[논문]광주지역 유통 채소류의 Bacillus cereus 오염실태 및 독소 특성

조선주; 정소향; 서유진; 김태순; 이향희; 이민규; 서정미; 조배식; 김중범

doi:10.9799/ksfan.2020.33.2.142

광주지역 유통 채소류의 Bacillus cereus 오염실태 및 독소 특성
Prevalence and Toxin Characteristics of Bacillus cereus Isolated from Vegetables in Gwangju Metropolitan City 원문보기

한국식품영양학회지 = The Korean journal of food and nutrition, v.33 no.2, 2020년, pp.142 - 148

Abstract ▼ AI-Helper

The purpose of this study was to investigate the prevalence, toxin gene profiles, and enterotoxin producing ability of Bacillus cereus isolated from environment-friendly vegetables and good agricultural practices (GAP) vegetables. A total of 49 vegetables including 40 environment-friendly vegetables and 9 GAP vegetables were tested. The Vitek 2 system was used to identify B. cereus and the PCR was used to detect 6 toxin genes, respectively. B. cereus was detected in 34 (69.3%) of 49 vegetables and the prevalence of B. cereus in GAP vegetables (44.4%) was lower than in the environment-friendly vegetables (75.0%). The detection rates of entFM, nheA, hblC, and cytK enterotoxin genes, respectively, among all isolates were 100%, 97.0%, 88.2%, and 73.5%, respectively. All of the isolates had at least one or more enterotoxin gene and 20 isolates (58.8%) had hemolysin BL enterotoxin producing ability. The risk of food poisoning from the environment-friendly vegetables and the GAP vegetables has been shown as constant. Thus, it is necessary to expand the supply of GAP vegetables showing lower B. cereus contamination than the environment-friendly vegetables. The characteristics of the environment-friendly vegetables and the GAP vegetables that must be consumed after cleaning should be disseminated to consumers regarding food poisoning prevention.

주제어

표/그림 (5)

표 Table 1. Classification of environment-friendly vege-tables and GAP¹⁾
표 Table 2. Prevalence of Bacillus cereus in vegetables
표 Table 3. Prevalence of Bacillus cereus in environment- friendly vegetables and GAP¹⁾
표 Table 4. Distribution of enterotoxin and emetic toxin genes in Bacillus cereus isolated from environment-friendly vegetables and GAP¹⁾
표 Table 5. Enterotoxin and emetic toxin gene profiles of Bacillus cereus isolated fromenvironment-friendly vegetables and GAP¹⁾

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 광주지역의 시중 유통되고 있는 채소류 중 친환경 및 GAP 인증 채소류의 B. cereus 오염도와 독소 특성을 분석하여 친환경 및 GAP 인증 채소류의 안전 섭취 방안을 제시하고자 하였다.
본 연구에서는 시중 유통되고 있는 친환경 및 GAP 인증 채소류의 B. cereus 오염도와 독소 특성을 분석하여 친환경 및 GAP 인증 채소류의 안전 섭취 방안을 제시하고자 하였다. 본 실험에서 사용된 재료는 광주광역시에서 판매되고 있는 친환경 채소류와 GAP 인증을 받은 채소류 총 49건을 대상으로 하였다.

