[논문]지렁쿠나무 메탄올 추출물의 생리활성 연구

오유진; 조해진; 우현심; 변준기; 김영수; 김대욱

doi:10.5352/jls.2020.30.11.965

[국내논문] 지렁쿠나무 메탄올 추출물의 생리활성 연구
Physiological Activity of Methanol Extracts from Sambucus sieboldiana var. miquelii (Nakai) Hara 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.30 no.11, 2020년, pp.965 - 972

오유진 (국립백두대간수목원 야생식물산업화연구실) , 조해진 (국립백두대간수목원 야생식물산업화연구실) , 우현심 (국립백두대간수목원 야생식물산업화연구실) , 변준기 (국립백두대간수목원 산림생물자원보전실) , 김영수 (국립백두대간수목원 야생식물산업화연구실) , 김대욱 (국립백두대간수목원 야생식물산업화연구실)

초록
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한국, 중국, 일본에 분포한 지렁쿠나무는 관절염 치료제로 동양의 민간요법에 사용되었다. 본 연구에서는 지렁쿠나무의 건강기능성 식품, 화장품 및 식품 보존료 등의 기능성 소재로 개발하기 위한 기초자료를 제공하고자 연구를 수행하였다. 지렁쿠나무의 잎, 가지 부위를 메탄올 추출물로 제조하여 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량을 측정하고, 항산화 활성, α-glucosidase 저해 활성 및 tyrosinase 저해 활성과 항염증 활성을 검증하였다. 지렁쿠나무 추출물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 1.52±0.1 mg/g and 1.73±0.1 mg/g로 측정되었고, DPPH와 ABTS radical 소거 활성은 처리 농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 소거 효과를 나타냈으며, 각각 IC₅₀ 값이 124.0 ㎍/ml (DPPH), 85.6 ㎍/ml (ABTS)로 높은 항산화 효과를 나타내었다. 또한, α-glucosidase 저해활성 및 tyrosinase 저해 활성은 각각 IC₅₀ 값이 183.5 ㎍/ml와 323.9 ㎍/ml로 우수한 억제 활성을 보였다. 게다가 RAW 264.7 cell에서 LPS로 염증을 유발시켜 nitric oxide (NO) 억제효과 실험에서 지렁쿠나무 추출물의 IC50 값을 측정하였을 때 NO 생성을 농도의존적으로 저해하는 농도는 36.7 ㎍/ml이고, 추출물 100 ㎍/ml의 농도에서도 독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다. 이상의 결과로부터 지렁쿠나무 추출물은 항산화, 항염증, 미백, 및 항당뇨 효능을 확인할 수 있었으며, 이는 지렁쿠나무가 기능성 식품, 화장품 및 의약품 소재로서의 활용 가능성을 시사한다. 또한, 지렁쿠나무로부터 생리활성물질의 분리 동정과 메커니즘 규명에 관한 연구가 수행되어야 할 것으로 판단된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Sambucus sieboldiana var. miquelii (Nakai) Hara is distributed in Korea, China, and Japan, and has been used as an anti-rheumatic in folk medicine in oriental countries. The present study aims to investigate the potential use of this species in health functional foods, cosmetics, and food preservatives. Methanol extracts of leaves and branches from this plant were prepared to quantitatively analyze the total phenol and flavonoid contents, and to investigate the antioxidative and enzyme inhibitory activities, and the inhibition of nitric oxide (NO) production activity. The results showed that the total polyphenol and flavonoid contents of the crude extract were 1.52±0.1 mg/g and 1.73±0.1 mg/g, respectively. S. sieboldiana polyphenols exhibited potent scavenging activity shown by 2, 2'-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging assay and 2, 2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) radical cation assay. The crude extract also exhibited significant α-glucosidase and tyrosinase inhibitory activity with IC50 values of 183.5 ㎍/ml and 323.9 ㎍/ ml, respectively. Additionally, the crude extract exhibited strong anti-inflammatory activity determined through the nitric oxide inhibition assay in a dose-dependent manner with an IC50 value of 36.7 ㎍/ml and no cytotoxic effect on the macrophages. Therefore, we demonstrated that the leaves and branches of S. sieboldiana extract possess antioxidant, anti-diabetic, depigmentation potential, and NO production inhibitory activities. According to recent research, S. sieboldiana has great potential as a source of the bioactive compound which could be used as food, cosmetics, and pharmaceutical agents.

