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문제 정의
- 그 중에서 insulin은 지방세포분화를 개시하기 위한 ERK와 Akt 신호기전을 활성화 시킨다7,8). 따라서 레몬그라스 에탄올 추출물에 의한 3T3-L1 세포의 지방세포 분화억제가 ERK 및 Akt 활성에 미치는 효과를 조사하였다. 호르몬 유도제(MDI)에 의해 분화를 개시한 3T3-L1 세포에서 ERK와 Akt의 인산화 수준이 증가되는 것을 관찰할 수 있었다.
- 비만은 체내 지방이 과도하게 축적되어 일어나는 현상으로 당뇨, 고혈압, 심혈관 질환 및 암과 같은 질병의 원인이 된다. 본 연구는 레몬그라스 에탄올 추출물의 항비만 효과에 대한 연구를 위해 3T3-L1 지방전구세포에서 지방분화에 미치는 영향을 조사하였다. 레몬그라스 에탄올 추출물은 3T3-L1 지방전구세포에서 지방구의 형성을 농도 의존적으로 억제시켰다.
- 본 연구에서는 레몬그라스 에탄올 추출물을 제조하여 3T3-L1 지방전구세포에서 지방생성 억제활성을 평가하였고, adipogenesis 과정과 관련된 전사인자의 발현 및 세포신호기전과 세포주기진행에 미치는 영향을 분석하여 항비만 소재로의 가능성에 대해 고찰하였다.
가설 설정
- The cells were differentiated with MDI in the absence of presence of Cymbopogon citratus ethaol extracts (CCEE; 50, 100, 200 μg/ml) for 7 days and then lipid contents were measure by Oil Red O staining. (A) Lipid droplet accumulation was visualized by a light microsope. Magnification, ×200.
- Fig. 2. Effects of Cymbopogon citratus ethanol extracts on cell viability and cytotoxicity of 3T3-L1 preadipocytes. The cells were treated with 50, 100, 200, 500 and 1000 μg/ml Cymbopogon citratus ethanol extracts for 24 and 48 hr.
제안 방법
- 3T3-L1 세포는 12 well 플레이트에 48시간 전배양 후, MDI배지에서 레몬그라스 에탄올 추출물을 50, 100, 200 μg/ml 농도로 처리하였다.
- 3T3-L1 세포는 48 well 플레이트에 24시간 전 배양 후, 레몬그라스 에탄올 추출물을 50, 100, 200, 500, 1000 μ g/ml 농도로 24 또는 48시간 처리하였다.
- 3T3-L1 세포는 48 well 플레이트에 24시간 전배양 후, 레몬그라스 에탄올 추출물을 50, 100, 200, 500, 1000 μg/ml 농도로 24 또는 48시간 처리하였다.
- 3T3-L1 지방전구세포의 분화를 유도하기 위하여 세포는 1.5×105 cells/ml로 분주하여 세포가 confluent 상태가 된 2일 후(Day 0), MDI용액(IBMX, dexamethasone, insulin)과 10% FBS (Invitrogen, Burlington, ON, Canada)를 포함하는 DMEM 배지에서 3일간 배양함으로써 분화를 개시하였다(Day 3).
- 4)로 2회 세척한 후, 1 ml의 PI/RNase A 혼합용액으로 재 부유시켜 37℃에서 암실조건으로 1시간 배양하였다. DNA 양은 FACS-Calibur (BD Biosciences, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. 세포주기는 CellQuest Pro (BD Biosciences, CA, USA) 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
- HPLC 분석기기는 Agilent 1200 시리즈(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 column은 Shiseido Capcell PRAK MG II C18 (4.6×150 mm, 3 μm), 온도는 35℃로 하였다.
- 제조사의 방법에 따라 각각의 샘플배지 50 μl와 Reaction Mixture 용액 50 μl를 혼합하여 암실조건에서 30분간 방치시킨 후, 50 μl의 Stop 용액을 첨가하여 반응을 종료하였다. 그 후 SpectraMAX 250 microplate spectrophotometer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 이용하여 490 nm와 680 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포독성은 다음과 같이 계산하여 백분율(%)로 나타내었다.
