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문제 정의
- 따라서 본 저자는 호흡기의 염증성 질환 뿐만 아니라, 염증반 응을 나타내는 여러 질환에 적용 가능할 것으로 사료되는 MH의 효능을 확인하기 위하여, 마우스 대식세포인 RAW 264.7 cell에 MH를 전처리 한 후, 자극원인 lipopolysarccharide (LPS)로 염증 반응을 촉진하고, 염증매개인자인 nitric oxide (NO)와 prostaglandin E2 (PGE2)의 생성, 전구염증매개효소인 iNOS와 COX-2의 단백질 생성 및 mRNA 발현, 펩티드성 염증인자인 cytokines의 mRNA 발현을 확인하여, 유의성 있는 결과를 얻었기 에 보고하고자 한다.
- 급성 염증에서는 interleukin (IL)-1 α, IL-1β, IL-6, tumor necrosis factor (TNF)-α 등이, 만성 염 증에서는 interferon-γ와 IL-12가 대표적인 사이토카인이다26,33). 이 중 본 연구에서는 RAW 264.7 cell에서의 IL-1α, IL-1β, IL-6 mRNA 발현 변화를 관찰하여, 염증성 질환에 대한 MH의 효과를 확인하고자 하였다.
- 이와 같이 MH는 구성 약물 각각의 한의학적 효능 및 상호 배 합을 통해 解散表邪·淸肺定喘의 효능을 가질 뿐만 아니라, 개객 약 물 전체 또는 추출 성분을 가지고 실험한 결과 상에서도 각각 항염 효능을 가지고 있으므로, MH 또한 현대의학적으로는 항염증 효과를 지닐 것으로 사료되어, 본 처방의 효능에 대한 세포수준에서의 기전 을 확인하고자 RAW 264.7 cell을 이용하여 염증매개인자 및 전구염 증매개효소의 분자생물학적 변화를 관찰하는 본 실험을 진행하였다.
제안 방법
- MH가 대식세포에서의 pro-inflammatory cytokine 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여 RT-PCR 실험을 진행하였다. IL-1α mRNA의 상대적 발현은 LPS만 단독 처리한 대조군의 발현값 평균을 100%로 설정한 후, 약물 및 LPS를 처리하지 않은 무처리군과, LPS 처리 후 100 ㎍/㎖ 또는 200 ㎍/㎖의 농도로 MH를 처리한 실험군의 발현값을 확인한 결과, 각각 0.
- MH의 NO 생성 억제 효과와 iNOS 간의 관련성을 확인하기 위하여 iNOS의 protein 및 mRNA 발현을 관찰하였다. 대조군 (LPS 단독 처리)의 iNOS protein 생성량을 기준으로 실험군(MH 처리)들의 상대적인 생성량을 확인한 결과, 약물 및 LPS 무처리군 의 경우에는 iNOS protein이 관찰되지 않았으며, 100, 200 ㎍/㎖ 의 농도로 MH를 처리한 실험군의 iNOS protein 생성량은 100 ± 21.
- MH의 항염증 효과를 확인하고자 LPS로 자극한 RAW 264.7 cell을 이용하여 NO 및 PGE2 발생, COX-2 및 iNOS의 protein 생 산과 mRNA 발현, 주요 사이토카인인 IL-1α, IL-1β, IL-6의 mRNA 발현에 대하여 실험한 결과, 다음과 같은 결론에 도달하였다.
- 합성된 cDNA는 Corning cellgro (USA)의 Tris/EDTA buffer를 첨가하여 1/5로 희석한 후 사용하였다. RT-PCR 실험은 Applied Biosystems (USA)의 real-time PCR system과 Thermo Fisher (USA)의 Taqman probe(Table 2)를 이용하여 실시간으로 유전자별 mRNA 발현량을 분석하였다.
- 다음날, MH를 0, 20, 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 희석한 배지로 교환하여 1시간 다시 배 양한 후 LPS를 700 ng/㎖의 농도로 추가한 다음 하루 동안 추가 배양하였다. 그 후 새로운 96 well plate에 세포가 없는 상등액 100 ㎕을 각각 넣은 뒤 Nitric Oxide Detection kit (Intron Biotechnology, Korea)의 A, B 시약을 각각 50 ㎕씩 넣고 540 ㎚ 에서 흡광도를 측정하였다. 동일 plate에 넣은 Nitrite standard의 농도별 흡광도 값을 바탕으로 표준용량곡선을 작성하고 최종적으로 질소산화물(nitrite, NO2-)의 농도를 계산하였다.
