효모 첨가 유무에 따른 막걸리의 발효 중 미생물 군집 및 이화학적 특성 변화 Changes in microbial community and physicochemical characterization of Makgeolli during fermentation by yeast as a fermentation starter원문보기
본 연구에서는 재래누룩을 사용한 막걸리의 미생물 군집을 차세대 염기서열 분석기법(NGS)을 활용하여 조사하고, 미생물 군집이 막걸리의 품질에 미치는 영향을 구명하고자 효모 첨가에 따른 품질특성을 확인하였다. 발효 스타터로 효모의 첨가는 재래누룩 막걸리의 미생물 군집 분포에 영향을 주어 결과적으로 막걸리의 품질 차이를 나타냈다. 무첨가구의 경우 발효 초기의 진균류는 Saccharomycopsis fibuligera가 대부분이었고, 세균류는 Pediococcus pentosaceus, Weissella confusa, Pantoea vagans의 증식으로 인하여 총산 및 젖산 함량이 높게 나타났다. 첨가구는 발효 시작 전부터 Saccharomyces cerevisiae가 우점하여 알코올 생성 속도가 빠르고, 발효 초기의 높은 알코올 농도로 인해 재래누룩에서 기인한 젖산 생성 bacteria의 생육을 억제하는 것으로 나타났다. 따라서 재래누룩으로 막걸리를 제조할 때, 알코올 생성능이 우수한 효모의 첨가가 막걸리 시어짐의 원인이 되는 젖산균의 성장을 억제함으로써 산미를 낮추고 제품의 균일성을 확보할 수 있을 것으로 판단된다.
본 연구에서는 재래누룩을 사용한 막걸리의 미생물 군집을 차세대 염기서열 분석기법(NGS)을 활용하여 조사하고, 미생물 군집이 막걸리의 품질에 미치는 영향을 구명하고자 효모 첨가에 따른 품질특성을 확인하였다. 발효 스타터로 효모의 첨가는 재래누룩 막걸리의 미생물 군집 분포에 영향을 주어 결과적으로 막걸리의 품질 차이를 나타냈다. 무첨가구의 경우 발효 초기의 진균류는 Saccharomycopsis fibuligera가 대부분이었고, 세균류는 Pediococcus pentosaceus, Weissella confusa, Pantoea vagans의 증식으로 인하여 총산 및 젖산 함량이 높게 나타났다. 첨가구는 발효 시작 전부터 Saccharomyces cerevisiae가 우점하여 알코올 생성 속도가 빠르고, 발효 초기의 높은 알코올 농도로 인해 재래누룩에서 기인한 젖산 생성 bacteria의 생육을 억제하는 것으로 나타났다. 따라서 재래누룩으로 막걸리를 제조할 때, 알코올 생성능이 우수한 효모의 첨가가 막걸리 시어짐의 원인이 되는 젖산균의 성장을 억제함으로써 산미를 낮추고 제품의 균일성을 확보할 수 있을 것으로 판단된다.
This study was carried out to confirm changes in the microbial community and physicochemical characteristics of Korean traditional Makgeolli during fermentation by yeast as a fermentation starter. We demonstrate that the microbial community during fermentation affects the quality of Makgeolli. At th...
This study was carried out to confirm changes in the microbial community and physicochemical characteristics of Korean traditional Makgeolli during fermentation by yeast as a fermentation starter. We demonstrate that the microbial community during fermentation affects the quality of Makgeolli. At the species level, Pediococcus pentosaceus, Weissella confusa, Pantoea vagans, and Lactobacillus graminis were dominant on fermentation mix, after 1-2 days, in the control group without yeast treatment. Acid production in the control group was higher than that in the yeast-treated group. P. pentosaceus was dominant throughout the fermentation process, and the proportion of P. vagans remarkably decreased following yeast addition. Considering quality characteristics, the alcohol content rapidly increased after yeast addition, and the lactic acid content was lower in the yeast-treated group than in the control. These results suggest that the rapid increase in alcohol at the start of fermentation inhibits the growth of lactic acid-producing bacteria. The addition of yeast may contribute to the reduction in the high amount of lactic acid, which can be one of the causes of changes in Makgeolli quality.
