과산화수소 자극으로 활성화된 C6 성상교세포에 대한 맥문동추출물의 조절 효능 연구 A Study on the Effect of Liriopis tuber water extract on Hydrogen Peroxide-stimulated C6 Astrocyte Cells원문보기
Objective : To identify the effects of the water extract of Liriope platyphylla tuber (Liriopis tuber, LT) on the activation of astocytes, we investigated the regulatory effects of LT extract on H2O2-induced oxidative damage in C6 rat astrocytes. Methods : LT extract was extracted with boiling water...
Objective : To identify the effects of the water extract of Liriope platyphylla tuber (Liriopis tuber, LT) on the activation of astocytes, we investigated the regulatory effects of LT extract on H2O2-induced oxidative damage in C6 rat astrocytes. Methods : LT extract was extracted with boiling water. C6 cell line were treated with LT extract at 1, 2, and 3 mg/㎖ or without for 30 min and then stimulated with H2O2 at 5 ㎛ for 24 hr. The cell viability was measured by MTT assay. The expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP), signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3), phospho-STAT3 (pSTAT3), cyclooxygenase (COX-2), Nuclear factor-κB (NF-κB), superoxide dismutase 2 (SOD2), heme oxygenase-1 (HO-1), catalase, Akt, phospho-Akt (p-Akt) phosphoinositide 3-kinases (PI3K), and protein kinase C alpha (PKCα) proteins were determined by Western blot, respectively. GFAP expression was also observed with immunocytochemistry under a fluorescence microscope. Results : LT extract induced cell proliferation in H2O2-stimulated C6 cells. LT extract significantly inhibited the expression of GFAP, NF-κB and COX-2 and increased the expression of HO-1 and the phosphorylation of STAT3 in H2O2-stimulated C6 cells. LT extract also significantly increased the phosphorylation of Akt and decreased the expression of PKCα in a dose-dependent manner in H2O2-stimulated C6 cells. Conclusions : LT extract can regulate H2O2-induced activation of astrocytes through inhibiting the expression of NF-κB, COX-2 and regulating Akt / HO-1, STAT3 or PKCα signaling pathway.
Objective : To identify the effects of the water extract of Liriope platyphylla tuber (Liriopis tuber, LT) on the activation of astocytes, we investigated the regulatory effects of LT extract on H2O2-induced oxidative damage in C6 rat astrocytes. Methods : LT extract was extracted with boiling water. C6 cell line were treated with LT extract at 1, 2, and 3 mg/㎖ or without for 30 min and then stimulated with H2O2 at 5 ㎛ for 24 hr. The cell viability was measured by MTT assay. The expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP), signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3), phospho-STAT3 (pSTAT3), cyclooxygenase (COX-2), Nuclear factor-κB (NF-κB), superoxide dismutase 2 (SOD2), heme oxygenase-1 (HO-1), catalase, Akt, phospho-Akt (p-Akt) phosphoinositide 3-kinases (PI3K), and protein kinase C alpha (PKCα) proteins were determined by Western blot, respectively. GFAP expression was also observed with immunocytochemistry under a fluorescence microscope. Results : LT extract induced cell proliferation in H2O2-stimulated C6 cells. LT extract significantly inhibited the expression of GFAP, NF-κB and COX-2 and increased the expression of HO-1 and the phosphorylation of STAT3 in H2O2-stimulated C6 cells. LT extract also significantly increased the phosphorylation of Akt and decreased the expression of PKCα in a dose-dependent manner in H2O2-stimulated C6 cells. Conclusions : LT extract can regulate H2O2-induced activation of astrocytes through inhibiting the expression of NF-κB, COX-2 and regulating Akt / HO-1, STAT3 or PKCα signaling pathway.
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문제 정의
GFAP는 성상교세포의 골격단백질로서 성상교세포 활성화의 지표이기도 하므로21), 본 연구에서는 맥문동추출물의 성상교세포 활성화 조절효과를 확인하기 위해 GFAP의 발현 변화를 확인하였다. 과산화수소 처리로 활성이 증가된 C6 성상교세포에서는 GFAP가 증가하며, 이는 맥문동추출물에 의해 농도 의존적으로 감소하였다.