제안 방법

B. cereus 유전자가 확인된 시료에 한 해 B. cereus 생화학적 분리 동정 실험을 실시하였다. 생화학적 분리 동정 실험은 식품공전(MFDS 2019)에 따라 실험하였으며, TSB 증균액을 mannitol egg-yolk polymyxin agar(MYP, Mbcell, Seoul, Korea) 배지에 도말한 후 30℃에서 24시간 배양하였다.
cereus 한 개 집락을 취하여 brain heart infusion broth(Oxoid)에 접종하여 35℃에서 24시간 배양한 후 900 g에서 20분간 원심분리(Smart R17, Hanil scientific, Gimpo, Korea)하였다. B. cereus가 생산하는 Hemolysin BL enterotoxin(HBL) 독소 단백질을 검출하기 위해 상등액과 BCET-RPLA toxin detection kit(Oxoid)를 사용하였으며, 제조사가 제시하는 기준에 따라 응집 여부를 관찰하여 독소 검출 여부를 판단하였다.
0(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 DNA를 추출하였으며, 추출된 DNA를 Real-Time PCR을 수행하기 위한 template로 사용하였다. B. cereus를 검출하기 위한 Real-Time PCR은 PowerChek^TM 20 Pathogen Multiplex Real-Time PCR kit(Kogenebiotech, Seoul, Korea)와 7500 Fast Real Time PCR system(Applied Biosystem, Foster City, CA, USA)을 이용하였다. RealTime PCR을 위한 반응액 조성과 target gene은 제조사(Kogenebiotech)에서 제시한 방법에 따라 실험하였다.
cereus 집락을 취하여 boiling method(Lee 등 2018)로 DNA를 추출하여 template로 사용하였다. B. cereus의 독소 유전자 검출은 PowerChek^TM Bacillus cereus Toxin 6-plex Detection Kit(Kogenebiotech Co., Ltd.)와 Proplex PCR system(Life Technologies Holding Pte. Ltd, Singapore)을 사용하였으며, 제조사가 제시하는 방법에 따라 실험을 수행하였다. 실험 방법을 기술하면 추출된 template DNA 5 μL와 premix 10 μL, primer mixture 5 μL를 혼합한 후 95℃에서 10분간 denaturation 하였다.
PCR 반응 후 최종산물 5 μL를 취하여 2% agarose gel에 loading한 후 110 V에서 30분간 전기영동하여 hblC, nheA, entFM, CytK, becT, cer 독소 유전자를 확인하였다.
실험 방법을 기술하면 추출된 template DNA 5 μL와 premix 10 μL, primer mixture 5 μL를 혼합한 후 95℃에서 10분간 denaturation 하였다. PCR 반응은 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초를 30번 반복하였으며, 최종적으로 72℃에서 10분간 반응하여 PCR 반응을 종료하였다. PCR 반응 후 최종산물 5 μL를 취하여 2% agarose gel에 loading한 후 110 V에서 30분간 전기영동하여 hblC, nheA, entFM, CytK, becT, cer 독소 유전자를 확인하였다.
cereus 분리 동정은 ViteK2를 이용하였으며, hblC. nheA, entFM, cytK, becT, cer 독소 유전자를 확인은 PCR을 이용하였다. 채소류 총 49건 중 34건(69.
독소 유전자 확인실험에서 계대배양된 B. cereus 한 개 집락을 취하여 brain heart infusion broth(Oxoid)에 접종하여 35℃에서 24시간 배양한 후 900 g에서 20분간 원심분리(Smart R17, Hanil scientific, Gimpo, Korea)하였다. B.
생화학적으로 분리 동정된 B. cereus를 TSA에 획선도말하여 30℃에서 24시간 계대배양하였다. 순수 분리한 B.
배양된 집락 중 분홍색 집락 주변에 lecithinase를 생성하는 집락을 선별하였다. 선별된 집락을 tryptic soy agar(TSA; Oxoid, Hampshire, England)배지에 획선 도말한 후 순수 분리한 집락을 Vitek2 BCL card(BioMerieux, Inc., Marcy Etoile, France)를 이용하여 최종 동정하였다. 최종 확인된 B.
실험 방법을 기술하면 추출된 template DNA 5 μL와 premix 10 μL, primer mixture 5 μL를 혼합한 후 95℃에서 10분간 denaturation 하였다.
증균액 200 μL를 취하여 EZ1 Virus Mini kit v2.0(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 DNA를 추출하였으며, 추출된 DNA를 Real-Time PCR을 수행하기 위한 template로 사용하였다.