This study was carried out to confirm changes in the microbial community and physicochemical characteristics of Korean traditional Makgeolli during fermentation by yeast as a fermentation starter. We demonstrate that the microbial community during fermentation affects the quality of Makgeolli. At the species level, Pediococcus pentosaceus, Weissella confusa, Pantoea vagans, and Lactobacillus graminis were dominant on fermentation mix, after 1-2 days, in the control group without yeast treatment. Acid production in the control group was higher than that in the yeast-treated group. P. pentosaceus was dominant throughout the fermentation process, and the proportion of P. vagans remarkably decreased following yeast addition. Considering quality characteristics, the alcohol content rapidly increased after yeast addition, and the lactic acid content was lower in the yeast-treated group than in the control. These results suggest that the rapid increase in alcohol at the start of fermentation inhibits the growth of lactic acid-producing bacteria. The addition of yeast may contribute to the reduction in the high amount of lactic acid, which can be one of the causes of changes in Makgeolli quality.
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문제 정의
현재까지 pyrosequencing을 이용한 막걸리 발효 중 미생물 군집 분석(Jung 등, 2012), 시판 탁주의 NGS 기술을 활용한 미생물 군집 분석(Koo 등, 2018) 등의 연구들이 수행되었지만, 효모 첨가 유무에 따른 막걸리의 발효 중 미생물 군집 변화와 이화학적 특성 평가 관련 연구는 부족한 실정이다. 따라서 본 논문에서는 막걸리 제조에 일반적으로 많이 사용되는 알코올 발효력이 우수한 효모인 Saccharomyces cerevisiae 첨가에 따른 재래누룩 막걸리의 발효 중 미생물 군집 구조를 분석하여, 알코올, 유기산 함량 등 품질특성에 미치는 영향을 이해하고자 한다.
본 연구에서는 재래누룩을 사용한 막걸리의 미생물 군집을 차세대 염기서열 분석기법(NGS)을 활용하여 조사하고, 미생물 군집이 막걸리의 품질에 미치는 영향을 구명하고자 효모 첨가에 따른 품질특성을 확인하였다. 발효 스타터로 효모의 첨가는 재래누룩 막걸리의 미생물 군집 분포에 영향을 주어 결과적으로 막걸리의 품질 차이를 나타냈다.
제안 방법
1단 담금은 쌀 7.5 kg을 2시간 침지하고, 1시간 탈수한 후 1시간 증자한 고두밥과 송학곡자 2.5 kg, 물 12 kg을 넣고 혼합하여 25℃에서 3일간 발효하였고, 첨가구는 스타터로 효모 38.5 g(전체 원료량의 0.05%)을 첨가하였다. 2단 담금은 쌀 17.
05%)을 첨가하였다. 2단 담금은 쌀 17.5 kg을 증자하고 물 37.5 kg을 추가하여 발효를 진행하였다. 발효제 비율은 쌀 대비 10%, 급수 비율은 원료(쌀, 발효제) 대비 1단 담금에서 120%, 2단 담금에서 214%, 통합 180%로 제조하였다.
Bacteria의 군집 분석은 16S rRNA 유전자의 V3-V4 영역을 증폭하는 프라이머(forward: 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3', reverse: 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'), fungi의 군집 분석은 internal transcribed spacer (ITS) 유전자의 ITS3-ITS4 영역을 증폭하는 프라이머(forward: 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGCATCGATGAAGAACGCAGC-3', reverse: 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC3')를 사용하여 PCR 증폭하였으며 PCR mixture는 herculase II fusion DNA polymerases (Agilent Technologies Inc., Santa Clara,CA, USA)를 사용하였다.
, Hilden, Germany)를 사용하여 시료에서 DNA를 추출하였고, 각각의 시퀀싱된 시료는 illumina 16S metagenomic sequencing library 프로토콜에 따라 준비하였다. DNA의 정량과 품질은 PicoGreen 및 Nanodrop을 이용하여 측정하였다. Bacteria의 군집 분석은 16S rRNA 유전자의 V3-V4 영역을 증폭하는 프라이머(forward: 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3', reverse: 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'), fungi의 군집 분석은 internal transcribed spacer (ITS) 유전자의 ITS3-ITS4 영역을 증폭하는 프라이머(forward: 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGCATCGATGAAGAACGCAGC-3', reverse: 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC3')를 사용하여 PCR 증폭하였으며 PCR mixture는 herculase II fusion DNA polymerases (Agilent Technologies Inc.