- 제조사의 방법에 따라서 배지를 제거한 세포에 1X Fixative 용액을 첨가하여 15분간 고정시킨 후, Wash 용액으로 2회 세척하여 Oil Red O 용액을 첨가하여 20분간 염색하였다. 그 후 염색액을 제거하고 증류수로 1회 세척한 다음 Wash 용액으로 2회 세척하여 염색된 세포를 광학현미경 (IX71, Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다. 또한 정량을 위해 Dye extraction 용액을 첨가하여 지방을 추출한 후 SpectraMAX 250 microplate spectrophotometer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 따라서 레몬그라스 에탄올 추출물에 의한 3T3-L1 세포의 지방세포 분화억제가 C/EBPα 및 PPARγ의 발현과 AMPK의 활성에 미치는 효과를 조사하였다.
- Post-confluent에 의해 성장이 정지된 3T3-L1 지방전구세포를 지방세포로의 분화를 유도하게 되면 mitotic clonal expansion (MCE)을 위해 세포주기진행이 개시된다23) . 따라서 레몬그라스 에탄올 추출물이 지방세포 분화를 유도한 3T3-L1 세포의 세포주기진행과 세포주기 조절과 관련된 단백질들의 발현에 미치는 효과를 조사하였다. 지방세포 분화를 유도하지 않은 3T3-L1 세포에서 G0/G1기는 66.
- 그 후 염색액을 제거하고 증류수로 1회 세척한 다음 Wash 용액으로 2회 세척하여 염색된 세포를 광학현미경 (IX71, Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다. 또한 정량을 위해 Dye extraction 용액을 첨가하여 지방을 추출한 후 SpectraMAX 250 microplate spectrophotometer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 지방함량은 다음과 같이 계산하여 백분율(%)로 나타내었 다.
- 레몬그라스 에탄올 추출물에 대한 세포독성을 측정하기 위해 LDH cytotoxicity assay kit (Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 측정하였다. 3T3-L1 세포는 48 well 플레이트에 24시간 전 배양 후, 레몬그라스 에탄올 추출물을 50, 100, 200, 500, 1000 μ g/ml 농도로 24 또는 48시간 처리하였다.
- 레몬그라스 에탄올 추출물을 3T3-L1 세포에 여러 농도(50, 100, 200, 500, 1000 μg/ml)로 24시간과 48시간 처리한 후 세포 생존율을 측정하기 위해 MTT 환원 검사를 실시하였고, 세포독성을 측정하기 위해 LDH 활성 검사를 실시하였다.
- 레몬그라스 에탄올 추출물의 지방세포분화 억제활성을 평가하기 위해, 3T3-L1 세포 내 지방축적량을 Oil Red O 염색을 통해 현미경 관찰과 정량분석 하였다(Fig. 3). 분화시키지 않은 3T3-L1 세포에서는 지방구(Lipid droplet)가 형성이 되지 않았으며 분화를 유도한 대조군 세포에서는 다량의 지방구가 형성된 것을 관찰하였다.
- 05% Tween-20)으로 비특이 결합을 차단시킨 후, 1차 항체(1:1000)를 결합시켰다. 면역활성은 peroxidase가 붙어있는 anti-rabbit 또는 anti-mouse 2차 항체(1:2000)를 사용하여 SuperSignal West Pico Chemiluminescent (Pierce, Rockford, IL, USA)에 의해 탐지하였고, FluorChem E System (ProteinSimple, San Jose, CA, USA)을 이용하여 이미지화 하였다.
- 3). 분화시키지 않은 3T3-L1 세포에서는 지방구(Lipid droplet)가 형성이 되지 않았으며 분화를 유도한 대조군 세포에서는 다량의 지방구가 형성된 것을 관찰하였다. 그러나 레몬그라스 에탄올 추출물을 처리하였을 경우 100 μg/ml과 200 μg/ml 농도에서 현저한 지방구 감소를 관찰할 수 있었다[Fig.
- 세포내 지방구 생성을 확인하기 위하여 Adipogenesis assay kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)를 이용하여 Oil Red O 염색을 실시하였다. 3T3-L1 세포는 12 well 플레이트에 48시간 전배양 후, MDI배지에서 레몬그라스 에탄올 추출물을 50, 100, 200 μg/ml 농도로 처리하였다.
- DNA 양은 FACS-Calibur (BD Biosciences, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. 세포주기는 CellQuest Pro (BD Biosciences, CA, USA) 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
- 세포주기의 비율은 PI 염색을 통하여 세포주기를 분석하였다. 세포는 모두 수확하여 PBS (pH 7.