- 다음날 MH를 0, 20, 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 희석한 배지로 교환하여 1시간 다시 배 양한 후 LPS를 700 ng/㎖의 농도로 추가한 다음 하루 동안 추가 배양하였다. 그 후 세포가 없는 상등액을 수거하여 R&D systems (USA)의 PGE2 assay kit의 지시에 따라 처리한 후 450 ㎚에서 흡 광도를 측정하였다. 동시에 측정한 PGE2 standard의 흡광도 값을 바탕으로 표준용량곡선을 작성하고 최종적으로 PGE2의 농도를 계 산하였다.
- 7 cell을 2 ㎖씩 6 well plate에 분주한 후 24시간 배양하였다. 다음날, MH를 0, 20, 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 희석한 배지로 교환하여 1시간 다시 배 양한 후 LPS를 700 ng/㎖의 농도로 추가한 다음 하루 동안 추가 배양하였다. 그 후 새로운 96 well plate에 세포가 없는 상등액 100 ㎕을 각각 넣은 뒤 Nitric Oxide Detection kit (Intron Biotechnology, Korea)의 A, B 시약을 각각 50 ㎕씩 넣고 540 ㎚ 에서 흡광도를 측정하였다.
- 7 cell을 500 ㎕씩 24 well plate에 분주한 후 24시간 배양하였다. 다음날, MH를 0, 10, 20, 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 희석한 배지로 교환하고 1시간 다시 배양한 후, 700 ng/㎖의 농도로 LPS를 추가한 다음 하루 동안 추가 배양하였다. 5 ㎎/㎖의 Methylthiazol-2-yl-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) 시약을 100 ㎕씩 각 well에 넣고 암 청색의 포마잔(formazan)이 생성되도록 3시간 배양하였다.
- 7 cell을 2 ㎖씩 6 well plate에 분주한 후 24시간 배양하였다. 다음날, MH를 0, 20, 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 희석한 배지로 교환하여 1시간 다시 배 양한 후 LPS를 700 ng/㎖의 농도로 추가한 다음 하루 동안 추가 배양하였다. 그 후 새로운 96 well plate에 세포가 없는 상등액 100 ㎕을 각각 넣은 뒤 Nitric Oxide Detection kit (Intron Biotechnology, Korea)의 A, B 시약을 각각 50 ㎕씩 넣고 540 ㎚ 에서 흡광도를 측정하였다.
- 그 후 세포가 없는 상등액을 수거하여 R&D systems (USA)의 PGE2 assay kit의 지시에 따라 처리한 후 450 ㎚에서 흡 광도를 측정하였다. 동시에 측정한 PGE2 standard의 흡광도 값을 바탕으로 표준용량곡선을 작성하고 최종적으로 PGE2의 농도를 계 산하였다.
- 그 후 새로운 96 well plate에 세포가 없는 상등액 100 ㎕을 각각 넣은 뒤 Nitric Oxide Detection kit (Intron Biotechnology, Korea)의 A, B 시약을 각각 50 ㎕씩 넣고 540 ㎚ 에서 흡광도를 측정하였다. 동일 plate에 넣은 Nitrite standard의 농도별 흡광도 값을 바탕으로 표준용량곡선을 작성하고 최종적으로 질소산화물(nitrite, NO2-)의 농도를 계산하였다.
- 또한 PGE2 생성 과정에 기여하는 COX-2 효소와의 관련성을 확인하고자 COX-2의 protein 및 mRNA 발현을 관찰하였다. 대조 군의 COX-2 protein 생성량을 기준으로 실험군들의 상대적인 생 성량을 확인한 결과, 무처리군의 경우에는 COX-2 protein이 관찰 되지 않았으며, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 MH를 처리한 실험군의 COX-2 protein 생성량은 100 ± 7.
- 7 celle 한국세포주은행(Seoul, South Korea)에서 분양받았으며, 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) 과 1% penicillin-streptomycin (P/S)을 포함한 Dulbeco's Modified Eagle's Media (DMEM)를 이용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양시켰다. 세포는 주기적으로 계대배양을 함으로 써 증식으로 인한 과밀도 현상을 예방하였다.
- 다음날, 100, 200 ㎍/㎖ 의 농도로 희석한 배지로 교환하고 1시간 다시 배양한 후 LPS를 700 ng/㎖의 농도로 추가한 다음 6시간 추가 배양하였다. 염증 관련 사이토카인의 mRNA 발현량을 비교하기 위하여 Ambion (USA)의 TRIzol reagent을 사용하여 total RNA를 추출한 뒤 Toyobo (Japan)의 Revertra ACE kit를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 Corning cellgro (USA)의 Tris/EDTA buffer를 첨가하여 1/5로 희석한 후 사용하였다.