대상 데이터

생화학적 분리 동정 실험은 식품공전(MFDS 2019)에 따라 실험하였으며, TSB 증균액을 mannitol egg-yolk polymyxin agar(MYP, Mbcell, Seoul, Korea) 배지에 도말한 후 30℃에서 24시간 배양하였다. 배양된 집락 중 분홍색 집락 주변에 lecithinase를 생성하는 집락을 선별하였다. 선별된 집락을 tryptic soy agar(TSA; Oxoid, Hampshire, England)배지에 획선 도말한 후 순수 분리한 집락을 Vitek2 BCL card(BioMerieux, Inc.
본 실험에 사용된 재료는 2017년 7월부터 2018년 8월까지 광주광역시에 유통 판매되고 있는 친환경 채소류와 GAP 인증을 받은 채소류 총 49건을 대상으로 하였으며, 구입된 채소류는 냉장 상태를 유지하며, 2시간 이내에 연구원으로 운반하여 실험에 사용하였다. 실험에 사용된 채소류는 Table 1에 나타내었으며, 친환경농산물 중 무농약 채소류가 25건, 유기농 채소류가 15건, GAP 인증을 받은 채소류가 9건이었으며, 제품별로는 상추(lettuce) 17건, 치커리(chicory) 6건, 케일(kale) 5건, 쌈추(Korean cabbage) 5건, 겨자(mustard) 3건, 신선초(Angelica keiskei) 3건, 청경채(bok choy) 3건, 비트(beet) 2건, 쑥갓(crown daisy) 2건, 깻잎(perilla leaf) 2건, 민들레(Korean dandelion) 1건 등이었다.
cereus 오염도와 독소 특성을 분석하여 친환경 및 GAP 인증 채소류의 안전 섭취 방안을 제시하고자 하였다. 본 실험에서 사용된 재료는 광주광역시에서 판매되고 있는 친환경 채소류와 GAP 인증을 받은 채소류 총 49건을 대상으로 하였다. B.
본 실험에 사용된 재료는 2017년 7월부터 2018년 8월까지 광주광역시에 유통 판매되고 있는 친환경 채소류와 GAP 인증을 받은 채소류 총 49건을 대상으로 하였으며, 구입된 채소류는 냉장 상태를 유지하며, 2시간 이내에 연구원으로 운반하여 실험에 사용하였다. 실험에 사용된 채소류는 Table 1에 나타내었으며, 친환경농산물 중 무농약 채소류가 25건, 유기농 채소류가 15건, GAP 인증을 받은 채소류가 9건이었으며, 제품별로는 상추(lettuce) 17건, 치커리(chicory) 6건, 케일(kale) 5건, 쌈추(Korean cabbage) 5건, 겨자(mustard) 3건, 신선초(Angelica keiskei) 3건, 청경채(bok choy) 3건, 비트(beet) 2건, 쑥갓(crown daisy) 2건, 깻잎(perilla leaf) 2건, 민들레(Korean dandelion) 1건 등이었다.

이론/모형

cereus를 검출하기 위한 Real-Time PCR은 PowerChek^TM 20 Pathogen Multiplex Real-Time PCR kit(Kogenebiotech, Seoul, Korea)와 7500 Fast Real Time PCR system(Applied Biosystem, Foster City, CA, USA)을 이용하였다. RealTime PCR을 위한 반응액 조성과 target gene은 제조사(Kogenebiotech)에서 제시한 방법에 따라 실험하였다.
cereus 생화학적 분리 동정 실험을 실시하였다. 생화학적 분리 동정 실험은 식품공전(MFDS 2019)에 따라 실험하였으며, TSB 증균액을 mannitol egg-yolk polymyxin agar(MYP, Mbcell, Seoul, Korea) 배지에 도말한 후 30℃에서 24시간 배양하였다. 배양된 집락 중 분홍색 집락 주변에 lecithinase를 생성하는 집락을 선별하였다.
cereus를 TSA에 획선도말하여 30℃에서 24시간 계대배양하였다. 순수 분리한 B. cereus 집락을 취하여 boiling method(Lee 등 2018)로 DNA를 추출하여 template로 사용하였다. B.