- . 시료의 분석은 HPLC를 이용하였으며 각 시료의 표준용액과 레몬그라스 에탄올 추출물에서 검출된 표준성분인 caffeic acid와 isoorientin의 chromatogram 결과는 Fig. 1에서 나타낸 바와 같다. 또한 표준성분인 caffeic acid와 isoorientin의 검량선을 확인한 결과 레몬그라스 에탄올 추출물의 caffeic acid 함량은 3.
- 5 ml/min, 15 μl를 injection volume으로 설정하였다. 이동상은 0.1% formic acid 수용액(A)과 acetonitrile (B)로 5% B-5 min, 10% B-13 min, 25% B-20 min, 30% B-24 min, 35% B-28 min, 45% B-35 min, 50% B-40 min, 55% B-43 min, 60% B-50 min, 70% B-56 min까지 gradient 조건으로 분석하였다. 표준물질은 caffeic acid와 isoorientin을 사용하였으며, 각각의 표준물질의 정성 및 정량은 retention time과 고유의 표준폼과 비교하여 검량선으로부터 DLLEM와 DLLFEA 분획물 및 silica column chromatography를 이용하여 분획의 함량 결과를 얻었다.
- 제조사의 방법에 따라 각각의 샘플배지 50 μl와 Reaction Mixture 용액 50 μl를 혼합하여 암실조건에서 30분간 방치시킨 후, 50 μl의 Stop 용액을 첨가하여 반응을 종료하였다.
- 5×105 cells/ml로 분주하여 세포가 confluent 상태가 된 2일 후(Day 0), MDI용액(IBMX, dexamethasone, insulin)과 10% FBS (Invitrogen, Burlington, ON, Canada)를 포함하는 DMEM 배지에서 3일간 배양함으로써 분화를 개시하였다(Day 3). 지방세포로의 완전 분화를 촉진하기 위해 2일에 한번씩 insulin과 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지로 교체하여 4일간 배양하였다(Day 7).
- 총 40 μg의 단백질 샘플을 SDS-PAGE 젤로 분리하였고, 40V에서 3시간 nitrocellulose막 위로 단백질을 전이시켰다.
- 1% formic acid 수용액(A)과 acetonitrile (B)로 5% B-5 min, 10% B-13 min, 25% B-20 min, 30% B-24 min, 35% B-28 min, 45% B-35 min, 50% B-40 min, 55% B-43 min, 60% B-50 min, 70% B-56 min까지 gradient 조건으로 분석하였다. 표준물질은 caffeic acid와 isoorientin을 사용하였으며, 각각의 표준물질의 정성 및 정량은 retention time과 고유의 표준폼과 비교하여 검량선으로부터 DLLEM와 DLLFEA 분획물 및 silica column chromatography를 이용하여 분획의 함량 결과를 얻었다.
대상 데이터
- 3T3-L1 지방전구세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)로 부터 분양 받았고, 10% FCS (Invitrogen, Burlington, ON, Canada), 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin이 포함된 DMEM 배지(Invitrogen, Burlington, ON, Canada)를 사용하여 37℃와 5% CO2 상태에서 배양하였다.
- Anti-Akt, anti-phospho-Akt (Ser473), anti-AMPKα, anti-phospho-AMPKα (Thr172), anti-C/EBPα, anti-ERK, anti-phospho-ERK (Thr202/Tyr204), anti-PPARγ 등의 항체들 은 Cell Signaling Technology INC. (Beverly, MA, USA)로부터 구입하였다.
- (Beverly, MA, USA)로부터 구입하였다. Anti-CDK2, anti-cyclin A, anti-cyclin B1, anti-cyclin E, anti-p21, anti-p27 등의 항체들은 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였다
- Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. Dexamethasone, IBMX, insulin 등은 Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA) 로부터 구입하였다. Halt protease&phosphatase inhibitor cocktail와 RIPA lysis buffer 등은 Pierce Biotechnology (Rockford, IL, USA)로부터 구입하였다.
- Dimethyl sulfoxide (DMSO), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), propidium iodine (PI), ribonuclease A (RNase A), anti-β-actin 항체 등은 Sigma-Aldrich Chemical (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.
- Halt protease&phosphatase inhibitor cocktail와 RIPA lysis buffer 등은 Pierce Biotechnology (Rockford, IL, USA)로부터 구입하였다.
- 6×150 mm, 3 μm), 온도는 35℃로 하였다. 검출기는 Agilent DAD를 사용하였고, wavelength는 254 nm로 하였다. 유속은 0.
