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문제 정의
- GD가 발효를 통해 FGD가 됨에 따라 NA 활성이 억제되는 것이 발효를 통해 증가한 침향공진단 성분인 nodakenetin에 의한 것인지 확인해보고자, nodakenetin과 nodakenin의 NA 활성 억제 평가를 실시하였다. 250 µg/ml nodakenin은 DMSO 처리 대조군 대비 NA 활성을 약 4%만큼 억제하였으나, nodakenetin (10, 50, 및 250 µg/ml)은 NA 활성 억제율이 각각 12%, 22%, 및 68%로 동일 농도의 nodakenin 대비 농도의존적으로 유의미한 NA 활성 억제 효과가 있었다(Fig.
- 주로, 발효를 통해 전환된 성분을 규명하거나[18−21], 발효를 통해 강화된 항염[22], 항산화 및 항균[23] 등의 효능을 밝힌 논문들이 보고되었다. 따라서, 본 연구에서는 전통 한방 처방인 공진단에 신규한 효능을 더하거나 기존의 효능을 강화하고자 원방공진단의 사향을 침향으로 대체한 가감공진단(침향공진단)을 L. plantarum 종으로 발효하였다.
- 본 연구에서는 발효한 침향공진단뿐만 아니라 그로부터 분리한 nodakenetin의 NA 활성 억제 효능을 처음으로 규명하였다. Nodakenin의 경우, 동물실험을 통해 기억력 개선[31] 및 인지능 개선 효과[32], 호흡기 염증 억제 효과[33], 항박테리아 효과[28] 등이 보고되었으나, 비배당체인 nodakenetin의 효능에 관한 연구는 암세포에 대한 독성 효과[34] 외에 보고된 바가 없었으며 본 연구에서 밝힌 NA 활성 억제 효능이 유일하다.
- 침향공진단 성분 중 발효를 통해 생성 혹은 증가하는 유효 성분을 분리하기 위하여 총 4가지 시료들(GD, FGD, 침향공진단 농축액, 및 MRS 배지)에 대하여 HPLC를 실시하였다. 분석 결과, FGD의 spectrum에서 침향공진단 유래 성분이면서 동시에 발효를 통해 증가한 peak들을 확인하고, 그중에서 함량 변화가 가장 큰 성분을 분리 및 정제하고자 하였다. FGD를 동량의 n-hexane, EtOAc, BuOH로 순차적으로 분획하였다.
- 연구에서는 침향공진단을 L. plantarum으로 발효하고 발효를 통해 증가한 침향공진단의 유효 성분을 밝히고, 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 예방 및 치료 효능을 가지는 발효 한약으로의 침향공진단의 가능성을 확인하고자 하였다.
- 한편, 공진단의 효능을 언급한 고서에 따르면 공진단은 선천적으로 몸이 허약하거나 병에 걸려 허약해진 허로에 처방한다고 알려져 있는데, 이는 결국 면역력 강화를 의미한다. 이에 본 연구에서는 공진단 혹은 발효한 공진단 섭취를 통한 면역력 강화, 정확히는 인플루엔자 바이러스로 인한 독감의 예방 가능성을 neuraminidase (NA) 활성 억제 평가를 통해 확인하고자 하였다. 인플루엔자 바이러스 표면에 존재하는 당단백질인 NA는 숙주 세포 표면의 sialic acid와 바이러스 표면의 hemagglutinin의 결합을 가수분해함으로써 세포 표면으로부터 바이러스를 분리시키고 새로운 세포들에 대한 감염을 지속함으로써 바이러스가 생물체 내에서 증식할 수 있도록 한다.
제안 방법
- 0−2 min, 100% A; 2−9 min, 100−5% A; 9−12 min, 5% A; 12−13 min, 5−100% A로 분석하고 이후 4분간 안정화 시간을 주었다.