11를 사용하여 분류하였고 고품질 서열을 취하여 얻어진 시퀀스는 CD-HIT-OTU를 사용하여 Clustering, 즉 시퀀스 에러로 간주되는 낮은 품질의 시퀀스, 모호한 시퀀스, 키메라 시퀀스 등을 제거하고 97% 이상의 서열 유사도를 바탕으로 군집화하여 종 수준의 OTU (operational taxonomic units)를 선발하였다. 각 OTU의 대표서열은 유사성이 가장 높은 것의 유기체 구분 정보로 분류 할당하여 이를 바탕으로 QIIME v1.8.0을 이용하여 미생물 군집 분석을 수행하였고, order에서 genus 수준까지의 분류학적 조성을 나타내었다.
그런 다음 MiSeqTM Platform (Illumina, San Diego, CA, USA)을 사용하여 시퀀싱하였다. 각 시료별 paired-end data는 FLASH 1.2.11를 사용하여 분류하였고 고품질 서열을 취하여 얻어진 시퀀스는 CD-HIT-OTU를 사용하여 Clustering, 즉 시퀀스 에러로 간주되는 낮은 품질의 시퀀스, 모호한 시퀀스, 키메라 시퀀스 등을 제거하고 97% 이상의 서열 유사도를 바탕으로 군집화하여 종 수준의 OTU (operational taxonomic units)를 선발하였다. 각 OTU의 대표서열은 유사성이 가장 높은 것의 유기체 구분 정보로 분류 할당하여 이를 바탕으로 QIIME v1.
, Santa Clara,CA, USA)를 사용하였다. 다음 단계는 multiplexing indices와 illumina sequencing adapters 부착을 위해 limited-cycle amplification을 수행하였다. 최종 산물은 PicoGreen을 이용하여 정규화 및 통합하였고, TapeStation DNA screentape D1000 (Agilent Technologies Inc.
발효제 비율은 쌀 대비 10%, 급수 비율은 원료(쌀, 발효제) 대비 1단 담금에서 120%, 2단 담금에서 214%, 통합 180%로 제조하였다. 막걸리는 25℃에서 31일 동안 발효하였으며, 발효 과정에서 경시적인 시료의 채취는 발효액을 균일하게 혼합해주고 일정 분량을 취해 거름망으로 여과한 뒤 분석 시료로 사용하였다.
알코올 함량은 증류 플라스크에 막걸리 발효액 100 mL와 증류수 60 mL를 혼합 후 증류하여 100 mL 메스실린더에 90 mL까지 증류액을 받은 후 증류수로 정용하여 알코올 분석기(Digital Alcohol Meter DA-155, Kyoto Electronics Manufacturing Co., Ltd., Tokyo, Japan)를 이용해 측정하였다. 환원당 함량은 DNS(dinitrosalicylic acid)법을 이용하였다.
유기산과 유리당은 HPLC (LC-20A, Shimadzu Co., Kyoto,Japan)로 post column 방법을 활용하여 분석하였으며, 시료는 원심분리(3,000×g, 15 min) 후 여과(0.2 µm, Millipore Co., Cork, Ireland)하여 사용하였다.
다음 단계는 multiplexing indices와 illumina sequencing adapters 부착을 위해 limited-cycle amplification을 수행하였다. 최종 산물은 PicoGreen을 이용하여 정규화 및 통합하였고, TapeStation DNA screentape D1000 (Agilent Technologies Inc.)을 이용하여 라이브러리 크기를 확인하였다. 그런 다음 MiSeqTM Platform (Illumina, San Diego, CA, USA)을 사용하여 시퀀싱하였다.
환원당 함량은 DNS(dinitrosalicylic acid)법을 이용하였다. 희석한 시료 용액 0.2 mL에 DNS 시약 0.6 mL를 넣고 끓는 물에서 5분 동안 중탕한 다음 냉각하여 증류수 4.2 mL을 넣고 혼합한 뒤 분광광도계(UV spectrophotometer JP/UV-2450, Shimadzu Co. Ltd., Kyoto, Japan)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 환원당 함량(%, w/v)은 포도당(glucose) 표준 검량선을 이용하여 계산하였다.
대상 데이터
막걸리 제조용 원료는 2017년산 삼광(Asan, Korea) 쌀을 사용하고, 발효제는 역가 300 SP 이상의 소율곡(Songhak, Gwangju, Korea), 효모는 S. cerevisiae (La Parisienne, S.I. Lesaffre Co., Marcq-en-Baroeul, France)를 사용하였다. 물은 일반 수돗물을 이용하였다.
, Marcq-en-Baroeul, France)를 사용하였다. 물은 일반 수돗물을 이용하였다.