그러나 ERK는 NF-κB 경로에 의존하여 증가한다고 알려져 있으므로30) 본 연구에서는 PI3K, Akt, PKCα등의 HO-1 증가 기전에 대한 맥문동추출물의 조절효과를 조사하였다.
따라서 본 연구에서는 맥문동 추출물이 성상교세포의 활성 조절에 어떤 영향을 주는지 그 효과와 기전을 조사하였다.
본 연구에서 C6 성상교세포 활성화에 대한 맥문동 물 추출물의 조절 효과 및 기전을 확인하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
맥문동 추출물에 의한 세포 보호 효과가 2 ㎎/㎖의 농도에서 가장 크게 나타난 것과 달리 성상교세포의 활성 억제 효과는 농도 의존적으로 나타났는데, 이는 맥문동 추출물에 의한 성상교세포의 활성화 억제 효과가 산화 스트레스에 의한 세포손상에 대한 억제 효과와는 별개임을 시사한다. 이에 맥문동추출물의 세포생존율 증가에 대한 기전으로서 항염증 및 항산화 작용을 확인해보기 위해 다양한 염증 단백질과 항산화효소 단백질의 발현을 확인해보았다.
제안 방법
C6 세포에서 astrocyte의 가장 특징적인 지표인 GFAP 발현에 대한 맥문동추출물(LT-W)의 효과를 확인하기 위해 면역세포화학염색(ICC)을 수행하였다. 즉, C6 세포를 Thermanox plastic cover slips(Nunc™, Thermo Fisher Scientific)에 분주하여 맥문동추출물을 전 처리하고, H2O2로 산화스트레스를 유발하여 배양하였다.
The histogram was calculated the ratio of GFAP expression per actin with mean ± SD of three independent experiments.
The histogram was calculated the ratio of each target expression per actin with mean ± SD of three independent experiments.
The histogram was calculated the ratio of each target expression per actin with mean±SD of three independent experiments.
각 단백질의 밴드를 Image J program(NIH, USA)을 이용하여 β-actin의 발현 정도와 비교한 발현 비율로 계산하여 histogram으로 나타내었다.
고정된 세포에 0.5% Triton X-100이 포함된 1× PBS(PBS-T)를 이용하여 20분간 반응시키고 1× PBS로 3회 세척한 후 5% BSA 용액에서 1시간동안 반응시켰다.
즉, C6 cell(2 × 104 cells/well) 을 24-well culture plate에 분주하여 37℃, 5% CO2 조건으로 하루 동안 배양한 후 맥문동추출물을 1, 2, 3, 4, 5 ㎎/㎖의 농도로 처리하여 24시간 배양하였다. 또한 LT-W를 1, 2, 3 ㎎/㎖ 처리하여 30분 간 배양한 후 산화적 스트레스를 유발하기 위하여 H2O2를 5.0 ㎛/㎖의 농도로 처리하여 24시간 배양하였다. 여기에 각 well 당 EZ-Cytox 용액을 10 ㎕ 씩 넣어 2시간 동안 배양하면서 환원반응을 유도하였다.
C6 성상교세포에서 맥문동추출물(LT-W)의 독성을 평가한 결과, LT-W을 5 ㎎/㎖ 농도까지 처리하였을 때 세포 생존도에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다(그림 1A). 또한 산화적 손상에 따른 세포생존도 감소에 대한 맥문동추출물의 억제 효과를 확인하기 위해 H2O2 처리 후 맥문동추출물을 처리하여 세포 증식유도 효과를 조사하였다. 그 결과, 맥문동추출물은 H2O2 처리 후 감소되는 세포 생존도를 처리 농도에 의존적으로 증가시키는 것을 확인하였다(그림 1B).
맥문동추출물(Liriopis tuber water extract, LT-W)은 맥문동 200 g에 정수된 물 2L를 넣고 95℃에서 3시간동안 1차 추출한 후 같은 비율로 2차 추출을 실시하였다. 추출물은 1호 와트만 거름종이(Whatman paper filter No.
