48 h 처리한 결과, 추출물을 처리한 모든 농도에서 무처리 대조군과 유사한 결과를 나타냈다.

대상 데이터

2,2’-Azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) 라디칼 소거활성 측정은 Dong Hwa Park 등의 방법[28]을 변형하여 측정하였다. ABTS (Sigma Aldrich, USA)를 7mM 농도로 증류수에 용해한 다음 2.45 mM potassium persulfate를 가하여 1 : 1의 비율로 혼합하여 실온인 암실에서 12 ~ 18 h 동안 반응 시킨 후 ABTS 라디칼을 형성시킨 후 사용하였다. 라디칼이 형성된 ABTS 용액을 에탄올로 희석하여 734 nm에서 측정한 흡광도가 0.
본 실험에서 사용한 참도박은 ㈜파라제주(Jeju, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 실험재료인 참도박을 흐르는 수돗물에 세척한 후 다시 1 차 증류수로 세척하였다.
인간세포(HaCaT, keratinocytes)(ATCC, USA) 세포를 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (HyClone, USA) 배지에 10% fetal bovine serum (FBS) (HyClone, USA)과 penicillin (100 units/mL)/streptomycin (100 μg/mL)(HyClone, USA)을 첨가하여 CO2 세포배양기(NU-4750G, NuAire, USA)에서 5% CO2 공급 하에서 배양하였으며, 2 ~ 3일 간격으로 계대 배양을 시행하였다.
한국 미생물 보존센터(http://www.kccm.or.kr/, Korea) 에서 흑효모(A. pullulans)를 분양받았다. 이 균체 배양을 위해 malt extract (MBcell, Korea), Dextrin (Daejung chemical & metals co.

데이터처리

모든 실험은 3회 반복 실시하였고 통계분석은 평균 ± 표준편차로 나타내었으며, Student’s t-test법을 이용하였으며, p-value가 0.01 미만인 경우 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판정하였다.