미생물 군집 분석은 차세대 염기 서열 분석법인 NGS를 이용하였으며, Macrogen (Seoul, Korea)에 의뢰하여 분석하였다. 시료의 라이브러리 구성을 위해 제조사의 프로토콜에 따라 DNeasy PowerSoil Kit (Qiagen Inc., Hilden, Germany)를 사용하여 시료에서 DNA를 추출하였고, 각각의 시퀀싱된 시료는 illumina 16S metagenomic sequencing library 프로토콜에 따라 준비하였다. DNA의 정량과 품질은 PicoGreen 및 Nanodrop을 이용하여 측정하였다.
이론/모형
미생물 군집 분석은 차세대 염기 서열 분석법인 NGS를 이용하였으며, Macrogen (Seoul, Korea)에 의뢰하여 분석하였다. 시료의 라이브러리 구성을 위해 제조사의 프로토콜에 따라 DNeasy PowerSoil Kit (Qiagen Inc.
, Tokyo, Japan)를 이용해 측정하였다. 환원당 함량은 DNS(dinitrosalicylic acid)법을 이용하였다. 희석한 시료 용액 0.
성능/효과
Glucose 함량 역시 발효 14일까지 효모 첨가구에서 낮게 나타났는데, 이는 glucose가 미생물의 영양원이나 효모의 알코올 발효 기질로서 이용률이 높았던 것으로 판단된다. 2단 담금 이후 glycerol 함량은 증가하는 경향이며, 효모 첨가구에서 높게 나타났다. glycerol은 효모의 대사산물로서 glucose로부터 생성되고, 포도주에서 질감을 부드럽게 하고 목넘김을 좋게 하며 포도주의 쓴맛, 산미를 완화시켜주는 역할을 한다고 보고(Jdckson 등, 2000) 한 바 있어, 효모 첨가구의 높은 glycerol 함량은 쓴맛을 감소시키고 감미에 영향을 줄 것으로 판단된다.
Figure 1에 재래누룩 막걸리의 발효 과정에서 bacteria 군집의 조성 변화를 생물 분류 체계로 나누었으며, bacteria species의 분포율 변화를 상대적인 비율로 나타낸 결과는 Table 1에 나타내었다. NGS 분석 결과 두 시험구에서 발견된 미생물의 종은 유사하였으나 군집의 분포율은 상이하였다. Lactobacillales 목의 대부분은 Lactobacillaceae과, 그 중에 Pediococcus 속, Lactobacillus 속이 포함되어 있었다.
가용성고형분 및 환원당 함량은 발효 20일까지 효모 첨가구에서 낮았으며, pH는 무첨가구에서 발효 초기 급격하게 감소한 반면, 효모 첨가구에서는 pH가 서서히 감소하는 양상이었다. 아미노산 함량은 발효 경과에 따라 증가하는 경향이며, 2단 담금 이후 0.
Figure 2에 재래누룩 막걸리의 발효 과정에서 fungi 군집의 조성 변화를 생물 분류 체계로 나누었으며, fungi species의 분포율변화를 상대적인 비율로 나타낸 결과는 Table 2에 나타내었다. 공통적으로 발효 경과 전체에 걸쳐 목(Order) 수준에서 Saccharomycetales가 99% 이상 분포되어 있었고 그 중에서 Saccharomyces 속, Saccharomycopsis 속이 포함되어 있었다. 효모 첨가구에서는 발효가 시작되면서 Saccharomyces cerevisiae가 우점하였고, 무첨가구 발효 0일에 각각 17.
Saccharomyces cerevisiae의 경우 포도당이나 과당 등 단당류를 대사하여 알코올을 생성하지만 전분질을 분해할 수 없는 특징이 있으며(Tubb, 1986), Saccharomycopsis fibuligera는 누룩에서 분리되며 glucoamylase, α-amylase와 같은 전분분해효소를 분비하고 에탄올을 생산할 수 있는 효모로 알려져 있다(Gonzalez 등, 2008; Yoo 등, 2016). 따라서 재래누룩 막걸리는 발효가 시작되기 전에는 당분이 없어 Saccharomycopsis fibuligera에 의해 전분 분해가 이루어진 후 Saccharomyces cerevisiae가 증식하여 알코올 생성이 이루어진 것으로 판단된다.