반응이 끝난 세포는 1× PBS로 3회 세척한 후 Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG와 함께 1시간 실온에서 반응시키고 DAPI로 세포 핵을 염색한 후 mounting 용액을 이용하여 봉입한 후 형광현미경(Leica DM2500)으로 관찰하였다.
산화적 손상을 받은 성상교세포 활성화에 대한 맥문동추출물(LT-W)의 조절 효과를 평가하기 위해 C6 세포에서의 성상교세포 활성화 단백질인 GFAP의 발현 변화를 확인하였다. 그 결과, H2O2 처리 후 C6 세포 활성화에 따른 GFAP의 발현이 정상세포에 비해 유의적으로(p < 0.
상청액을 수집하여 Bradford’s assay(Bio-rad) 용액으로 단백질의 농도를 측정한 후 30 ㎍ 단백질을 SDS-PAGE 분리 하였다.
의 조건에서 배양하였다. 약 60%의 세포가 성장하였을 때 맥문동추출물(1.0, 2.0, 3.0 ㎎/㎖)을 전 처리한 30분 후 산화적 스트레스를 주기 위하여 H2O2를 5 ㎛/㎖의 농도로 처리하였다.
이를 통해 과산화수소에 의한 산화적 손상으로부터 맥문동추출물이 성상교세포를 보호할 수 있음을 알 수 있었다. 예비 연구를 통해 C6 성상교세포에서 과산화수소의 다양한 농도(1, 5, 10, 20, 50 ㎛) 처리는 농도에 의존적인 세포 생존율 감소를 나타내었으며, 5 ㎛ 농도에서 맥문동추출물에 의한 세포증식 유도효과가 가장 유의적인 것으로 나타나서 본 연구에서는 5 ㎛ 농도를 산화적 손상을 유도하기 위한 적정 농도로 설정하였다.
5)를 이용하여 15분씩 3회 세척한 후 HRP-conjugated 2차 항체와 실온에서 3시간 반응시켰다. 이를 다시 1x TBST로 3회 세척한 후 ECL 용액으로 염색하고 자동감광장치(Bio-Rad ChemiDoc)를 이용해서 단백질의 발현 정도를 확인하였다. 각 단백질의 밴드를 Image J program(NIH, USA)을 이용하여 β-actin의 발현 정도와 비교한 발현 비율로 계산하여 histogram으로 나타내었다.
여기에 각 well 당 EZ-Cytox 용액을 10 ㎕ 씩 넣어 2시간 동안 배양하면서 환원반응을 유도하였다. 이후 발색정도를 microplate reader를 이용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 세포독성정도는 세포만 배양한 대조군에서의 100% 생존도를 기준으로 상대적인 세포생존도(cell viability)를 계산하였다.
즉, C6 cell(2 × 104 cells/well) 을 24-well culture plate에 분주하여 37℃, 5% CO2 조건으로 하루 동안 배양한 후 맥문동추출물을 1, 2, 3, 4, 5 ㎎/㎖의 농도로 처리하여 24시간 배양하였다.
C6 세포에서 발현되는 염증단백질(NF-kB, COX-2), 항산화효소 단백질(HO-1, Catalase, SOD), 성상세포 활성 단백질(GFAP) 및 신호 조절 단백질(STAT3, Akt, PKCα)에 대한 맥문동추출물(LT-W)의 조절 효과를 확인하기 위해 western blot을 수행하였다. 즉, C6 세포를 60 ㎜ culture dish에서 하룻밤 배양한 다음 서로 다른 농도의 LT-W(1.0, 2.0, 3.0 ㎎/㎖)을 전 처리한 30분 후 산화적 스트레스를 주기 위하여 H2O2를 5 ㎛/㎖의 농도로 처리하고 24시간 동안 배양해주었다. 각 세포를 수거하여 3,000 rpm에서 5분간 원심분리 한 후 RIPA buffer를 넣고 homogenizer를 이용하여 마쇄한 후 4℃, 14,000 rpm에서 20분 동안 원심 분리하였다.