- 1 M Tris-HCl (pH 7.5, #EBA-1103, Elpis Biotech Inc., Korea) 1 ml, 1 M NaCl 12.5 ml, 그리고 증류수 36.5 ml을 혼합하고, Millipore membrane filters (PTFE, 0.22 µm, Merck KGaA)를 이용하여 멸균 여과하였다.
- Column chromatography용 silica gel은 Kieselgel 60 (#9385, Merck KGaA)을, preparative liquid chromatography (Prep-LC)는 Agilent 1260 infinity preparative scale purification system (Agilent, USA)을 사용하였으며, 칼럼은 Eclipse XCB-C18 (Agilent, 21.2 mm × 250 mm, 7 μm)을 사용하였다.
- Compound A의 화학 구조는 NMR 및 MS spectrum을 통해 확인하였다. 전형적인 Furocoumarines 구조의 특징적인 peak들을 확인하였으며, 이와 같은 spectral data를 종합하여 기존에 알려진 문헌과[28] 비교하여 compound A를 nodakenetin으로 동정하였으며, nodakenetin 표준품과 TLC 및 HPLC를 통해 직접 비교하여 재확인하였다(Fig.
- 총 8 L의 FGD를 동량의 n-hexane을 가하여 진탕 방치하여 분획하고, 순차적으로 ethyl actetate (EtOAc), n-butanol (BuOH)을 가하여 진탕 방치하여 각각의 분획물을 얻었다. EtOAc 분획(15 g)을 n-hexane/EtOAc (gradient) 용출용매로 silica gel column chromatography를 실시하여 11개의 소분획으로 나누었다. 소분획 Fr.
- 분석 결과, FGD의 spectrum에서 침향공진단 유래 성분이면서 동시에 발효를 통해 증가한 peak들을 확인하고, 그중에서 함량 변화가 가장 큰 성분을 분리 및 정제하고자 하였다. FGD를 동량의 n-hexane, EtOAc, BuOH로 순차적으로 분획하였다. 각 분획물 중 EtOAc 분획에서 발효를 통한 함량 변화가 가장 큰 성분을 확인하고, Silica gel column chromatography 및 Prep-LC를 실시하여 Fig.
- Nuclear magnetic resonance (NMR)은 Advance III 600 (600 MHz) spectrometer (Bruker, Germany)를 사용하여 측정하였으며, electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS)는 Qtrap 6500 (SCIEX, USA)를 사용하였다. Column chromatography용 silica gel은 Kieselgel 60 (#9385, Merck KGaA)을, preparative liquid chromatography (Prep-LC)는 Agilent 1260 infinity preparative scale purification system (Agilent, USA)을 사용하였으며, 칼럼은 Eclipse XCB-C18 (Agilent, 21.
- FGD를 동량의 n-hexane, EtOAc, BuOH로 순차적으로 분획하였다. 각 분획물 중 EtOAc 분획에서 발효를 통한 함량 변화가 가장 큰 성분을 확인하고, Silica gel column chromatography 및 Prep-LC를 실시하여 Fig. 1과 같이 compound A를 분리, 정제하였다.
- 당귀(Angelica gigas), 녹용(Cervu snippon), 산수유(Cornus officinalis), 및 침향(Aquilaria agallocha)의 약재들은 모두 휴먼허브(Humanherb, Korea)에서 구입하였으며, 대한민국 약전 및 생약규격집에 기술된 각각의 약재 항목에 적합한 것을 엄선하여 사용하였다. 당귀, 녹용, 산수유, 및 침향을 각각 128 g, 128 g, 128 g, 16 g씩 혼합한 총 400 g의 원물에 증류수 4 L를 가하여 80℃에서 3시간 동안 열수 추출하였다. 침향공진단 추출액을 qualitative filter papers (#1004090, Whatman, Sigma-Aldrich, USA)를 이용하여 감압 여과하고, rotary evaporator (Buchi, Switzerland)로 감압 농축하여 고형분이 약 50%인 열수 추출물(침향공진단 농축액) 181.
- , USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도(A570,20)를 측정하였다. 동일 조건에서 30분 동안 추가로 반응시킨 후 동일 방법으로 흡광도(A570,50)를 측정하였다. 양성대조군 및 시료처리군에 대한 상대적인 NA 활성도는 ∆A570(=A570,50 − A570,20)를 이용하여 계산하였다.
- 마지막으로 표준 시약 wells을 포함한 모든 wells에 assay buffer (#MAK121A) 15 µl, substrates (#MAK121C) 27.5 µl, cofactors (#MAK121E) 0.5 µl, enzyme (#MAK121D) 0.5 µl 및 dye reagent (#MAK121B) 0.25 µl를 혼합하여 제조한 반응 시약을 40 µl/well씩 첨가하고, 37℃ 항온배양기에서 차광하여 20분 동안 반응시킨 후 Epoch microplate spectrophotometer (BioTek Instruments, Inc., USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도(A570,20)를 측정하였다.
- 먼저, 10 mM 표준 시약(#MAK121F) 20 µl 와 증류수 480 µl를 혼합하여 400 µM 표준 시약 용액을 제조한 후, 증류수를 추가하여 표준 시약의 최종 반응 농도가 각각 0 (blank), 120, 240, 및 400 µM이 되도록 96 well plate (#3610, Corning, USA)에 각각 10 µl/well씩 넣어주었다(표준 시약 wells).
- 발효에 의한 침향공진단의 성분 변화를 확인하기 위해 GD, FGD, 침향공진단 농축액, 및 MRS 배지의 HPLC chromatogram 패턴을 분석하였다. 기기는 Agilent 1260 infinity system이며, 컬럼은 Phenomenex kinetex C18 (4.
- 본 실험에서는 원방공진단의 구성 약재인 당귀, 녹용, 산수유, 사향 중 식품에 사용할 수 없는 사향을 침향으로 대체하였다(침향공진단). 당귀(Angelica gigas), 녹용(Cervu snippon), 산수유(Cornus officinalis), 및 침향(Aquilaria agallocha)의 약재들은 모두 휴먼허브(Humanherb, Korea)에서 구입하였으며, 대한민국 약전 및 생약규격집에 기술된 각각의 약재 항목에 적합한 것을 엄선하여 사용하였다.
- 양성대조군 및 시료처리군에 대한 상대적인 NA 활성도는 ∆A570(=A570,50 − A570,20)를 이용하여 계산하였다.
- 6 μm, Phenomenex, USA)를 사용하였다. 이동상은 용매를 A (0.1% H3PO4)와 B (ACN)로 설정하여 다음과 같은 조건에서 분석하였다. 0−2 min, 100% A; 2−9 min, 100−5% A; 9−12 min, 5% A; 12−13 min, 5−100% A로 분석하고 이후 4분간 안정화 시간을 주었다.
- Compound A의 화학 구조는 NMR 및 MS spectrum을 통해 확인하였다. 전형적인 Furocoumarines 구조의 특징적인 peak들을 확인하였으며, 이와 같은 spectral data를 종합하여 기존에 알려진 문헌과[28] 비교하여 compound A를 nodakenetin으로 동정하였으며, nodakenetin 표준품과 TLC 및 HPLC를 통해 직접 비교하여 재확인하였다(Fig. 2).
- 총 8 L의 FGD를 동량의 n-hexane을 가하여 진탕 방치하여 분획하고, 순차적으로 ethyl actetate (EtOAc), n-butanol (BuOH)을 가하여 진탕 방치하여 각각의 분획물을 얻었다. EtOAc 분획(15 g)을 n-hexane/EtOAc (gradient) 용출용매로 silica gel column chromatography를 실시하여 11개의 소분획으로 나누었다.