성능/효과

cereus의 독소 유전자 패턴은 Table 5에 나타내었다. B. cereus 독소유전자 중 hblC-nheA-entFM-CytK-bceT를 보유하고 있는 패턴 1이 47.0%로 가장 높은 분포를 나타내었으며, hblC-nheA-entFM-CytK를 보유하고 있는 패턴 2가 14.7%, hblC-nheA-entFM-bceT를 보유하고 있는 패턴 3이 11.7%, hblC-nheA-entFM를 보유하고 있는 패턴 4가 11.7%로 나타났다.
cereus의 cytK 독소 유전자 보유현황은 매우 다양하여 13~57%를 나타내며, 구토독소를 생산하는 ces 유전자의 보유는 매우 드물다는 보고(Lund 등 2000; Ehling-Schulz 등 2006)와 유사한 결과를 나타내었다. B. cereus가 생산하는 대표적인 설사독소인 HBL 독소 생산능은 58.8%로 hblC 독소 유전자 보유현황에 비해 낮은 결과를 나타내었다. 이러한 결과는 HBL 독소는 hblC, hblD, hblA 독소 유전자가 모두 존재하여야 생산된다는 보고(Kim 등 2010)로 보아 hblC 독소유전자를 보유한 B.
8%가 독소 단백질을 생산하고 있어 식중독 위험성은 상존하는 것으로 판단되었다. 따라서 B. cereus 오염도가 상대적으로 낮은 GAP 채소류 보급을 확대하고, 반드시 세척 후 섭취하여야 하는 친환경 및 GAP 인증 채소류의 특징을 소비자에게 정확하게 교육하여 식중독을 예방하여야 할 것으로 판단되었다.
8%가 HBL독소 단백질을 생산하고 있어 친환경 채소류와 GAP 인증 채소류 생식에 따른 식중독 위험성은 상존하는 것으로 판단되었다. 따라서 반드시 세척 후 섭취하여야 하는 친환경 채소류와 GAP 인증 채소류의 특징을 소비자가 정확하게 인지하도록 홍보하고, B. cereus 오염도가 상대적으로 낮은 GAP 채소류 보급 확대가 필요한 것으로 판단되었다.
2%)로 나타났으며, 구토독소를 생산하는 cer 유전자는 검출되지 않았다. 또한, 분리된 B. cereus 모두 하나 이상의 독소 유전자를 보유하고, 58.8%가 독소 단백질을 생산하고 있어 식중독 위험성은 상존하는 것으로 판단되었다. 따라서 B.
cereus에 오염되었다는 보고(Lee 등 2016)에 비해 매우 높은 오염도를 나타내어 친환경 채소류와 GAP 인증 채소류에 의한 식중독 위험성은 상존하는 것으로 판단되었다. 또한, 친환경 채소류의 경우 75.0%에서 B. cereus가 검출된 것에 비하여 GAP 인증 채소류의 경우, 44.4%에서 B. cereus가 검출되었다. 이러한 결과는 친환경 채소류의 경우 유기합성 농약과 화학비료의 사용만을 제한한 것에(Kwon & Cho 2019) 비하여 GAP 인증 채소류의 경우 농산물 생산 전 단계에 걸쳐 잔류농약과 유해미생물 등을 관리하기(Yoon DH 2018) 때문인 것으로 판단되었다.
cereus의 주요 임상증상은 복통, 설사, 구토 등이 있으며 통상 3일 이내에 자연 치유되는 것으로 보고되고 있다(Schoeni & Wong 2005). 본 실험결과, entFM 100%, nheA 97.0%, hblC 88.2% 검출되어 채소류에서 분리된 B. cereus의 주요 독소 유전자로 나타났으며, 이러한 결과는 식품과 환자 가검물에서 분리된 B. cereus에서 hblCDA 유전자가 86%, 90% 검출되었고, 선식, 곡류 및 식품에서 분리된 B. cereus에서 nheA 독소 유전자가 각각 74~97% 검출되었으며, 선식에서 분리된 B. cereus의 경우 entFM 독소 유전자를 100% 보유하였다는 보고(Kim 등 2011; Chon 등 2012)와 유사한 결과를 나타내었다. 또한, B.