맥문동추출물(Liriopis tuber water extract, LT-W)은 맥문동 200 g에 정수된 물 2L를 넣고 95℃에서 3시간동안 1차 추출한 후 같은 비율로 2차 추출을 실시하였다. 추출물은 1호 와트만 거름종이(Whatman paper filter No.1)로 거르고, 회전식 감압농축기를 이용하여 농축한 후 동결건조기를 이용하여 건조시켰다. 이때 수율은 88.
특히 맥문동추출물의 1, 2, 3 ㎎/㎖ 처리 농도에서 H2O2 처리군에 비해 유의적인(p < 0.001, respectively) 증가를 나타내어 이후 실험에서는 이 농도 범위에서 맥문동추출물의 효능을 평가하였다.
대상 데이터
본 실험에 사용된 맥문동(Liriope platyphylla Wang et Tang, 한국산)은 광명당제약(울산, 한국)으로부터 표준약재를 구입한 뒤 동국대학교 한의과대학 본초학교실에서 정선하여 추출물 제조에 사용하였다.
본 실험에 사용된 시약으로는 Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), penicillin/streptomycin(Corning, NY, USA), Fetal bovin serum (FBS)(Merck Millipore, Temecula, CA, USA), EZ-Cytox (DoGenBio Co., Ltd. Korea), AntiGFAP(Santa Cruz, Dallas, MA, USA), Anti-Akt, phosphoAkt(R&D System Inc., MN, USA ), COX-2(Cayman Chemical, MI, USA), Anti-NF-κB, STAT-3, phosphoSTAT3, PKCα, HO-1, SOD, Catalase(Cell signaling, Danvers, MA, USA), β-actin(Sigma-Aldrich, MO, USA), goat-anti-mouse, goat-anti-rabbit(Bio-rad, CA, USA), radioimmunoprecipitation assay(RIPA: Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 등이 있으며, 형광현미경(LEICA, Wetzler, Germany), Microtiter plate reader (ASYS, Austria), 약재추출기(Daihan saientific, Korea), 회전식감압농축기(Eyela Co., Ltd, Japan), 동결건조기(Ilshin Lab Co., Ltd, Korea), 자동감광장치(ChemiDoc; Biorad, USA) 등의 기기를 실험에 사용하였다.
실험에 사용된 세포는 랫드의 성상교세포(rat brain glial cell line)인 C6 세포로 ATCC사(CCL-107™, Manassas, VA, USA)로부터 구입하여 사용하였으며, 10% FBS와 1% penicillin/streptozotocin이 함유된 DMEM을 배양액으로 하여 37℃, 5% CO2의 조건에서 배양하였다.
데이터처리
실험결과는 GraphPad Prism 5.0 분석프로그램(GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)을 이용해 histogram으로 나타내었고 유의성을 one-way ANOVA와 Turkey’s test를 통해 검정하여 95% confidence interval 이상인 경우를 유의성 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
C6 세포에서 LT-W의 독성 농도를 평가하기 위해 EZCytox assay를 수행하였다. 즉, C6 cell(2 × 104 cells/well) 을 24-well culture plate에 분주하여 37℃, 5% CO2 조건으로 하루 동안 배양한 후 맥문동추출물을 1, 2, 3, 4, 5 ㎎/㎖의 농도로 처리하여 24시간 배양하였다.
C6 세포에서 발현되는 염증단백질(NF-kB, COX-2), 항산화효소 단백질(HO-1, Catalase, SOD), 성상세포 활성 단백질(GFAP) 및 신호 조절 단백질(STAT3, Akt, PKCα)에 대한 맥문동추출물(LT-W)의 조절 효과를 확인하기 위해 western blot을 수행하였다.
at 5 ㎛ for 24 hr. Cell viability was measured by MTT assay. Data was presented as mean±SD of three independent experiments.
산화적 스트레스가 유발된 성상교세포에서의 염증반응 유발에 대한 맥문동추출물의 조절 효과를 확인하기 위해 NF-κB에 의해 증가하는 염증단백질인 COX-2의 발현 변화를 Western blot 방법으로 조사하였다.
