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문제 정의
- , 2018). 본 연구에서는 HFD/STZ유도 당뇨 랫드에 9주간 추출물을 경구투여시켜 여주가 혈당 및 글루카곤에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
- 1040549-201603-BM-004)에서 여주를 섭취한 시험군은 위약군과 비교하여 경구당부하 후 혈당과 인슐린, 글루카곤이 감소하였고 혈당과 글루카곤은 통계적인 유의성을 나타내었다. 여주를 활용한 항당뇨 효능연구에 있어서 그 기전으로 인슐린-식후혈당간의 관계는 널리 알려져 있으나 이와 같이 글루카곤과의 연관성을 보인경우는 드물었기에 작용기전을 확인하고자 본 실험을 수행하였다. 그 결과 미숙여주주정추출분말 경구투여군은 경구당부하검사(OGTT) 120분과 곡선하면적(AUC)에서 유의적인 혈당감소를 보였으며, 글루카곤 또한 유도군 대비 유의적으로 감소하였음을 확인하였다.
제안 방법
- 5주령된 Sprague-Dawley (Crl:CD(SD)) rat를 Orient BIO(Seongnam, Korea)에서 구입하였다. 7일간의 검역, 순화 기간을 거친 후, 모든 동물에 고지방 식이(D12492, 60% kcal from fat, Research Diet Inc, USA)를 급이하고 고지방식이 1주일 후에 STZ(Sigma, USA, 30mg/kg in 0.1M citric acid buffer, pH 4.5)를 1ml/kg 용량으로 1주 간격으로 2회 복강 내 투여 하여 당뇨를 유발 시켰다. 동물실험은 ㈜케이피씨(Gwangju, Korea) 동물실험윤리위원회의 승인(P202001) 후 진행되었다.
- Insulin과 Glucagon의 level은 insulin ELISA kit (Morinaga Ultrasensitive Rat Insulin Elisa kit, Morinaga Institute of Biological Science, Japan)와 Glucagon Elisa kit (Rat Glucagon ELISA Kit, R&D Systems, USA)로 측정되었으며 micro plate reader (SpectraMax M2, Molecular Devices, USA)를 이용하여 450/630 nm에서 흡광도를 확인하였다.
- 군분리 당일에 전 개체를 대상으로 비절식 혈당 및 당화혈색소를 측정하였다. 비절식 혈당과 당화혈색소 검사는 동물의 꼬리 미부 끝부분을 scissor로 미세하게 절개하여 자연스럽게 흘러나오는 전혈을 통해 검사하였고 혈당은 간이용 혈당 측정기인 Accu-CHEKⓇ (Performa, Roche Diagnostics GmbH, Germany), 당화혈색소는 당화혈색소 키트 분석기 (DCA Vantage TM analyser, SIEMENS, UK)를 이용하여 측정하였다.
- 군분리는 측정한 비절식혈당, 당화혈색소, 혈중 Insulin 및 혈중 Glucagon 검사 값을 기준으로 측정값의 평균이 유사하도록 Normal, HFD/STZ 군, BME 62.5 투여 HFD/STZ군(62.5 mg/kg body weight/day), BME 125 투여 HFD/STZ군(125 mg/kg body weight/day), BME 투여 250 HFD/STZ군(250 mg/kg body weight/day) 총 5개의 군 (n = 6)으로 군분리를 실시 하였다. 모든 동물의 체중과 사료 섭취량은 매주 1회 측정하였다.
- 당화 혈색소의 측정은 군 분리 당일과 미숙여주주정 추출분말 투여 개시 후 9주차에 측정하였고, 당화혈색소 키트 분석기 (DCA Vantage TM analyser, SIEMENS, UK)를 이용하여 측정하였다.
- 면역조직화학적 염색 후에는 Mayer's hematoxylin(MUTO, Japan)으로 감별 염색한 뒤 탈수과정을 거쳐 봉입하한 후 광학현미경(Model Eclipse 80i, Nikon, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
- 면역혈청으로는 Anti-insulin antibody(Abcam, Cambridge, MA, USA), Anti-glucagon antibody(Abcam, Cambridge, MA, USA)을 각각 1:100, 1:1000으로 희석한 용액을 사용하여 4°C의 습윤 chamber에서 24시간 반응시켰고, 2차 항체로는 biotinylated universa antibody (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)를 사용하였으며, ABC reagent(Vector Labs, Burlingame, CA, USA)에 1시간 반응시켰다.