- 그 후 10% skim milk에 NC membrane을 담가 blocking 과정을 거친 후, Tris-buffered saline Tween 20 (TBS-T)에 각각 1 : 1000, 1 : 2000, 1 : 5000으로 희석한 iNOS, COX-2, β-actin의 primary antibody를 16시간 부착시킨 뒤, TBS-T 용액에 1 : 5000으로 희석된 HRP-conjugated secondary antibody를 1시간 부착시켰다. 이후 Dogen (Korea)의 EZ-Western Detection kit 를 사용하여 지시대로 처리한 후 웨스턴이미지분석시스템으로 분 석하였다.
대상 데이터
- MH 2첩(96 g)은 세명대학교 부속 한방병원에서 구매하였다. 시료를 세척하고 960 ㎖의 증류수를 넣은 뒤 3시간 끓여 유효성분 을 추출하였다.
- RAW 264.7 celle 한국세포주은행(Seoul, South Korea)에서 분양받았으며, 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) 과 1% penicillin-streptomycin (P/S)을 포함한 Dulbeco's Modified Eagle's Media (DMEM)를 이용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양시켰다. 세포는 주기적으로 계대배양을 함으로 써 증식으로 인한 과밀도 현상을 예방하였다.
- 본 처방의 구성 약물은 麻黃, 杏仁, 甘草, 石膏의 총 4종이다. 개별 약물의 효과를 살펴보면, 麻黃(Ephedrae Herba)의 경우, 한 의학적으로 散寒解表·宣肺平喘·利水消腫의 효능을 가지며15), 실험 적 연구를 통해 adjuvant 유도성 관절염 또는 LPS로 유도된 염증 을 억제하는 마황 약침의 효과 또한 확인되었다16).
데이터처리
- 각 결과값은 SPSS 12.0 통계 프로그램을 사용하여 one way-ANOVA로 군 간 분석을 시행하였으며 유의수준은 p < 0.05 로 정하였다.
이론/모형
- MH의 대식세포 생존율 저해 여부를 확인하기 위하여 MTT assay를 실시하였다. MH 무처리군의 흡광도 평균을 100%의 세포 생존율로 설정한 뒤, 이를 기준으로 MH 처리군들의 흡광도 값을 계산한 결과, 0, 10, 20, 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도인 MH 처리군 들의 세포 생존율은 100.
성능/효과
- 29 ㎛이었다. 20, 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 MH를 전처리 한 후 LPS를 넣 은 실험군의 NO 생성량은 각각 31.89 ± 3.59, 27.55 ± 1.72, 24.27 ± 2.52, 19.31 ± 1.91 ㎛로 대조군과 비교하여 전 농도에서 유의성 있는 감소 양상을 보였다(Fig. 2a).
- MH 및 LPS 무처리군의 PGE2 생성량은 563 ± 108 pg/㎖이 었으며, 대조군의 경우에는 1924 ± 108 pg/㎖이었다. 20, 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 MH를 처리한 실험군의 PGE2 생성량은 각각 1802 ± 175, 1649 ± 133, 1618 ± 105, 1476 ± 67 pg/㎖ 로 대조군과 비교하여 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 MH를 처리한 실 험군에서 유의성 있는 감소 양상을 보였다(Fig. 3a).
- 3b). COX-2 mRNA의 상대적 발현은 LPS만 단독 처 리한 대조군의 발현값 평균을 100%로 설정한 후, 약물 및 LPS를 처리하지 않은 무처리군과, LPS 처리 후 100 ㎍/㎖ 또는 200 ㎍/ ㎖의 농도로 MH를 처리한 실험군의 발현값을 확인한 결과, 각각 0.0 ± 0.0%, 85.4 ± 5.1%, 55.1 ± 4.2%로 실험군에서 농도 의 존적인 감소 양상을 보였으며, 특히 200 ㎍/㎖의 실험군에서는 대 조군과 비교하여 유의성 있는 감소 양상을 보였다(Fig. 3c).