산화적 스트레스가 유발된 성상교세포에서의 항산화효소 단백질 발현에 대한 맥문동추출물(LT-W)의 조절 효과를 확인하기 위해 SOD2, HO-1, catalase의 발현 변화를 Western blot 방법으로 조사하였다. 그 결과, SOD2의 발현은 맥문동 추출물 처리에 의해 증가하는 경향은 나타났으나 유의적인 결과가 나타나지는 않았으며(그림 4A), HO-1의 발현은 H2O2 처리에 의해 정상군에 비해 유의적으로(p < 0.
이에 나아가, 성상교세포 활성 조절 인자로서 HO-1에 대한 LT-W의 조절 효과를 확인하기 위해 HO-1의 상위 신호전달분자인 PI3K 및 Akt24), PKCα25) 발현 변화를 Western blot 방법으로 조사하였다.
2. 맥문동 물 추출물은 STAT3의 활성화를 유도하여 NF- κB와 COX-2의 발현을 억제하고 이는 성상교세포의 활성 방향 조절 및 신경 보호 기전과 연관이 있다.
3. 맥문동 물 추출물은 Akt/HO-1 경로의 활성을 유도하며 이는 STAT3과 NF-κB 경로의 활성을 억제하여 성상교세포의 활성 억제 및 세포생존률의 변화에 관여한다.
4. 맥문동 물 추출물은 PKCα의 활성을 감소시키는 것으로 NF-κB의 활성을 억제한다.
GFAP의 발현에 관여하는 인자로서 STAT320)의 활성화 및 NF-κB21)의 발현 변화를 조사한 결과, H2O2처리에 의해 STAT3의 인산화 단백질(p-STAT3)의 발현이 정상군에 비해 유의적으로 증가하였으며(p < 0.01), 이러한 증가는 맥문동추출물(LT-W)의 처리 후 더욱 유의적인 증가(p < 0.05 for 1 ㎎/㎖, p < 0.05 for 3 ㎎/㎖)를 나타낸 반면(그림 3A) NF- κB의 발현은 대조군에 비해 유의하게 감소(p < 0.05 for 3 ㎎ /㎖)하였다(그림 3B).
결론적으로 맥문동 추출물은 과산화수소 처리로 산화적 스트레스가 유발되었을 때 성상교세포에서의 활성화 유도를 Akt/HO-1의 경로 활성 증가를 통해 조절할 수 있으며, 성상교세포의 활성 방향을 STAT3 기전의 활성 증가와 PKC/NF-κB 기전 억제를 통해 조절할 수 있음을 알 수 있었다.
그러나 ERK는 NF-κB 경로에 의존하여 증가한다고 알려져 있으므로30) 본 연구에서는 PI3K, Akt, PKCα등의 HO-1 증가 기전에 대한 맥문동추출물의 조절효과를 조사하였다. 그 결과 p-Akt/Akt의 비율이 농도에 비례하여 유의적으로 상승하였으며, 이는 맥문동추출물에 의한 HO-1의 증가가 Akt/Nrf2/ HO-1 경로 활성화에 의해 유도됨을 알 수 있었다. 이는 기존 연구에서 맥문동 추출물이 Akt 경로를 활성화시킨다는 보고와 일치한다9).
그 결과, Akt의 인산화는 LT-W 처리에 의해 증가하였으며 특히 3 ㎎/㎖ 처리군에서 대조군에 비해 유의적인(p < 0.01) 증가를 나타내었다(그림 5A).
그 결과, COX-2의 발현은 맥문동추출물 처리에 의해 감소하였으며, 특히 2 ㎎/㎖(p < 0.01)과 3 ㎎/㎖(p < 0.05) 처리군에서 대조군에 비해 유의적인 감소를 나타내었다(그림 3C).
그 결과, H2O2 처리 후 C6 세포 활성화에 따른 GFAP의 발현이 정상세포에 비해 유의적으로(p < 0.01) 증가하였으며, 이는 맥문동추출물의 처리 농도에 의존적으로, 또한 H2O2 처리군에 비해 유의적으로(p < 0.05 for 1 ㎎/㎖, p < 0.05 for 1 ㎎/㎖, p < 0.01 for 3 ㎎/㎖) 감소하는 것으로 나타났다(그림 2A).