cereus는 포자를 형성하는 Gram 양성 간균으로 토양에 널리 분포되어 있으며, 식품의 부패와 식중독을 유발하는 세균으로 열과 화학물질에 대한 저항력이 큰 것으로 보고되고(Kotiranta 등 2000) 있다. 본 연구결과, 채소류 중 69.3%가 B. cereus에 오염된 것으로 나타났으며, 이러한 결과는 실험에 사용된 상추(lettuce) 중 97.2%가 B. cereus에 오염되었다는 보고(Sung 등 2017)에 비해 낮은 오염도를 나타내었다. 그러나 청경채(bok choy) 등 채소류에서 38.
cereus 검출율이 낮게 나타났다. 분리된 B. cereus의 주요 독소 유전자는 entFM(100%), nheA(97.0%), hblC(88.2%)로 나타났으며, 구토독소를 생산하는 cer 유전자는 검출되지 않았다. 또한, 분리된 B.
2%) 순으로 나타났으며, 구토독소 유전자는 검출되지 않았다. 식중독을 일으키는 독소 단백질인 hemolysin BL(HBL)은 34균주 중 20균주(58.8%)에서 검출되어 친환경 채소류와 GAP 인증 채소류에 의한 식중독 위험성이 상존하는 것으로 나타났다. 채소류에서 분리된 B.
cereus의 독소유전자 분포는 Table 4에 나타내었다. 신선편의 채소류에서 분리된 B. cereus 34 균주의 설사 독소유전자는 entFM 34주(100%), nheA 33주 (97.0%), hblC 30주(88.2%) 순으로 나타났으며, 구토독소 유전자는 검출되지 않았다. 식중독을 일으키는 독소 단백질인 hemolysin BL(HBL)은 34균주 중 20균주(58.
이러한 결과를 종합하여 볼 때, 친환경 채소류와 GAP 인증 채소류의 B. cereus 오염도가 69.3%로 높게 나타나고, 분리된 B. cereus 모두 하나 이상의 독소 유전자를 보유하고 있었으며, 58.8%가 HBL독소 단백질을 생산하고 있어 친환경 채소류와 GAP 인증 채소류 생식에 따른 식중독 위험성은 상존하는 것으로 판단되었다. 따라서 반드시 세척 후 섭취하여야 하는 친환경 채소류와 GAP 인증 채소류의 특징을 소비자가 정확하게 인지하도록 홍보하고, B.
nheA, entFM, cytK, becT, cer 독소 유전자를 확인은 PCR을 이용하였다. 채소류 총 49건 중 34건(69.3%)에서 B. cereus가 검출되었고, 친환경 채소류 75.0%, GAP 인증 채소류 44.4%로 GAP 인증 채소류의 B. cereus 검출율이 낮게 나타났다. 분리된 B.
cereus 오염도는 Table 2에 나타내었다. 채소류 총 49건 중 34건(69.3%)에서 B. cereus가 검출되었으며, 깻잎(perilla leaf), 민들레(Korean dandelion)에서는 100% 검출되어 가장 높은 검출률을 나타내었다. 특히 상추(lettuce)는 17건 중 14건, 치커리(chicory) 6건 중 5건, 케일은 5건 중 4건, 쌈추(Korean cabbage)는 5건 중 3건에서 B.
cereus가 검출되었다. 채소류를 GAP 인증 채소류와 친환경 채소류 (유기농, 무농약)로 구분하여 B. cereus 오염도를 분석한 결과, 친환경 채소류 중 무농약 채소가 25건 중 18건(72.0%), 유기농 채소가 15건 중 12건(80.0%) 검출되었으며, GAP 인증 채소류는 9건 중 4건(44.4%)이 검출되어 상대적으로 GAP 인증 채소류의 B. cereus 오염도가 낮게 나타났다 (Table 3).