- MH가 대식세포에서의 pro-inflammatory cytokine 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여 RT-PCR 실험을 진행하였다. IL-1α mRNA의 상대적 발현은 LPS만 단독 처리한 대조군의 발현값 평균을 100%로 설정한 후, 약물 및 LPS를 처리하지 않은 무처리군과, LPS 처리 후 100 ㎍/㎖ 또는 200 ㎍/㎖의 농도로 MH를 처리한 실험군의 발현값을 확인한 결과, 각각 0.0 ± 0.0%, 76.6 ± 7.8%, 32.3 ± 4.2%로 모든 실험군에서 농도 의존적이며 유의성 있는 감소 양상을 보였다(Fig. 4a). IL-1β mRNA의 상대적 발현은 LPS만 단독 처리한 대조군의 발현값 평균을 100%로 설정 한 후, 약물 및 LPS를 처리하지 않은 무처리군과, LPS 처리 후 100 ㎍/㎖ 또는 200 ㎍/㎖의 농도로 MH를 처리한 실험군의 발현 값을 확인한 결과, 각각 0.
- 4a). IL-1β mRNA의 상대적 발현은 LPS만 단독 처리한 대조군의 발현값 평균을 100%로 설정 한 후, 약물 및 LPS를 처리하지 않은 무처리군과, LPS 처리 후 100 ㎍/㎖ 또는 200 ㎍/㎖의 농도로 MH를 처리한 실험군의 발현 값을 확인한 결과, 각각 0.1 ± 0.0%, 88.4 ± 3.8%, 41.5 ± 3.5% 로 실험군에서 농도 의존적인 감소 양상을 보였으며, 특히 200 ㎍ /㎖의 실험군에서는 대조군과 비교하여 유의성 있는 감소 양상을 보였다(Fig. 4b). IL-6 mRNA의 상대적 발현은 LPS만 단독 처리한 대조군의 발현값 평균을 100%로 설정한 후, 약물 및 LPS를 처리 하지 않은 무처리군과, LPS 처리 후 100 ㎍/㎖ 또는 200 ㎍/㎖의 농도로 MH를 처리한 실험군의 발현값을 확인한 결과, 각각 0.
- 4b). IL-6 mRNA의 상대적 발현은 LPS만 단독 처리한 대조군의 발현값 평균을 100%로 설정한 후, 약물 및 LPS를 처리 하지 않은 무처리군과, LPS 처리 후 100 ㎍/㎖ 또는 200 ㎍/㎖의 농도로 MH를 처리한 실험군의 발현값을 확인한 결과, 각각 0.0 ± 0.0%, 85.6 ± 5.8%, 26.5 ± 3.1%로 실험군에서 농도 의존적인 감소 양상을 보였으며, 특히 200 ㎍/㎖의 실험군에서는 대조군과 비교하여 유의성 있는 감소 양상을 보였다(Fig. 4c).
- MH의 대식세포 생존율 저해 여부를 확인하기 위하여 MTT assay를 실시하였다. MH 무처리군의 흡광도 평균을 100%의 세포 생존율로 설정한 뒤, 이를 기준으로 MH 처리군들의 흡광도 값을 계산한 결과, 0, 10, 20, 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도인 MH 처리군 들의 세포 생존율은 100.0 ± 7.5%, 104.8 ± 4.5%, 102.9 ± 5.0%, 105.2 ± 6.9%, 102.2 ± 8.3%, 105.0 ± 6.1%로, MH 처리 군 모두에서 무처리군과의 유의미한 차이는 발생하지 않았다.
- 2b). iNOS mRNA의 상 대적 발현은 LPS만 단독 처리한 대조군의 발현값 평균을 100%로 설정한 후, 약물 및 LPS를 처리하지 않은 무처리군과, LPS 처리 후 100 ㎍/㎖ 또는 200 ㎍/㎖의 농도로 MH를 처리한 실험군의 발현값을 확인한 결과, 각각 0.1 ± 0.0%, 53.0 ± 6.0%, 37.0 ± 8.0%로 모든 실험군에서 농도 의존적이며 유의성 있는 감소 양상 을 보였다(Fig. 2c).
- 또한 PGE2 생성 과정에 기여하는 COX-2 효소와의 관련성을 확인하고자 COX-2의 protein 및 mRNA 발현을 관찰하였다. 대조 군의 COX-2 protein 생성량을 기준으로 실험군들의 상대적인 생 성량을 확인한 결과, 무처리군의 경우에는 COX-2 protein이 관찰 되지 않았으며, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 MH를 처리한 실험군의 COX-2 protein 생성량은 100 ± 7.2%의 대조군과 비교하여 각각 59.51 ± 12.4, 39.32 ± 16.4%로 모두 유의성 있는 감소 양상을 보였다(Fig. 3b). COX-2 mRNA의 상대적 발현은 LPS만 단독 처 리한 대조군의 발현값 평균을 100%로 설정한 후, 약물 및 LPS를 처리하지 않은 무처리군과, LPS 처리 후 100 ㎍/㎖ 또는 200 ㎍/ ㎖의 농도로 MH를 처리한 실험군의 발현값을 확인한 결과, 각각 0.