그 결과, SOD2의 발현은 맥문동 추출물 처리에 의해 증가하는 경향은 나타났으나 유의적인 결과가 나타나지는 않았으며(그림 4A), HO-1의 발현은 H2O2 처리에 의해 정상군에 비해 유의적으로(p < 0.05) 증가하였고, 이는 맥문동추출물 3 ㎎/㎖(p < 0.05) 처리군에서 유의적으로 더욱 증가하였다(그림 4B).
또한 산화적 손상에 따른 세포생존도 감소에 대한 맥문동추출물의 억제 효과를 확인하기 위해 H2O2 처리 후 맥문동추출물을 처리하여 세포 증식유도 효과를 조사하였다. 그 결과, 맥문동추출물은 H2O2 처리 후 감소되는 세포 생존도를 처리 농도에 의존적으로 증가시키는 것을 확인하였다(그림 1B). 특히 맥문동추출물의 1, 2, 3 ㎎/㎖ 처리 농도에서 H2O2 처리군에 비해 유의적인(p < 0.
따라서 맥문동 추출물은 성상교세포에서 Akt 및 PKCα기전의 조절을 통해 활성을 조절할 수 있는 것으로 나타났다.
따라서 맥문동추출물이 산화적 손상에 따른 성상교세포 활성화를 조절하는 것에 STAT3의 활성화 및 NF-κB/GFAP 기전 제어가 관여된 것을 알 수 있었다.
한편 catalase의 발현은 맥문동추출물 처리에 따라 감소하는 경향을 나타내었으나 유의하지는 않았다(그림 4C). 따라서 성상교세포에서 맥문동추출물은 산화적 손상에 따라 항산화 단백질, 특히 HO-1의 발현을 증가시킴으로써 산화스트레스를 조절함을 알 수 있었다.
05) 처리군에서 대조군에 비해 유의적인 감소를 나타내었다(그림 3C). 따라서 성상교세포에서 맥문동추출물은 산화적 손상에 따른 염증단백질 발현을 감소시킴으로써 염증 반응을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
또한 GFAP의 발현을 세포 염색을 통해 확인한 결과, H2O2에 의한 산화적 손상으로 GFAP-발현 세포들이 증가하였고, 이는 맥문동추출물 3 ㎎/㎖을 처리한 후 감소하는 것을 관찰할 수 있었다(그림 2B).
또한 PKCα의 발현은 정상군에 비해 대조군에서 유의적인(p < 0.01) 증가를 나타내었고, 이는 LT-W에 의해 감소하였으며 특히 2 ㎎/㎖ 농도에서 유의적인(p < 0.05) 감소를 나타내었다(그림 5C).
과산화수소 처리로 활성이 증가된 C6 성상교세포에서는 GFAP가 증가하며, 이는 맥문동추출물에 의해 농도 의존적으로 감소하였다. 맥문동 추출물에 의한 세포 보호 효과가 2 ㎎/㎖의 농도에서 가장 크게 나타난 것과 달리 성상교세포의 활성 억제 효과는 농도 의존적으로 나타났는데, 이는 맥문동 추출물에 의한 성상교세포의 활성화 억제 효과가 산화 스트레스에 의한 세포손상에 대한 억제 효과와는 별개임을 시사한다. 이에 맥문동추출물의 세포생존율 증가에 대한 기전으로서 항염증 및 항산화 작용을 확인해보기 위해 다양한 염증 단백질과 항산화효소 단백질의 발현을 확인해보았다.
본 연구에서는 C6 성상교세포에서 PKCα의 발현이 과산화수소 처리에 의해 증가하며, 이는 맥문동추출물 처리에 의해 감소하는 것을 확인하였다.
. 본 연구의 항산화효소 단백질 발현 변화에서 맥문동추 출물은 특히 HO-1의 발현을 농도에 의존적으로 증가시켰는데, 이는 맥문동추출물이 HO-1의 발현 증가에 직접적으로 관여 하여 성상교세포의 활성을 전반적으로 억제함을 시사한다.