주제어

표/그림 (4)

그림 Fig. 1. Effect of the sample extract from Sambucus sieboldiana var. miquelii (Nakai) Hara on nitric oxide (NO) production in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated Raw 264.7 cells. LPS, 1 μg/ml; Sample extract, final concentration 12.5, 25, 50, 100 μg/ml respectively. The data shown represent means ± SD of three independent experiments; #p<0.05 vs. the control group; *p<0.05, ***p<0.001 vs. the LPStreated group. The cytotoxicity was determined by MTT assay as described in Materials and Methods.
그림 Fig. 2. Tyrosinase inhibitory activity of the sample extract from Sambucus sieboldiana var. miquelii (Nakai) Hara. Arbutin, 500 μg/ml; Sample extract, final concentration 62.5, 125, 250, 500 μg/ml respectively. The data shown represent means ± SD of three independent experiments; **p<0.01 vs. the control group.
표 Table 1. ABTS , DPPH , total phenolic and total flavonoid contests of methanol extract from the Sambucus sieboldiana var. miquelii (Nakai) Hara
그림 Fig. 3. α-glucosidase inhibitory activity of the sample extract from Sambucus sieboldiana var. miquelii (Nakai) Hara. Acarbose, 500 μg/ml; Sample extract, final concentration 62.5, 125, 250 μg/ml respectively. The data shown represent means ± SD of three independent experiments; *p< 0.05 vs. the control group.

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 딱총나무속의 생리학적인 유용성이 확인되었음에도 아직 지렁쿠나무의 다양한 생리 활성에 대한 구체적인 연구결과가 미흡한 것을 확인한바 지렁쿠나무 잎과 가지 추출물을 이용하여 항산화 활성, 세포독성, tyrosinase 활성, α-glucosidase 활성 및 염증 인자 발현 저해 효과를 확인함으로써 지렁쿠나무의 기능성 바이오 소재 개발 가능성을 확인하고자 한다.
본 연구에서는 지렁쿠나무 추출물에 대한 항염증 효과를 확인하기 위하여 LPS로 염증이 유도된 RAW264.7 macrophage의 세포 독성 및 NO 생성 억제를 확인하였다(Fig. 1). 지렁쿠나무 추출물의 세포독성은 MTT assay를 이용하여 확인하였다.
따라서 항염증 효능을 확인하는 biomarker로써 LPS에 의해 과생성된 대식세포의 NO 생성 억제를 측정하는 방법이 일반적이다. 따라서 본 연구에서는 지렁쿠나무추출물의 항염증 효과를 확인하기 위해 LPS로 과생산된 대식세포의 NO 생성 억제를 확인하였다. 그 결과, 지렁쿠나무 추출물의 농도별(12.
그러나 활성산소종이 만성적으로 발생하거나 항산화 시스템의 기능이 저하되면 지질 과산화 유도, 단백질 및 DNA 손상시켜 세포의 노화와 변형을 유도와 간은 산화적 스트레스가 일어난다. 이런 산화기전 억제 효과를 확인하기 위해 DPPH와 ABTS radical 소거능과 환원력을 본 실험에서 측정하였다. DPPH는 화학적으로 안정화된 free radical을 지닌 수용성 물질로 플라보노이드 및 페놀 화합물과 같은 항산화 활성이 있는 물질에 의해 수소나 전자를 받아들여 불가역적으로 안정한 분자를 형성, 환원됨에 따라 짙은 보라색이 탈색되는 원리를 이용하여 천연물로부터의 항산화 활성을 측정하기 위하여 많이 사용되는 방법이다[36].
본 연구에서는 지렁쿠나무 추출물 처리에 대한 tyrosinase 저해 활성을 평가하였다. 양성대조군은 arbutin을 사용하였다.