첨가구는 발효 시작 전부터 Saccharomyces cerevisiae가 우점하여 알코올 생성 속도가 빠르고, 발효 초기의 높은 알코올 농도로 인해 재래누룩에서 기인한 젖산 생성 bacteria의 생육을 억제하는 것으로 나타났다. 따라서 재래누룩으로 막걸리를 제조할 때, 알코올 생성능이 우수한 효모의 첨가가 막걸리 시어짐의 원인이 되는 젖산균의 성장을 억제함으로써 산미를 낮추고 제품의 균일성을 확보할 수 있을 것으로 판단된다.
7%로 다량 분포되어 있었지만, 발효가 진행되면서 Peddiococcus 속, Lactobacillus 속, Weissella 속이 우점을 이루며 Leuconostoc 속의 군집 분포율은 매우 낮게 나타났다. 또한, 발효 0일에는 Pantoea 속이 4-5% 분포되어 있었으나 무첨가구에서는 발효 초기에 분포율이 급격히 증가하다 2일 이후 감소되었고, 7일 이후 다시 증가하는 경향을 보이며 발효 경과 전체에 걸쳐 5.2-26.5%의 분포율을 보였다. 반면, 효모 첨가구에서는 발효가 시작되면서 1% 미만의 분포율을 보였다.
1% 수준으로 나타났다. 무첨가구 발효 0일에 각각 17.3, 7.2%의 분포율을 보인 Wickerhamomyces anomalus와 Pichia fermentans는 누룩에서 유래된 효모로서 발효가 시작되면서 분포율이 급격히 감소되었다. Choi 등(2019)의 연구에서 재래누룩에서 분리 동정한 Wickerhamomyces anomalus의 경우 기존의 시판 효모와 비교하여도 높은 알코올 발효능을 가지는 것으로 보고되었는데, 이는 시판 효모와 비슷한 알코올 내성을 가지고 있지만, 술덧 내에 Saccharomyces 속, Saccharomycopsis 속에 의한 생육 저해 가능성 이외에도 알코올 함량의 증가에 따른 S.
발효 스타터로 효모의 첨가는 재래누룩 막걸리의 미생물 군집 분포에 영향을 주어 결과적으로 막걸리의 품질 차이를 나타냈다. 무첨가구의 경우 발효 초기의 진균류는 Saccharomycopsis fibuligera가 대부분이었고, 세균류는 Pediococcus pentosaceus, Weissella confusa, Pantoea vagans의 증식으로 인하여 총산 및 젖산 함량이 높게 나타났다. 첨가구는 발효 시작 전부터 Saccharomyces cerevisiae가 우점하여 알코올 생성 속도가 빠르고, 발효 초기의 높은 알코올 농도로 인해 재래누룩에서 기인한 젖산 생성 bacteria의 생육을 억제하는 것으로 나타났다.
2%의 분포율을 보인 Wickerhamomyces anomalus와 Pichia fermentans는 누룩에서 유래된 효모로 발효가 시작되면서 분포율이 감소되었다. 무첨가구의 발효 0-3일에는 Saccharomycopsis fibuligera가 우점하였으나 2단 담금 이후 Saccharomyces cerevisiae의 분포율이 급격히 증가되는 경향이며 71.6-92.1% 수준으로 나타났다. 무첨가구 발효 0일에 각각 17.
Yun 등(2016)에 따르면 Pantoea 속은 토양, 물 등 자연환경에 널리 분포하며 일부 종들이 무기 인산 분해 능력, 식물 생장 촉진 및 식물 병 저항성 증진 등의 유익한 기능을 보이는 것으로 알려져 있으며, 특히 본연구에서 확인된 Pantoea vagans는 다양한 유기산 생성으로 pH를 감소시키면서 무기 인산 분해 활성을 나타낸다고 보고하였다(Yun 등, 2016). 무첨가구의 발효 1-2일의 주요 우점종은 Pediococcus pentosaceus, Weissella confusa, Pantoea vagans이었으며, 이후 Pediococcus pentosaceus가 급격히 증식하여 7일에 77.6%의 분포율을 보였으나 7일 이후 증식한 Lactobacillus plantarum, Pantoea vagans, Lactobacillus graminis, Lactobacillus coryniformis, Weissella confusa, Leuconostoc holzapfelii에 의해 분포율이 감소하는 양상을 나타내었다. 특히, 2단 담금 이후 Lactobacillus plantarum은 발효 경과에 따라 점진적으로 분포율이 증가하여 발효 20일에 44.