- 경구 당부하 시험은 미숙여주주정추출분말 투여 개시 후 9주차에 진행하였다. 모든 동물을 경구 당부하 시험 전날부터 16시간 동안 절식시키고 혈당을 측정한 후 2g/kg의 glucose (D-(+)-Glucose, Sigma, USA)를 경구투여한 후 15분, 30분, 60분과 120분에 혈당을 측정하였다. 혈당의 측정은 혈당 측정기인 Accu-CHEKⓇ을 이용하여 동물의 꼬리 미부 끝부분을 scissor로 미세하게 절개하여 자연스럽게 흘러나오는 whole blood로 측정하였다.
- 5 mg/kg body weight/day), BME 125 투여 HFD/STZ군(125 mg/kg body weight/day), BME 투여 250 HFD/STZ군(250 mg/kg body weight/day) 총 5개의 군 (n = 6)으로 군분리를 실시 하였다. 모든 동물의 체중과 사료 섭취량은 매주 1회 측정하였다.
- 실험에 사용된 시료는 경상남도 함양에서 재배한 국내산 미숙여주를 구매하여 사용하였다. 미숙여주에 70% 주정알콜(ethanol)을 원재료대비 15배 투입하여 70℃에서 4시간 동안 1차 추출한 뒤 여과하고 남은 잔사에 다시 10배수의 용매를 투입한뒤 2시간동안 2차 추출하였다. 추출물은 감압농축기를 사용하여 15~20 brix로 농축한 뒤 덱스트린(49%), 레시틴(1%)의 비율로 혼합하고 분무건조한 미숙여주주정추출분말(Sugar Katcher S52™)를 사용하였다.
- 미숙여주주정추출분말 경구투여가 HFD/STZ rat의 경구 당부하 시 미치는 영향을 알아보고자 glucose를 경구 투여 후 일정 시간(0, 15, 30, 60, 120분)에 채혈하여 측정한 결과를 Fig. 1, Table 3에 나타내었다. Table 3의 결과에 따르면 glucose 투여 후 15분 후부터 혈당이 상승되기 시작하였다.
- 미숙여주주정추출분말의 경구투여로 인한 조직의 변화를 알아 보기 위해 조직학적 검사를 진행하였다(Fig. 2). 조직학적 분석을 토대로 산출된 췌장섬의 수 및 직경, 효소원과립의 비율, insulin, glucagon 분비세포의 수 및 비율의 변화는 Table 5에 나타내었다.
- 보다 명확한 조직병리학적 관찰을 위해, 평균 췌장섬 수 (islets/cm2 of pancreas) 및 직경(μm)과 외분비 단위 면적당 효소원(zymogen) 과립이 차지하는 비율 (%/mm2 of exocrine pancreas), insulin과 glucagon 분비 면역반응세포의 수(cells/mm2 of pancreas) 및 이들의 비율(insulin/glucagon immunolabeled cells)을 컴퓨터 기반 자동영상분석장치 (iSolution FL ver 9.1, IMT i-solution Inc., Bernaby, BC, Canada) 및 카메라 시스템(ProgResTM C5, Jenoptik Optical Systems GmbH, Jena, Germany)을 이용하여 측정하였다.
- 군분리 당일에 전 개체를 대상으로 비절식 혈당 및 당화혈색소를 측정하였다. 비절식 혈당과 당화혈색소 검사는 동물의 꼬리 미부 끝부분을 scissor로 미세하게 절개하여 자연스럽게 흘러나오는 전혈을 통해 검사하였고 혈당은 간이용 혈당 측정기인 Accu-CHEKⓇ (Performa, Roche Diagnostics GmbH, Germany), 당화혈색소는 당화혈색소 키트 분석기 (DCA Vantage TM analyser, SIEMENS, UK)를 이용하여 측정하였다.