- 침향공진단 성분 중 발효를 통해 생성 혹은 증가하는 유효 성분을 분리하기 위하여 총 4가지 시료들(GD, FGD, 침향공진단 농축액, 및 MRS 배지)에 대하여 HPLC를 실시하였다. 분석 결과, FGD의 spectrum에서 침향공진단 유래 성분이면서 동시에 발효를 통해 증가한 peak들을 확인하고, 그중에서 함량 변화가 가장 큰 성분을 분리 및 정제하고자 하였다.
- 침향공진단 혹은 발효한 침향공진단의 인플루엔자 바이러스에 대한 감염 억제 가능성을 확인해보고자, GD 및 FGD의 NA 활성 억제 평가를 실시하였다. GD (10−250 µg/ml) 처리시 NA 활성을 전혀 억제하지 못하였으며 500 µg/ml 처리시에만 NA 활성을 DMSO 처리 대조군 대비 약 1%만큼 억제하였으나, FGD (10, 50, 250, 및 500 µg/ml)는 NA 활성 억제율이 각각 24%, 55%, 84%, 및 92%로 동일 농도의 GD 대비 유의미한 NA 활성 억제 효과가 있었다(Fig.
- 발효전 침향공진단(침향공진단 농축액 1% 함유 MRS 배지, unfermented Gongjin-dan, GD) 및 발효후 침향공진단(침향공진단 발효액, fermented Gongjin-dan, FGD)에서의 nodakenetin 함량 분석 결과, 각각 6 μg/ml과 70 μg/ml으로 발효를 통해 nodakenetin이 약 10배 이상 증가하였다. 한편, 고서에 전해지는 공진단의 면역력 강화 효능에 근거하여, GD 및 FGD의 인플루엔자 바이러스 증식 억제 효능을 확인하고자 Neuraminidase (NA) 활성 평가법(NA activity assay)을 실시하였다. 실험 결과, GD는 NA 활성을 억제하지 못하였으나, FGD는 농도의존적으로 NA 활성을 억제하였으며 500 μg/ml에서 대조군 대비 약 92%의 억제율을 보였다.
대상 데이터
- TLC Plate는 Kieselgel 60F254S 및 RP-18254S pre-coated plate (Merck KGaA). Nodakenetin과 nodakenin 표준품은 Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd. (China)에서 구입하여 사용하였으며, 성분 분리 및 분석을 위해 사용된 MeOH과 acetonitrile (ACN)은 HPLC용으로 Duksan pure chemicals (Korea)에서, phosphoric acid (H3PO4)는 HPLC용으로 Fujifilm Wako pure chemical Corp. (Japan)에서 구입하였으며, 증류수는 Milli-Q purification system (Millipore, USA)으로 정제하여 사용하였다.
- 본 실험에서는 원방공진단의 구성 약재인 당귀, 녹용, 산수유, 사향 중 식품에 사용할 수 없는 사향을 침향으로 대체하였다(침향공진단). 당귀(Angelica gigas), 녹용(Cervu snippon), 산수유(Cornus officinalis), 및 침향(Aquilaria agallocha)의 약재들은 모두 휴먼허브(Humanherb, Korea)에서 구입하였으며, 대한민국 약전 및 생약규격집에 기술된 각각의 약재 항목에 적합한 것을 엄선하여 사용하였다. 당귀, 녹용, 산수유, 및 침향을 각각 128 g, 128 g, 128 g, 16 g씩 혼합한 총 400 g의 원물에 증류수 4 L를 가하여 80℃에서 3시간 동안 열수 추출하였다.
- 45 μm, Merck KGaA)로 여과하여 사용하였다. 데이터의 수집과 처리는 Agilent HPLC Chem station을 사용하였다.
- 22 μm, Merck KGaA, Germany)를 이용하여 멸균 여과하였다(침향공진단 발효액, fermented Gongjin-dan, FGD). 이후, high-performance liquid chromatography (HPLC) 및 NA 활성 평가에 사용된 GD, FGD, 침향공진단 농축액, 및 MRS 배지는 모두 rotary evaporator로 감압 농축한 뒤, 용도에 따라 각각 methanol (MeOH) 및 dimethyl sulfoxide (DMSO, #D2650, Sigma-Aldrich)에 녹여서 사용하였다.