분석된 유기산은 총 7종으로 그중 propionic acid, formic acid는 거의 검출되지 않았다(data not shown). 무첨가구의 주요 유기산은 lactic acid, succinic acid, acetic acid 순으로 확인되었고, 효모 첨가구는 malic acid를 포함한 4종이 검출되었다. 이러한 결과는 Lee(2011)가 재래누룩을 이용한 막걸리의 발효 중 주요 유기산을 lactic acid, succinic acid, acetic acid 순으로 보고한 결과와 일치하였다.
Lactobacillales 목의 대부분은 Lactobacillaceae과, 그 중에 Pediococcus 속, Lactobacillus 속이 포함되어 있었다. 발효 0일에는 Leuconostoc holzapfelii가 67.7-79.7%로 다량 분포되어 있었지만, 발효가 진행되면서 Peddiococcus 속, Lactobacillus 속, Weissella 속이 우점을 이루며 Leuconostoc 속의 군집 분포율은 매우 낮게 나타났다. 또한, 발효 0일에는 Pantoea 속이 4-5% 분포되어 있었으나 무첨가구에서는 발효 초기에 분포율이 급격히 증가하다 2일 이후 감소되었고, 7일 이후 다시 증가하는 경향을 보이며 발효 경과 전체에 걸쳐 5.
반면, 효모 첨가구에서는 담금 이후 가파른 상승을 보이며 발효 10일에 15%, 14일에 16%로 나타났다. 발효 14일 이후 알코올 생성 속도는 둔화되었으며, 최종 알코올 생성량 또한 효모 첨가구에서 높았다. 이러한 결과는 발효 스타터로 효모를 첨가함에 따라 Saccharomyces cerevisiae가 발효 시작 전 우점종으로 자리하여 알코올 생성 속도가 빠르고 알코올 농도를 높이는데 영향을 준 것으로 판단된다.
본 연구에서는 재래누룩을 사용한 막걸리의 미생물 군집을 차세대 염기서열 분석기법(NGS)을 활용하여 조사하고, 미생물 군집이 막걸리의 품질에 미치는 영향을 구명하고자 효모 첨가에 따른 품질특성을 확인하였다. 발효 스타터로 효모의 첨가는 재래누룩 막걸리의 미생물 군집 분포에 영향을 주어 결과적으로 막걸리의 품질 차이를 나타냈다. 무첨가구의 경우 발효 초기의 진균류는 Saccharomycopsis fibuligera가 대부분이었고, 세균류는 Pediococcus pentosaceus, Weissella confusa, Pantoea vagans의 증식으로 인하여 총산 및 젖산 함량이 높게 나타났다.
이러한 결과로 발효 초기에 증가된 총산 함량은 발효 종료 시점까지도 영향을 주는 것으로 사료된다. 발효 초기, 무첨가구의 높은 총산 함량은 발효 1-2일의 주요 우점종인 bacteria에 기인한 것으로 확인되며, 발효 후기에는 발효 7일 이후 증가한 bacteria, 그중에서도 분포율이 급격히 증가하고 20일의 주요 우점종인 Lactobacillus plantarum이 총산 증가에 많은 영향을 준 것으로 판단된다. 효모 첨가구에서 산 생성 bacteria 중 Pantoea vagans의 생육이 억제된 것은 발효 초기, 높은 알코올 농도에 의해 억제되었거나 Pediococcus pentosaceus가 분비한 항균 물질인 bacteriocin에 의한 것으로 사료된다.
5 kg을 추가하여 발효를 진행하였다. 발효제 비율은 쌀 대비 10%, 급수 비율은 원료(쌀, 발효제) 대비 1단 담금에서 120%, 2단 담금에서 214%, 통합 180%로 제조하였다. 막걸리는 25℃에서 31일 동안 발효하였으며, 발효 과정에서 경시적인 시료의 채취는 발효액을 균일하게 혼합해주고 일정 분량을 취해 거름망으로 여과한 뒤 분석 시료로 사용하였다.
또한, 술의 맛, 향, 산도를 조정하는 역할을 하지만 lactic acid와 acetic acid 함량이 과다하면 탁주가 시어질 수 있고, 특히 acetic acid의 증가는 알코올의 산화로 인한 초산발효가 진행되고 있다는 것을 의미하며 품질을 저하시키는 큰 요인으로 작용한다(Choi 등, 1992). 분석된 유기산은 총 7종으로 그중 propionic acid, formic acid는 거의 검출되지 않았다(data not shown). 무첨가구의 주요 유기산은 lactic acid, succinic acid, acetic acid 순으로 확인되었고, 효모 첨가구는 malic acid를 포함한 4종이 검출되었다.