또한 맥문동추출물은 항산화효소인 SOD와 HO-1의 발현을 처리 농도에 의존적으로 증가시켰다. 이러한 결과는 맥문동추출물이 성상교세포에서 과산화수소에 의한 염증반응 유발과 산화적 손상을 억제시켜줄 수 있음을 의미한다
이를 종합해볼 때, 맥문동추출물에 의한 세포생존률 변화 양상은 저농도(1~2 ㎎/㎖)에서는 STAT3의 활성을 촉진하고 PI3K/Akt/HO-1 경로를 활성화하여 NF-κB/COX-2의 활성을 억제하는 것으로서 세포생존률이 증가하지만, 고농도(3 ㎎/㎖)에서는 STAT3의 활성까지 HO-1에 의해 억제되면서 전체적인 세포활성이 감소하는 것으로써 세포생존률이 다시 소폭 감소하는 것으로 생각된다.
이에 과산화수소 자극으로 산화스트레스가 유발된 C6 성상교세포에서 맥문동추출물이 세포증식에 미치는 효과를 확인한 결과, 맥문동추출물(LT-W)은 처리 농도에 의존적으로 과산화수소에 의해 감소된 세포 생존도를 증가시켰으며 특히 2 ㎎/㎖의 농도에서 대조군에 비해 유의적인 세포증식 유도 효과를 나타내었다. 이를 통해 과산화수소에 의한 산화적 손상으로부터 맥문동추출물이 성상교세포를 보호할 수 있음을 알 수 있었다. 예비 연구를 통해 C6 성상교세포에서 과산화수소의 다양한 농도(1, 5, 10, 20, 50 ㎛) 처리는 농도에 의존적인 세포 생존율 감소를 나타내었으며, 5 ㎛ 농도에서 맥문동추출물에 의한 세포증식 유도효과가 가장 유의적인 것으로 나타나서 본 연구에서는 5 ㎛ 농도를 산화적 손상을 유도하기 위한 적정 농도로 설정하였다.
이에 본 연구에서 STAT3, NF-κB, COX-2의 활성 및 발현량을 조사한 결과, 맥문동 추출물은 과산화수소 자극으로 활성화된 C6 성상교세포에서 STAT3의 인산화 발현을 증가시켰으며, 염증 단백질인 COX-2와 NF-κB의 발현은 농도 의존적인 감소를 나타내었다. 이를 통해 맥문동 추출물이 성상교세포의 활성화 양상을 조절하여, 신경성장인자의 발현 증가19)에 직접적으로 영향을 미침으로써 맥문동 추출물의 신경 보호 효과가 나타날 수 있음을 알 수 있었다.
성상교세포는 미세아교세포 등과 함께 신경 조직에서의 면역 반응에 중요한 역할을 담당하고 있으므로26), 맥문동 추출물의 효과가 성상교세포에 작용 할 것으로 예상되었다. 이에 과산화수소 자극으로 산화스트레스가 유발된 C6 성상교세포에서 맥문동추출물이 세포증식에 미치는 효과를 확인한 결과, 맥문동추출물(LT-W)은 처리 농도에 의존적으로 과산화수소에 의해 감소된 세포 생존도를 증가시켰으며 특히 2 ㎎/㎖의 농도에서 대조군에 비해 유의적인 세포증식 유도 효과를 나타내었다. 이를 통해 과산화수소에 의한 산화적 손상으로부터 맥문동추출물이 성상교세포를 보호할 수 있음을 알 수 있었다.
이에 본 연구에서 STAT3, NF-κB, COX-2의 활성 및 발현량을 조사한 결과, 맥문동 추출물은 과산화수소 자극으로 활성화된 C6 성상교세포에서 STAT3의 인산화 발현을 증가시켰으며, 염증 단백질인 COX-2와 NF-κB의 발현은 농도 의존적인 감소를 나타내었다.
후속연구
결론적으로 맥문동 물 추출물은 성상교세포의 활성을 여러 방면에서 조절함으로써 뇌 신경보호에도 기여할 수 있을 것으로 사료된다.
참고문헌 (32)
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