- , 2018). 이렇듯 여주는 글루카곤의 분비에 영향을 주어 고혈당증을 개선시킬 수 있는 가능성이 있으며 이를 확인하기 위해 연구를 수행하였으며 평가를 위한 동물모델로 HFD/STZ유도 당뇨 랫드를 모델로 선정하였다. HFD/STZ모델은 HFD를 통해 제2형 당뇨를 유도하는 과정에서 STZ를 투여하여 당뇨 유도를 가속시키는 모델로서 이전의 연구에서 적합성을 확인한 바 있다(Kim et al.
- 일반 조직병리학적 변화를 관찰하기 위해 hematoxylin and eosin(H&E) 염색을 실시하였으며, 췌장의 glucagon 분비세포(α 세포) 및 insulin 분비세포(β 세포)를 각각 avidin-biotin-peroxidase complex(ABC)기반 면역조직화학적으로 염색하였다.
- 일정한 부위의 췌장-비장엽 부위를 각각 세로로 절단한 다음, 10% 중성포르말린에 재고정하고, 일반적인 방법으로 탈수 및 파라핀 포매를 실시하였으며, 전동 micorotome(RM2255, Leica Biosystems, Nussloch, Germany)를 이용하여 3–4 μm 두께로 3장의 연속 절편을 제작하였다.
- 절식 혈당은 미숙여주주정추출분말 투여 개시 후 9주차에 측정하였으며 측정 전 16시간 절식 후 혈당 측정기인 Accu-CHEKⓇ(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany을 이용하여 동물의 꼬리 미부 끝부분을 scissor로 미세하게 절개하여 자연스럽게 흘러나오는 전혈로 측정하였다.
- 일반 조직병리학적 변화를 관찰하기 위해 hematoxylin and eosin(H&E) 염색을 실시하였으며, 췌장의 glucagon 분비세포(α 세포) 및 insulin 분비세포(β 세포)를 각각 avidin-biotin-peroxidase complex(ABC)기반 면역조직화학적으로 염색하였다. 조직 내의 내인성 과산화효소의 활성을 억제하기 위해 methyl alcohol에 과산화수소수를 0.3% 농도로 첨가한 용액으로 30분간 반응시켰으며, 조직 내의 비특이적인 반응을 방지하기 위해 말의 정상 혈청을 사용하였다. 면역혈청으로는 Anti-insulin antibody(Abcam, Cambridge, MA, USA), Anti-glucagon antibody(Abcam, Cambridge, MA, USA)을 각각 1:100, 1:1000으로 희석한 용액을 사용하여 4°C의 습윤 chamber에서 24시간 반응시켰고, 2차 항체로는 biotinylated universa antibody (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)를 사용하였으며, ABC reagent(Vector Labs, Burlingame, CA, USA)에 1시간 반응시켰다.
- 모든 동물을 경구 당부하 시험 전날부터 16시간 동안 절식시키고 혈당을 측정한 후 2g/kg의 glucose (D-(+)-Glucose, Sigma, USA)를 경구투여한 후 15분, 30분, 60분과 120분에 혈당을 측정하였다. 혈당의 측정은 혈당 측정기인 Accu-CHEKⓇ을 이용하여 동물의 꼬리 미부 끝부분을 scissor로 미세하게 절개하여 자연스럽게 흘러나오는 whole blood로 측정하였다. 시간대 별 혈당 측정치를 이용하여 경시적 변화를 기록하고, 그래프의 밑면적 (Area Under the Curve, AUC)을 SigmaPlot (version 10.
- 혈중 인슐린 측정은 인슐린 ELISA kit (Morinaga UltraSensitive Mouse/Rat Insulin ELISA Kit, Morinaga Institute of Biological Science, Japan)을 이용하였고, 혈중 Glucagon 측정은 Rat Glucagon ELISA Kit (DGCG0, R&D Systems, USA)를 이용하였다.
대상 데이터
- 5주령된 Sprague-Dawley (Crl:CD(SD)) rat를 Orient BIO(Seongnam, Korea)에서 구입하였다. 7일간의 검역, 순화 기간을 거친 후, 모든 동물에 고지방 식이(D12492, 60% kcal from fat, Research Diet Inc, USA)를 급이하고 고지방식이 1주일 후에 STZ(Sigma, USA, 30mg/kg in 0.