발효 14일 이후 알코올 생성 속도는 둔화되었으며, 최종 알코올 생성량 또한 효모 첨가구에서 높았다. 이러한 결과는 발효 스타터로 효모를 첨가함에 따라 Saccharomyces cerevisiae가 발효 시작 전 우점종으로 자리하여 알코올 생성 속도가 빠르고 알코올 농도를 높이는데 영향을 준 것으로 판단된다.
46%의 수준을 나타내었다. 이러한 결과로 발효 초기에 증가된 총산 함량은 발효 종료 시점까지도 영향을 주는 것으로 사료된다. 발효 초기, 무첨가구의 높은 총산 함량은 발효 1-2일의 주요 우점종인 bacteria에 기인한 것으로 확인되며, 발효 후기에는 발효 7일 이후 증가한 bacteria, 그중에서도 분포율이 급격히 증가하고 20일의 주요 우점종인 Lactobacillus plantarum이 총산 증가에 많은 영향을 준 것으로 판단된다.
무첨가구의 경우 발효 초기의 진균류는 Saccharomycopsis fibuligera가 대부분이었고, 세균류는 Pediococcus pentosaceus, Weissella confusa, Pantoea vagans의 증식으로 인하여 총산 및 젖산 함량이 높게 나타났다. 첨가구는 발효 시작 전부터 Saccharomyces cerevisiae가 우점하여 알코올 생성 속도가 빠르고, 발효 초기의 높은 알코올 농도로 인해 재래누룩에서 기인한 젖산 생성 bacteria의 생육을 억제하는 것으로 나타났다. 따라서 재래누룩으로 막걸리를 제조할 때, 알코올 생성능이 우수한 효모의 첨가가 막걸리 시어짐의 원인이 되는 젖산균의 성장을 억제함으로써 산미를 낮추고 제품의 균일성을 확보할 수 있을 것으로 판단된다.
이러한 결과는 Lee(2011)가 재래누룩을 이용한 막걸리의 발효 중 주요 유기산을 lactic acid, succinic acid, acetic acid 순으로 보고한 결과와 일치하였다. 총 유기산 함량은 발효 경과에 따라 증가하는 경향으로 그 중 lactic acid가 가장 비중이 높았으며, 그 증가폭은 효모 첨가구에서 낮게 나타났다. 이는 발효 초기 높은 알코올 농도로 인해 bacteria 분포의 다양성이 낮았으며, 이로 인해 젖산 생성 bacteria의 생육이 억제되어 lactic acid 함량의 증가폭이 낮게 나타난 것으로 사료된다.
무첨가구에서는 주로 glycerol, glucose, sucrose이 확인되었고, 효모 첨가구는 fructose를 포함한 4종이 확인되었다. 총 유리당 함량은 발효 초기 무첨가구에서 매우 높게 나타났는데, 이러한 결과는 발효 초기에는 당분이 없으므로 Saccharomycopsis fibuligera에 의해 전분 분해가 이루어졌으나, 알코올 발효 효모인 Saccharomyces cerevisiae의 개체수가 부족하여 효모 첨가구보다 당 소모율이 낮았던 것으로 판단된다. Glucose 함량 역시 발효 14일까지 효모 첨가구에서 낮게 나타났는데, 이는 glucose가 미생물의 영양원이나 효모의 알코올 발효 기질로서 이용률이 높았던 것으로 판단된다.
48%로 나타났다. 총산 함량은 발효 경과에 따라 증가하는 경향이며, 2단 담금 이후부터 31일까지 무첨가구가 0.40-0.66%, 효모 첨가구는 0.19-0.46%의 수준을 나타내었다. 이러한 결과로 발효 초기에 증가된 총산 함량은 발효 종료 시점까지도 영향을 주는 것으로 사료된다.
6%의 분포율을 보였으나 7일 이후 증식한 Lactobacillus plantarum, Pantoea vagans, Lactobacillus graminis, Lactobacillus coryniformis, Weissella confusa, Leuconostoc holzapfelii에 의해 분포율이 감소하는 양상을 나타내었다. 특히, 2단 담금 이후 Lactobacillus plantarum은 발효 경과에 따라 점진적으로 분포율이 증가하여 발효 20일에 44.4%로 우점하였으며, 이와 반대로 Pediococcus pentosaceus의 분포율은 급격히 감소되어 20일에 7.3%로 나타났다. 효모첨가구에서는 발효 1일에 Pediococcus pentosaceus의 분포율이 급격하게 증가하여 우점하였고, 발효 경과에 따라 증가하는 경향으로 20일에는 88.