- 레몬그라스 에탄올 추출물의 제조 레몬그라스(Cymbopogon citratus)는 ㈜남원허브(남원, 한국)에서 구입한 후 정선하여 사용하였다. 레몬그라스 에탄올 추출물은 레몬그라스의 100 g을 20배 가량의 70% 에탄올과 혼합하여 상온에서 48시간 추출한 후, 여과지(Whatmann No.
- 5)를 통해 여과하였다. 레몬그라스 여액은 40℃ 수욕상에서 회전진공농축기 (N-1000, EYELA, Tokyo, Japan)로 감압농축한 후, 동결건조기를 통해 동결 건조하여 총 12.39 g을 획득하여 사용 전까지 -20℃에 보관하였다.
데이터처리
- The statistically significant differences compared with non-treated cells were calculated by Student’s t-test.
- Values are means ± SD, N = 3. The statistically significant differences compared with non-treated cells were calculated by Student’s t-test.
- 모든 데이터의 결과는 그래프패드 프리즘 6(La Jolla, CA) 프로그램을 통하여 통계처리 하여 mean±standard deviation (SD)로 기록하였다.
- 실험군간의 유의성 검정은 Student’s t-test를 통해 분석하였으며, p<0.05의 경우에만 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
이론/모형
- 레몬그라스 에탄올 추출물에 대한 세포의 생존율을 측정하기 위해 MTT 방법을 이용하여 측정하였다. 3T3-L1 세포는 48 well 플레이트에 24시간 전배양 후, 레몬그라스 에탄올 추출물을 50, 100, 200, 500, 1000 μg/ml 농도로 24 또는 48시간 처리하였다.
- 4)로 세척하고, 1% halt protease&phosphatase inhibitor cocktail이 포함된 RIPA lysis buffer로 부유시킨 후 얼음 위에서 30분간 용해하였다. 세포용해물들은 4℃에서 14,000 rpm으로 15분간 원심분리하였고, 단백질 농도는 Bradford 검사법을 이용하여 측정하였다. 총 40 μg의 단백질 샘플을 SDS-PAGE 젤로 분리하였고, 40V에서 3시간 nitrocellulose막 위로 단백질을 전이시켰다.
성능/효과
- 그러나 레몬그라스 에탄올 추출물을 처리하였을 경우 C/EBPα와 PPARγ의 발현이 MDI만 처리한 세포와 비교하여 현저하게 감소되는 것을 관찰할 수 있었으며, 또한 AMPK의 인산화 수준이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 4B).
- 57%로 증가하였다. 그러나 레몬그라스 에탄올 추출물을 처리하였을 경우 MDI만 처리한 3T3-L1 세포와 비교하여 G0/G1기는 53.76%로 증가하였고, S기와 G2/M기는 각각 25.09%와 16.05%로 감소하였다[Fig. 5A]. 세포주기 조절과 관련된 단백질들의 발현분석에서 레몬그라스 에탄올 추출물에 의해 p21과 p27의 발현은 증가되었고, CDK2, cyclin A, cyclin B1의 발현을 감소되었으나 cyclin E의 발현에는 영향이 없었다(Fig.
- 이는 C/EBPα와 PPARγ 등의 지방세포분화 전사인자들의 단백질 발현감소와 이들의 발현을 음성적으로 조절하는 AMPK의 활성이 증가하면서 지방구의 축적이 억제된 것으로 나타났다. 또한 레몬그라스 에탄올 추출물은 세포주기 정지를 통해 지방세포 분화개시에 의한 3T3-L1 지방전구세포의 MCE 유도를 저해하여 adipogenesis를 효과적으로 억제하였다. 따라서 레몬그라스는 항비만 소재로써 활용 가능성이 있을 것으로 사료된다.
- 또한 레몬그라스 에탄올 추출물의 3T3-L1 세포 내 지방구 생성 정도를 정량적으로 비교분석하였을 경우 100 μg/ml과 200 μg/ml 농도에서 각각 37.3%와 22.3%로 유의적인 감소를 보였다[Fig. 3B].
- 레몬그라스 에탄올 추출물은 3T3-L1 지방전구세포의 지방세포분화에 의한 세포 내 지방축적을 감소시켰으며, 지방축적에 관여하는 유전자들의 전사인자인 C/EBP α와 PPARγ의 발현 억제뿐만 아니라 상위신호인 AMPK의 활성도 감소시켰다.