- 한국생명공학연구원(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, KRIBB) 산하의 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에서 분양 받은 L. plantarum KCTC 3104 균주를 121℃, 1.5 기압에서 15분 동안 가압 멸균한 MRS broth (Difco, Detroit, MI, USA)에서 계대 배양한 뒤, 생장 배지의 optical density at 600 nm (OD 600) 값이 1이 될 때까지 배양하여 inoculum으로 사용했다. 이후, 침향공진단 농축액 80 g이 함유된 MRS 배지 8 L (unfermented Gongjin-dan, GD)에 inoculum 80 ml을 접종하여 37℃의 항온배양기에서 72시간 동안 발효하고, Millipore membrane filters (PVDF, 0.
데이터처리
- 결과값들은 mean ± standard deviation (S.D.)으로 나타냈으며, P 값이 0.01 이하일 경우 **, 0.001 이하일 경우 ***으로 통계적 유의성을 표시하였다.
- 본 연구에서 실시한 실험은 총 3회 이상 반복하였으며, 실험 군간의 결과값의 통계적 유의성 검정은 one-tailed, unpaired student’s t-test로 실시하였다.
성능/효과
- 250 µg/ml nodakenin은 DMSO 처리 대조군 대비 NA 활성을 약 4%만큼 억제하였으나, nodakenetin (10, 50, 및 250 µg/ml)은 NA 활성 억제율이 각각 12%, 22%, 및 68%로 동일 농도의 nodakenin 대비 농도의존적으로 유의미한 NA 활성 억제 효과가 있었다(Fig. 4).
- GD (10−250 µg/ml) 처리시 NA 활성을 전혀 억제하지 못하였으며 500 µg/ml 처리시에만 NA 활성을 DMSO 처리 대조군 대비 약 1%만큼 억제하였으나, FGD (10, 50, 250, 및 500 µg/ml)는 NA 활성 억제율이 각각 24%, 55%, 84%, 및 92%로 동일 농도의 GD 대비 유의미한 NA 활성 억제 효과가 있었다(Fig. 3).
- GD의 nodakenetin 함량은 6 µg/ml이었으나 FGD의 nodakenetin 함량은 70 µg/ml으로 발효를 통해 nodakenetin의 함량이 10배 이상 증가하였다(Table 1).
- 본 연구 이전에도 당귀가 포함된 한방 처방을 Lactobacillus속의 미생물로 발효함으로써 nodakenin이 nodakenetin으로 전환된다는 것이 보고된 바 있다[19−21]. 그러나, 본 연구는 처음으로 침향공진단을 발효하고 발효 전에는 없었던 NA 활성 억제 효능을 밝힘으로써 발효 한약으로의 침향공진단의 가능성을 확인하였고, 침향공진단의 성분 중 발효를 통해 변환된 성분을 추적하여 nodakenetin을 분리, 동정하였다는 것에 그 의의가 있다.
- 또한, 발효를 통해 증가한 침향공진단의 성분인 nodakenetin과 그 배당체인 nodakenin에 대한 NA 활성 평가 결과, nodakenin은 NA 활성을 거의 억제하지 못하였으나, nodakenetin은 농도의존적으로 NA 활성을 억제하였으며 250 μg/ml에서 대조군 대비 약 68%의 억제율을 보였다.
- 발효전 침향공진단(침향공진단 농축액 1% 함유 MRS 배지, unfermented Gongjin-dan, GD) 및 발효후 침향공진단(침향공진단 발효액, fermented Gongjin-dan, FGD)에서의 nodakenetin 함량 분석 결과, 각각 6 μg/ml과 70 μg/ml으로 발효를 통해 nodakenetin이 약 10배 이상 증가하였다.