- MH의 NO 생성 억제 효과와 iNOS 간의 관련성을 확인하기 위하여 iNOS의 protein 및 mRNA 발현을 관찰하였다. 대조군 (LPS 단독 처리)의 iNOS protein 생성량을 기준으로 실험군(MH 처리)들의 상대적인 생성량을 확인한 결과, 약물 및 LPS 무처리군 의 경우에는 iNOS protein이 관찰되지 않았으며, 100, 200 ㎍/㎖ 의 농도로 MH를 처리한 실험군의 iNOS protein 생성량은 100 ± 21.8%의 대조군과 비교하여 각각 31.25 ± 7.6%, 6.32 ± 1.7%로 모두 유의성 있는 감소 양상을 보였다(Fig. 2b). iNOS mRNA의 상 대적 발현은 LPS만 단독 처리한 대조군의 발현값 평균을 100%로 설정한 후, 약물 및 LPS를 처리하지 않은 무처리군과, LPS 처리 후 100 ㎍/㎖ 또는 200 ㎍/㎖의 농도로 MH를 처리한 실험군의 발현값을 확인한 결과, 각각 0.
- 본 연구에서 MH의 NO 생성에 미치는 효과를 확인한 결과, LPS만 단독 처리한 대조군과 비교하여 MH를 처리한 모든 실험군 에서 유의성 있는 NO 생성 저해 효과가 관찰되었으며, 또한 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 MH를 처리한 실험군에서 유의성 있는 iNOS protein 생성 저하 및 iNOS mRNA 발현 억제도 나타났다.
- COX는 인체 내에서 항상 발현되는 COX-1과 다양한 염증 자극에 의해 유도되는 COX-2의 2가지 형태로 존재하는데, 이 중 COX-2는 LPS, 박테리아 독소, 사이토카인 등의 염증 자극 인자나 매개 물질로 인하여 촉진되어 대량의 prostaglandin E2 (PGE2)를 생산 케 한다29-32). 본 연구에서 MH의 PGE2 생성에 미치는 효과를 확인한 결과, LPS만 단독 처리한 대조군과 비교하여 100, 200 ㎍/㎖ 농도의 MH 처리군에서 PGE2 생성 저하 효과가 유의성 있게 관찰 되었으며, COX-2의 단백질 생성 저하는 100, 200 ㎍/㎖ 농도, mRNA 발현 억제는 200 ㎍/㎖ 농도의 MH 처리군에서 유의성 있게 나타났다.
- 7 celle BALB/c 마우스 유래 대식세포 유사 세포 주로, 다양한 약물들의 세포유래 염증매개물질의 생성 및 염증 신 호전달체계 조절 여부를 확인하는 항염증 실험의 기초 모델로서 염 증 감소 효능 약물을 밝혀내기 위하여 다용되고 있다24,25). 본 연구에서 실험하고자 하는 MH의 농도에서 RAW 264.7 cell의 생존율 이 저해되는지 여부를 확인한 결과, MH 처리군은 200 ㎍/㎖ 이하의 전 농도에서 세포생존율에 영향을 받지 않음이 관찰되었다.
- 상기 결과들을 통해 MH는 NO 및 PGE2 발생 억제, iNOS 및 COX-2의 protein 생산과 mRNA 발현 저하, IL-1α, IL-1β, IL-6 의 mRNA 발현 저하를 바탕으로 항염증 효과를 갖고 있다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 MH는 염증성 질환의 치료제제 및 다양한 기능성 제품의 유효성분으로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 실험 결과, MH는 100, 200 ㎍/㎖의 농도에서 LPS로 촉진된 IL-1α, IL-1β, IL-6 mRNA의 발현을 농도 의존적으로 억제하는 효과를 보였으며, IL-1α는 100, 200 ㎍/㎖의 농도에서, IL-1β와 IL-6는 200 ㎍/㎖의 농도에서 유의성 또한 확인되었다. 이는 MH 가 염증반응에서 세포-유래 매개물질의 생성에 관여하는 세포 내 신호회로를 조절함으로써 염증 억제 효능을 가진다는 것을 시사하고 있는 것이다.
후속연구
- 상기 결과들을 통해 MH는 NO 및 PGE2 발생 억제, iNOS 및 COX-2의 protein 생산과 mRNA 발현 저하, IL-1α, IL-1β, IL-6 의 mRNA 발현 저하를 바탕으로 항염증 효과를 갖고 있다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 MH는 염증성 질환의 치료제제 및 다양한 기능성 제품의 유효성분으로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
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