- Cyclin-dependent kinases (CDKs)는 세포주기를 진행하게 하는 효소로, cyclin과 복합체를 이루어 세포주기진행을 조절하며, 이 Cyclin-CDK 복합체의 형성은 cyclin-dependent kinase inhibitors (CDKIs)에 의해 제어된다39). 레몬그라스 에탄올 추출물은 지방세포분화가 개시된 3T3-L1 세포의 세포주기를 G0/G1기에서 정지시켰으며, CDK 활성을 억제하는 p21과 p27의 발현을 증가시키고, CDK2, cyclin A, cyclin B1의 발현을 감소시켰다. 이 결과들은 레몬그라스 에탄올 추출물이 3T3-L1 지방세포에서 p21과 p27의 발현증가를 통해 G0/G1기에서 세포주기정지를 유도한다는 것을 보여주고 있다.
- 레몬그라스 에탄올 추출물을 24시간 처리하였을 경우 1000 μg/ml 농도에서 LDH 활성이 4.8%로 유의적인 증가를 보였으며, 48시간 처리하였을 경우 200 μg/ml, 500 μg/ml, 1000 μg/ml 농도에서 각각 6.0%, 7.3%, 9.1%로 유의적인 증가를 보였다.
- 레몬그라스 에탄올 추출물을 24시간 처리하였을 경우 1000 μg/ml 농도에서 세포생존율이 78.63%로 유의적인 감소를 보였으며, 48시간 처리하였을 경우 500 μg/ml과 1000 μg/ml 농도에서 세포생존율이 각각 80.6%와 57.5%로 유의적인 감소를 보였다.
- 5A]. 세포주기 조절과 관련된 단백질들의 발현분석에서 레몬그라스 에탄올 추출물에 의해 p21과 p27의 발현은 증가되었고, CDK2, cyclin A, cyclin B1의 발현을 감소되었으나 cyclin E의 발현에는 영향이 없었다(Fig. 5B).
- 이 결과들은 레몬그라스 에탄올 추출물에 의한 3T3-L1 지방전구세포의 apdipogenesis 억제효과가 C/EBPα와 PPARγ의 발현감소를 통하여 이루어졌으며, C/EBPα와 PPARγ의 발현감소는 AMPK의 활성증가와 관련되어 있다는 것을 보여주고 있다.
- 레몬그라스 에탄올 추출물은 지방세포분화가 개시된 3T3-L1 세포의 세포주기를 G0/G1기에서 정지시켰으며, CDK 활성을 억제하는 p21과 p27의 발현을 증가시키고, CDK2, cyclin A, cyclin B1의 발현을 감소시켰다. 이 결과들은 레몬그라스 에탄올 추출물이 3T3-L1 지방세포에서 p21과 p27의 발현증가를 통해 G0/G1기에서 세포주기정지를 유도한다는 것을 보여주고 있다.
- 그러나 본 연구에서 레몬그라스 에탄올 추출물은 3T3-L1 지방전구세포의 분화에 의해 증가된 ERK 및 Akt 활성을 억제하지 못하였다. 이 결과들은 레몬그라스 에탄올 추출물이 3T3-L1 지방전구세포의 분화 초기단계에서 증가된 ERK와 Akt 활성에는 관여하지 않는다는 것을 보여주고 있으며, 레몬그라스 에탄올 추출물의 지방세포분화 억제 효과가 지방전구세포의 분화초기 단계에 관여하는 세포신호기전과는 연관성이 없었다.
- 따라서 레몬그라스 에탄올 추출물이 지방세포 분화를 유도한 3T3-L1 세포의 세포주기진행과 세포주기 조절과 관련된 단백질들의 발현에 미치는 효과를 조사하였다. 지방세포 분화를 유도하지 않은 3T3-L1 세포에서 G0/G1기는 66.05%, S기는 15.91%, G2/M기는 12.99%로 관찰되었으나, MDI에 의해 지방세포 분화를 유도한 3T3-L1 세포는 G0/G1기가 40.17%로 감소하였고 S기와 G2/M기는 각각 35.13%와 19.57%로 증가하였다. 그러나 레몬그라스 에탄올 추출물을 처리하였을 경우 MDI만 처리한 3T3-L1 세포와 비교하여 G0/G1기는 53.
- 호르몬 유도제(MDI)에 의해 분화를 개시한 3T3-L1 세포에서 ERK와 Akt의 인산화 수준이 증가되는 것을 관찰할 수 있었다.
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