후속연구

2006년 국내 도입된 GAP 인증제도는 2017년 현재 8,600 농가가 인증받았으며, 대상 면적도 2006년 1,373 ha에서 2017년 103,000 ha로 증가하고 있다(Yoon DH 2018). 따라서 신선편의 채소류 중 친환경 및 GAP 인증 채소류에 대한 미생물학적 안전성 평가가 필요하다고 하겠다. 그러나 현재까지 연구는 주로 새싹채소 및 생식용 채소류의 미생물 오염도 분석에 한정되어 있고(Bae 등 2011; Kang 등 2011; Lee 등 2016; Sung 등 2017; Kim 등 2019b), 시중 유통 중인 친환경 채소류와 GAP 인증 채소류에 대한 미생물 오염도 평가는 매우 미약한 실정이다.
따라서 생식용으로 재배하는 채소류의 경우, 친환경농산물 인증과 더불어 GAP 인증에 적합하도록 재배하여 유해미생물에 의한 오염을 저감화하여야 할 것으로 판단되었다. 또한, 세척 후 섭취하여야 하는 친환경 채소류와 GAP 인증 채소류의 특성을 정확하게 홍보해야 할 것으로 판단되었다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	대표적인 생활습관병은?	평균수명 연장에 따른 고령 인구 증가로 우리나라는 2018년 고령사회로 진입하였으며, 대표적인 생활습관병인 고혈압, 당뇨, 고지혈증 등의 유병인구가 증가하고 있다(Seo 등 2019). 이러한 생활습관병을 예방하고, 건강한 삶을 유지하기 위해 운동과 식습관 개선에 사회적 관심이 집중되고 있으며(Kang JK 2004; Her ES 2017), 식이섬유와 미네랄, 비타민을 풍부하게 함유하고 있는 채소류 소비가 증가하고 있다(Jung 등 2006; Min 등 2016).
	채소류에 의한 식중독 사고 사례는?	채소류에 의한 식중독 사고는 학교급식으로 납품된 김치에 의한 집단식중독 사고(Lee 등 2016)와 2006년 미국에서 발생한 시금치 섭취에 따른 집단식중독 사고 등이 있으며, 농산물에 의한 식중독의 대부분은 생식용 채소에 기인하는 것으로 보고되고 있다(CDC 2006). 국내 생식용 채소류의 식중독세균 오염도를 분석한 결과에 따르면 Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens는 매우 낮은 검출률을 나타내었으나, Bacillus cereus는 상추(lettuce) 36건 중 35건에서 검출되는 등 매우 높은 검출률을 나타내었다고 보고되고(Sung 등 2017) 있다.
	농산물우수관리제도의 국내 도입 시기는?	국내에서도 농산물의 안전성을 확보하기 위해 농산물의 생산에서 유통단계까지 농산물에 오염될 수 있는 잔류농약과 유해 미생물 등을 관리할 수 있는 농산물우수관리제도(good agricultural practices, GAP)(Yoon DH 2018)와 유기 합성 농약을 사용하지 아니하고, 화학비료를 사용하지 않거나 권장량의 1/3 이내로 사용한 친환경농산물(environmentfriendly agricultural product) 인증제도를 운영하고 있다(Kwon & Cho 2019). 2006년 국내 도입된 GAP 인증제도는 2017년 현재 8,600 농가가 인증받았으며, 대상 면적도 2006년 1,373 ha에서 2017년 103,000 ha로 증가하고 있다(Yoon DH 2018). 따라서 신선편의 채소류 중 친환경 및 GAP 인증 채소류에 대한 미생물학적 안전성 평가가 필요하다고 하겠다.

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U.S. Food and Drug Administration [FDA]. 2008. Guidance for Industry: Guide to Minimize Microbial Food Safety Hazards of Fresh-cut Fruits and Vegetables. Available from https://www.fda.gov/regulatory-information/searchfda-guidance-documents/guidance-industry-guide-minimize-microbial-food-safety-hazards-fresh-cut-fruits-and-vegetables [cited 21 December 2019]
Yoon DH. 2018. Current situation and development strategy for the Korea-good agricultural practices system. J Food Hyg Saf 33:1-11

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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