- 실험 결과, GD는 NA 활성을 억제하지 못하였으나, FGD는 농도의존적으로 NA 활성을 억제하였으며 500 μg/ml에서 대조군 대비 약 92%의 억제율을 보였다.
- 이상의 결과들을 종합하여 침향공진단을 L. plantarum KCTC 3104로 발효함으로써 침향, 당귀, 녹용, 산수유로 구성된 침향공진단에 함유된 nodakenin이 nodakenetin으로 전환된다는 것을 확인하였다. 대한민국약전에 수재된 당귀의 기원 식물은 Angelica gigas Nakai (산형과 Umbelliferae)의 뿌리이며, 건조 원물에 대한 정량법은 nodakenin 및 total decursin (decursin and decursinol angelate)의 총합이 6%이상이 되도록 규정하고 있고, 대한민국약전의 기준에 부합하는 당귀 약재의 성분 분석에 대한 선행 문헌[29]에 따르면 당귀의 nodakenin 함량은 약 0.
- 또한, 발효를 통해 증가한 침향공진단의 성분인 nodakenetin과 그 배당체인 nodakenin에 대한 NA 활성 평가 결과, nodakenin은 NA 활성을 거의 억제하지 못하였으나, nodakenetin은 농도의존적으로 NA 활성을 억제하였으며 250 μg/ml에서 대조군 대비 약 68%의 억제율을 보였다. 이상의 결과들을 종합하여, 유산균 발효를 통해 침향공진단 내에 미량 존재하던 nodakenetin이 nodakenin의 가수분해로 인해 증가하였으며, NA 활성 억제 성분인 nodakenetin이 증가함으로 인해 FGD도 높은 NA 활성 억제 효능을 보였다고 판단할 수 있었다.
후속연구
- 또한, 당귀 및 공진단 처방은 오래전부터 섭취해왔지만 발효한 당귀 및 가감공진단 처방은 섭취 사례가 아직 부족하다. 따라서, 침향공진단을 발효 한약으로 상용화하기 위해서는 nodakenetin과 그 외의 발효를 통해 증가하거나 생성된 성분들에 대한 인체에서의 안전성에 관한 연구가 선행되어야 할 것이다. 이러한 추가 연구들을 통해 NA 활성 억제 성분인 nodakenetin을 함유한 침향공진단 발효액은 환절기 감기 예방에 도움을 줄 수 있는 식품 소재로 활용될 수 있을 것이다.
- plantarum 종에서 공통적으로 발현되는 β-glucosidase의 작용[30]으로 인해 nodakenin 의 glucose가 분리되어 nodakenetin으로 전환되었기 때문으로 추정된다. 또한, nodakenin과 nodakenetin의 분자량을 고려하더라도 nodakenin 감소율에 비해 nodakenetin 증가율이 높은 것은 발효 중에 효소의 작용으로 nodakenin 외의 다른 물질로부터 nodakenetin으로 전환되었을 가능성을 시사하지만 정확한 물질 규명과 기작에 대해서는 추가 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 마지막으로, 본 연구는 효소 수준에서 nodakenetin의 인플루엔자 바이러스 증식 억제 효과를 확인한 것으로 추가적으로 세포 및 동물 실험을 통해 nodakenetin의 항바이러스 효능을 확인해야만 한다. 또한, 당귀 및 공진단 처방은 오래전부터 섭취해왔지만 발효한 당귀 및 가감공진단 처방은 섭취 사례가 아직 부족하다.
- 따라서, 침향공진단을 발효 한약으로 상용화하기 위해서는 nodakenetin과 그 외의 발효를 통해 증가하거나 생성된 성분들에 대한 인체에서의 안전성에 관한 연구가 선행되어야 할 것이다. 이러한 추가 연구들을 통해 NA 활성 억제 성분인 nodakenetin을 함유한 침향공진단 발효액은 환절기 감기 예방에 도움을 줄 수 있는 식품 소재로 활용될 수 있을 것이다.
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