- 실험에 사용된 시료는 경상남도 함양에서 재배한 국내산 미숙여주를 구매하여 사용하였다. 미숙여주에 70% 주정알콜(ethanol)을 원재료대비 15배 투입하여 70℃에서 4시간 동안 1차 추출한 뒤 여과하고 남은 잔사에 다시 10배수의 용매를 투입한뒤 2시간동안 2차 추출하였다.
- 추출물은 감압농축기를 사용하여 15~20 brix로 농축한 뒤 덱스트린(49%), 레시틴(1%)의 비율로 혼합하고 분무건조한 미숙여주주정추출분말(Sugar Katcher S52™)를 사용하였다.
데이터처리
- Statistical analyses were performed by Dunnett’s test (control column=HFD/STZ) after one-way ANOVA and using SPSS software.
- 모든 결과들에 대해 분산의 동질성을 비교하기 위한 Levene's test를 실시하였으며, 분산이 동질성을 갖는 경우 one-way analysis of variance (ANOVA)를 실시하여 유의성이 관찰되면 대조군과의 유의차가 있는 시험군을 알아내기 위하여 Dunnett’s test를 실시하였다(유의수준: 양측 5% 및 1%).
- 혈당의 측정은 혈당 측정기인 Accu-CHEKⓇ을 이용하여 동물의 꼬리 미부 끝부분을 scissor로 미세하게 절개하여 자연스럽게 흘러나오는 whole blood로 측정하였다. 시간대 별 혈당 측정치를 이용하여 경시적 변화를 기록하고, 그래프의 밑면적 (Area Under the Curve, AUC)을 SigmaPlot (version 10.0 Systat Software Inc., USA)을 사용하여 산출하고 각 그룹 간 내당능을 비교하였다.
- 실험에서 얻어진 모든 실험 결과는 평균치 ± 표준편차로 표시하고 SPSS (version 20, IBM SPSS Statistics, USA)를 사용하여 검정하였다.
성능/효과
- Table 3의 결과에 따르면 glucose 투여 후 15분 후부터 혈당이 상승되기 시작하였다. BME 62.5 투여 HFD/STZ군의 경우 glucose 투여 120분 경과 후 시점에 HFD/STZ군 대비 유의한 감소가 확인되었으며 BME 125 투여 HFD/STZ군 역시 투여 120분 경과 후에 유의한 감소가 관찰되었다. 특히 BME 250 투여 HFD/STZ군은 glucose 투여 후 투여 후 15분 경과 시점을 제외한 전 구간에서 HFD/STZ 군 대비 유의적 감소를 확인하였다.
- BME 62.5 투여 HFD/STZ군의 당화혈색소 함량은 6.57±1.36% 로 측정 되어 HFD/STZ군의 7.07±0.21%에 비해 감소가 나타났으며, BME 125투여 HFD/STZ군과 BME 250 투여 HFD/STZ군에서도 각각 6.63±0.28%, 6.53±1.10%로 측정되어 통계적으로 유의하진 않지만 감소하는 경향을 보였다.
- HFD/STZ 군에서 췌장섬의 수는 12.6±2.51 islets/cm2으로 나타났고 BME 62.5, 125, 250 투여 HFD/STZ 군에서는 각각 19.20±1.64 islets/cm2, 20.40±2.51 islets/cm2, 21.00±2.12 islets/cm2으로 나타나 유의적으로 증가함을 확인하였으며 췌장섬의 직경도 여주 투여로 인하여 유의적으로 증가하는 경향을 나타내었다.
- glucagon과 insulin의 비율은 HFD/STZ 군에서 193.91±18.96 로 측정되어 Normal 군 대비 크게 증가하였으나 여주의 투여로 인해 비율의 수치가 유의적으로 감소되는 것을 확인 하였다.