공통적으로 발효 경과 전체에 걸쳐 목(Order) 수준에서 Saccharomycetales가 99% 이상 분포되어 있었고 그 중에서 Saccharomyces 속, Saccharomycopsis 속이 포함되어 있었다. 효모 첨가구에서는 발효가 시작되면서 Saccharomyces cerevisiae가 우점하였고, 무첨가구 발효 0일에 각각 17.3, 7.2%의 분포율을 보인 Wickerhamomyces anomalus와 Pichia fermentans는 누룩에서 유래된 효모로 발효가 시작되면서 분포율이 감소되었다. 무첨가구의 발효 0-3일에는 Saccharomycopsis fibuligera가 우점하였으나 2단 담금 이후 Saccharomyces cerevisiae의 분포율이 급격히 증가되는 경향이며 71.
3%로 나타났다. 효모첨가구에서는 발효 1일에 Pediococcus pentosaceus의 분포율이 급격하게 증가하여 우점하였고, 발효 경과에 따라 증가하는 경향으로 20일에는 88.6%의 분포율을 보였다. Lim (2019)의 연구에 따르면 김치에서 분리한 Lactobacillus plantarum의 내산성을 평가한 결과, pH 3.
후속연구
parvulus 등은 다양한 bacteriocins을 생산한다고 알려져 있다(Bennick 등, 1997). 효모 첨가구에서 Pantoea vagans이 현저하게 낮은 분포율을 보인 것은 알코올 농도나 Pediococcus pentosaceus의 항균 물질 분비 등으로 인해 생육이 억제된 것으로 판단되지만 좀 더 심도 있는 연구가 필요하다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
재래누룩을 이용해 막걸리는 제조하는 방법은?
1단 담금은 쌀 7.5 kg을 2시간 침지하고, 1시간 탈수한 후 1시간 증자한 고두밥과 송학곡자 2.5 kg, 물 12 kg을 넣고 혼합하여 25℃에서 3일간 발효하였고, 첨가구는 스타터로 효모 38.5 g(전체 원료량의 0.05%)을 첨가하였다. 2단 담금은 쌀 17.5 kg을 증자하고 물 37.5 kg을 추가하여 발효를 진행하였다. 발효제 비율은 쌀 대비 10%, 급수 비율은 원료(쌀, 발효제) 대비 1단 담금에서 120%, 2단 담금에서 214%, 통합 180%로 제조하였다. 막걸리는 25℃에서 31일 동안 발효하였으며, 발효 과정에서 경시적인 시료의 채취는 발효액을 균일하게 혼합해주고 일정 분량을 취해 거름망으로 여과한 뒤 분석 시료로 사용하였다.
막걸리란?
막걸리는 전분질을 원료로 누룩곰팡이가 분비한 효소에 의해서 당화가 이루어지며 분해된 당은 효모에 의해 알코올로 전환되는 병행복발효주이다(Kim, 2000). 막걸리의 품질은 일반적으로 알코올 농도, 총산, 유기산, 향미성분, 잔존 당 성분에 의하여 결정되며, 이러한 요인들은 발효제나 발효 조건에 따라 크게 달라진다(Lee, 2006).
차세대 염기서열 분석 방법의 장점은?
미생물 군집 분석을 위한 분자생물학적 방법으로 PCR로 16S rRNA gene을 증폭한 다음에 전기영동을 하는 denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), temperature gradient gel electrophoresis (TGGE), terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP), systems security certified practitioner(SSCP) 등의 방법이 개발되기는 하였으나, 데이터베이스를 만들거나 보다 정확한 미생물 종(species)의 정보를 밝히지 못하였다(Park, 2012). 최근에는 차세대 염기서열 분석(next generation sequencing, NGS)법의 개발로 매우 긴 DNA 가닥의 염기서열을 한번에 읽을 수 있다는 장점이 있어 효율적이며, 미생물 분포에 대한 보다 정확한 분석이 가능해졌다(Koo 등, 2018). 현재까지 pyrosequencing을 이용한 막걸리 발효 중 미생물 군집 분석(Jung 등, 2012), 시판 탁주의 NGS 기술을 활용한 미생물 군집 분석(Koo 등, 2018) 등의 연구들이 수행되었지만, 효모 첨가 유무에 따른 막걸리의 발효 중 미생물 군집 변화와 이화학적 특성 평가 관련 연구는 부족한 실정이다.
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