성능/효과

ABTS radical 소거활성능 또한 농도 의존적으로 항산화능이 증가하였으며, 측정 결과 참도박 에탄올 추출물(GEEE), 참도박 발효 에탄올 추출물(GEFEE) 경우 1,000 μg/mL에서 각각 85.8%, 94.6%로 매우 우수한 항산화 활성을 나타냈다.
또한 열수 추출물보다 에탄올 추출물의 항산화 활성이 우수한 결과를 나타냈다. Arbutin을 대조군으로 tyrosinase 저해효과를 측정결과와 비교해 보았을 때 참도박 열수 추출물, 참도박 발효 열수 추출물, 참도박 에탄올 추출물, 참도박 발효 에탄올 추출물의 tyrosinase 저해활성은 10% 이하의 미미한 결과를 나타냈다. Collagenase 저해효과는 발효에 관계없이 열수추출물보다 에탄올 추출물의 collagenase 저해활성을 높은 것을 확인하였다.
3%의 collagenase 저해효과를 나타냈다. Collagenase 저해 효과는 epigallocatechin-3-gallate (EGCG)를 대조군으로 비교한 결과 참도박 발효 에탄올 추출물이 가장 높은 저해효과를 나타냈다.
Arbutin을 대조군으로 tyrosinase 저해효과를 측정결과와 비교해 보았을 때 참도박 열수 추출물, 참도박 발효 열수 추출물, 참도박 에탄올 추출물, 참도박 발효 에탄올 추출물의 tyrosinase 저해활성은 10% 이하의 미미한 결과를 나타냈다. Collagenase 저해효과는 발효에 관계없이 열수추출물보다 에탄올 추출물의 collagenase 저해활성을 높은 것을 확인하였다. 또한 에탄올 추출물 중에서 참도박 발효 추출물이 collagenase 저해활성을 50.
각 추출물 1,000 μg/mL 농도에서 참도박 열수 추출물(GEWE)은 9.0%, 참도박 발효열수 추출물(GEFWE)은 8.4% 나타냈다.
2% 나타냈다. 그리고 시료처리 모든 농도에서 세포 독성 및 증식률이 대조군과 비교한 결과 90% 이상의결과를 나타냈다.
0% 이상의 결과 나타냈다. 따라서 참도박 발효 에탄올 추출물의 경우 가장 높은 항산화 효과와 주름개선 효과를 나타냈다. 종합하면 참도박 발효추출물은 우수한 항산화 효과와 주름개선 효능을 가진 화장품의 생리활성 소재로 개발될 수 있는 가능성을 확인하였다.
Collagenase 저해효과는 발효에 관계없이 열수추출물보다 에탄올 추출물의 collagenase 저해활성을 높은 것을 확인하였다. 또한 에탄올 추출물 중에서 참도박 발효 추출물이 collagenase 저해활성을 50.3%로 가장 높게 나타났다. 세포독성 및 증식률은 모든 시료 처리군에서 무처리 대조군과 비교하였을 때 90.
0% 이상으로 가장 우수한 항산화 활성을 나타냈다. 또한 열수 추출물보다 에탄올 추출물의 항산화 활성이 우수한 결과를 나타냈다. Arbutin을 대조군으로 tyrosinase 저해효과를 측정결과와 비교해 보았을 때 참도박 열수 추출물, 참도박 발효 열수 추출물, 참도박 에탄올 추출물, 참도박 발효 에탄올 추출물의 tyrosinase 저해활성은 10% 이하의 미미한 결과를 나타냈다.
모든 시료 10,000 μg/mL 농도에서 참도박 열수 추출물(GEWE)는 4.0%, 참도박 에탄올 추출물(GEEE)는 8.3%, 참도박 발효 열수 추출물(GEFWE)는 7.6%, 참도박 발효 에탄올 추출물(GEFEE)는 9.8%의 결과를 나타냈다.
열수 추출물의 경우 참도박 추출물(GEWE)과 참도박 발효 추출물(GEFWE)이 차이가 미미하였다. 반면에 에탄올 추출물의 경우 참도박 추출물(GEEE)보다 참도박 발효 추출물(GEFEE)의 항산화 효과가 높게 나타났다. 참도박 에탄올 추출물(GEEE)은 500, 1,000 μg/mL 농도에서 각각 23.
3%로 가장 높게 나타났다. 세포독성 및 증식률은 모든 시료 처리군에서 무처리 대조군과 비교하였을 때 90.0% 이상의 결과 나타냈다. 따라서 참도박 발효 에탄올 추출물의 경우 가장 높은 항산화 효과와 주름개선 효과를 나타냈다.
참도박 추출물과 참도박 발효추출물의 ABTS 라디칼 소거 활성에 대한 결과는 참도박 추출물보다 참도박 발효 추출물의 결과가 약 15 ~ 20% 높게 나타났다. 열수 추출물과 에탄올 추출물의 비교 결과 에탄올 추출물이 열수 추출물보다 뛰어난 항산화 활성을 보였으며 가장 높은 항산화 활성을 나타낸 시료는 발효 에탄올 추출물이다.
0% 나타냈다. 열수로 추출 방법과 에탄올로 추출방법이 비교한 결과 에탄올로 추출방법보다 열수 추출법의 수율이 약 4배 정도 높게 나타났다.
따라서 참도박 발효 에탄올 추출물의 경우 가장 높은 항산화 효과와 주름개선 효과를 나타냈다. 종합하면 참도박 발효추출물은 우수한 항산화 효과와 주름개선 효능을 가진 화장품의 생리활성 소재로 개발될 수 있는 가능성을 확인하였다.
참도박 에탄올 추출물(GEEE)은 500, 1,000 μg/mL 농도에서 각각 23.4%, 37.1% 나타났다.
참도박 열수 추출물(GEWE), 참도박 에탄올 추출물(GEEE), 참도박 발효 열수 추출물(GEFWE), 참도박 발효 에탄올 추출물(GEFEE)는 500 μg/mL 농도에서 각각 48.3%, 61.7%, 68.6%, 87.1%의 라디칼 소거 활성을 나타냈다.
참도박 열수 추출물(GEWE)가 1,000 μg/mL 농도에서는 99.8%, 참도박 에탄올 추출물(GEEE)가 10 μg/mL 농도에서는 99.8%, 참도박 발효 열수 추출물(GEFWE)가 1,000 μg/mL 농도에서는 98.8%, 참도박 발효 에탄올 추출물(GEFEE)가 500 μg/mL 농도에서는 99.2% 나타냈다.
추출 방법별 참도박 추출물의 추출 수율은 Table 1과 같이 나타났다. 참도박 열수 추출물(GEWE)가 37.5%, 참도박 에탄올 추출물(GEEE)가 7.5%, 참도박 발효 열수 추출물(GEFWE)가 30.0%, 참도박 발효 에탄올 추출물(GEFEE)가 8.0% 나타냈다. 열수로 추출 방법과 에탄올로 추출방법이 비교한 결과 에탄올로 추출방법보다 열수 추출법의 수율이 약 4배 정도 높게 나타났다.
1%의 라디칼 소거 활성을 나타냈다. 참도박 추출물과 참도박 발효추출물의 ABTS 라디칼 소거 활성에 대한 결과는 참도박 추출물보다 참도박 발효 추출물의 결과가 약 15 ~ 20% 높게 나타났다. 열수 추출물과 에탄올 추출물의 비교 결과 에탄올 추출물이 열수 추출물보다 뛰어난 항산화 활성을 보였으며 가장 높은 항산화 활성을 나타낸 시료는 발효 에탄올 추출물이다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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