- 여주를 활용한 항당뇨 효능연구에 있어서 그 기전으로 인슐린-식후혈당간의 관계는 널리 알려져 있으나 이와 같이 글루카곤과의 연관성을 보인경우는 드물었기에 작용기전을 확인하고자 본 실험을 수행하였다. 그 결과 미숙여주주정추출분말 경구투여군은 경구당부하검사(OGTT) 120분과 곡선하면적(AUC)에서 유의적인 혈당감소를 보였으며, 글루카곤 또한 유도군 대비 유의적으로 감소하였음을 확인하였다. 이와 같은 내용을 토대로 볼 때, 미숙여주주정추출분말은 인체적용시험과 동물 모델을 통하여 글루카곤 분비 억제를 통한 혈당상승억제의 연관성을 확인하였으며 이는 글루카곤의 분비를 억제함으로써 혈당상승을 억제하는 것으로 볼 수 있다.
- , 2019)에 따르면 glucagon과 insulin의 비율이 높게 나타나는 2형 당뇨병 환자에게서 혈당 조절이 더욱 어려운 것으로 보고되었다. 따라서 미숙여주주정추출분말의 투여가 glucagon의 분비를 유의하게 억제하여 glucagon과 insulin의 비율을 낮추고 이를 통해 혈당 조절에 효과를 나타내는 것으로 확인 되었다. 미숙여주주정추출분말의 어떠한 성분이 이러한 효과를 나타내는지에 대하여 추후 지속적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 1에 나타내었다. 모든 여주 투여 군에서 HFD/STZ군 대비 유의적으로 감소하는 것을 확인하였으며 62.5 투여군의 경우 약 10.10%, 125 투여군의 경우 6.10%, 250 투여군의 경우 17.04% 감소하였다. 경구당부하 검사의 경우 당뇨초기 가장 좋은 조기진단법으로서, 공복 혈당 측정시 보다 더 많은 내당능 이상을 진단할 수 있는 것으로 알려져 있다(Son, 2008).
- 면역반응 세포 수의 경우 여주 투여시 HFD/STZ군 대비 유의 적으로 insulin 분비세포의 증가, insulin/glucagon의 비율 증가가 확인되었다. 이러한 조직학적 확인을 통해 여주의 투여가 췌장 소화효소 (효소원 과립) 분비 조절 및 insulin 분비 세포 보존 효과를 통해 2형 당뇨를 제어할 가능성을 확인하였다.
- 이전에 수행된 인체적용시험(IRB No. 1040549-201603-BM-004)에서 여주를 섭취한 시험군은 위약군과 비교하여 경구당부하 후 혈당과 인슐린, 글루카곤이 감소하였고 혈당과 글루카곤은 통계적인 유의성을 나타내었다. 여주를 활용한 항당뇨 효능연구에 있어서 그 기전으로 인슐린-식후혈당간의 관계는 널리 알려져 있으나 이와 같이 글루카곤과의 연관성을 보인경우는 드물었기에 작용기전을 확인하고자 본 실험을 수행하였다.
- 5 투여 HFD/STZ군의 경우 glucose 투여 120분 경과 후 시점에 HFD/STZ군 대비 유의한 감소가 확인되었으며 BME 125 투여 HFD/STZ군 역시 투여 120분 경과 후에 유의한 감소가 관찰되었다. 특히 BME 250 투여 HFD/STZ군은 glucose 투여 후 투여 후 15분 경과 시점을 제외한 전 구간에서 HFD/STZ 군 대비 유의적 감소를 확인하였다. Glucose 곡선 하 면적(area of under cruve, AUC)은 Fig.
후속연구
- 따라서 미숙여주주정추출분말의 투여가 glucagon의 분비를 유의하게 억제하여 glucagon과 insulin의 비율을 낮추고 이를 통해 혈당 조절에 효과를 나타내는 것으로 확인 되었다. 미숙여주주정추출분말의 어떠한 성분이 이러한 효과를 나타내는지에 대하여 추후 지속적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 경구당부하 검사의 경우 당뇨초기 가장 좋은 조기진단법으로서, 공복 혈당 측정시 보다 더 많은 내당능 이상을 진단할 수 있는 것으로 알려져 있다(Son, 2008). 이러한 결과는 미숙여주주정추출분말의 경구투여가 당뇨초기의 내당능 장애를 개선시켜 줄 수 있을 것으로 예상된다.
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