제안 방법

배양 후 MTT 용액을 제거하고, dimethyl sulfoxide(DMSO, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 100 μl 첨가하여 포마잔(formazan)을 완전히 용해한 후, 마이크로판독기(multiskan Go, Thermo scientific, USA)를 이용하여 540 nm의 파장에서 그 흡광도를 측정하여 생존율은 백분율로 계산하였다.
배양된 세포에 지렁쿠나무 추출물을 농도별(12.5, 25, 50, 100 μg/ ml)로 처리하여 24시간 반응시킨 후 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 용액을 5 mg/ml 농도로 제조하여 각각 100 μl 처리한 후 2시간 배양하였다.
세포 성장을 위한 배지로는 10% FBS (fetal bovine serum)와 1% antibiotics (penicillin/streptomycin)를 첨가한 Dulbeco’s modified Eagle’s medium high glucose (DMEM) 배지를 이용하여 37℃ 배양기에서 5%의 CO2를 유지하면서 배양하였다.
건조한 지렁쿠나무 잎과 가지를 분쇄한 후 무게의 20배량(w/v)의 95% methanol로 시료가 충분히 잠기도록 하여 상온에서 3일간 침지한 후 총 3회 반복 추출하였다. 추출액은 Filter paper (NO.
FBS와 antibiotics는 Gibco (Rockville, MD, USA), 배지는 Hyclone (Logan, UT, USA)에서 구입하였다. 배양된 세포는 2-3일마다 배지를 교환하면서 실험에 사용하였으며, 세포가 80% 이상 자랐을 때 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS, Gibco, Rockville, MD, USA)로 세척한 후 계대배양하였다.
배양된 세포에 지렁쿠나무 추출물을 최종 농도가 12.5, 25, 50, 100 μg/ml가 되도록 처리하여 2시간 배양 후, 지방질다당류(lipopolysaccharides, LPS)를 최종 농도 1 μg/ml가 되도록 처리한 뒤, 24시간 자극한 후 배양 상층액을 취하여 100 μl씩 새 96 well plate에 옮긴 후 Griess 시약(reagent) 100 μl씩 혼합하여 15분 동안 상온에서 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
지렁쿠나무 추출물은 농도별로 메탄올에 녹여 준비한 후, DPPH 활성 저해율을 측정하기 위해 추출물 5 μl에 6×10-5 M 메탄올에 녹인 DPPH 용액을 195 μl를 가하여 상온 암실에서 15분 반응시키고 Microplate Reader를 사용하여 흡광도를 515 ㎚에서 측정하였다.
5, 25, 50, 100 μg/ml가 되도록 처리하여 2시간 배양 후, 지방질다당류(lipopolysaccharides, LPS)를 최종 농도 1 μg/ml가 되도록 처리한 뒤, 24시간 자극한 후 배양 상층액을 취하여 100 μl씩 새 96 well plate에 옮긴 후 Griess 시약(reagent) 100 μl씩 혼합하여 15분 동안 상온에서 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Sodium nitrite를 이용하여 표준 검량 곡선을 작성하였고 함량 계산에 이용하였다. 실험에 사용한 시약은 모두 Sigma-Aldrich (St.
지렁쿠나무 추출물의 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 방법을 변형하여 측정하였다[36]. 10 mg/ml 농도의 추출물 20 μl를 넣고 Folin-Ciocalteu 시약(Sigma-Aldrich, Co.
상온에서 2시간 동안 반응한 후에 Microplate Reader(Molecular Devices, USA)를 사용하여 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 gallic acid (Sigma-Aldrich, Co., ST. Louis, MO, USA)로 작성한 표준 검량곡선으로 계산하여 구하였다.
지렁쿠나무 추출물의 flavonoid 함량은 Abdel-Hameed[1]의 방법을 변형하여 측정하였다. 각 시료 추출물 50 μl를 넣고 메탄올로 녹인 2% aluminum nitrate (Sigma-Aldrich, Co.
이후 Microplate Reader를 사용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 추출물의 흡광도는 quercetin (Sigma-Aldrich, Co., ST. Louis, MO, USA)으로 작성한 표준 검량곡선으로 계산하여 구하였다.
지렁쿠나무 추출물의 항산화능을 확인하기 위해 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical 소거 활성을 측정하였다[16]. 지렁쿠나무 추출물은 농도별로 메탄올에 녹여 준비한 후, DPPH 활성 저해율을 측정하기 위해 추출물 5 μl에 6×10^-5 M 메탄올에 녹인 DPPH 용액을 195 μl를 가하여 상온 암실에서 15분 반응시키고 Microplate Reader를 사용하여 흡광도를 515 ㎚에서 측정하였다.
지렁쿠나무 추출물은 농도별로 메탄올에 녹여 준비한 후, DPPH 활성 저해율을 측정하기 위해 추출물 5 μl에 6×10^-5 M 메탄올에 녹인 DPPH 용액을 195 μl를 가하여 상온 암실에서 15분 반응시키고 Microplate Reader를 사용하여 흡광도를 515 ㎚에서 측정하였다. 각 추출물의 radical 소거 활성은 50% 저해 농도(Inhibitory Concentration, IC₅₀)를 계산하였다. 양성 대조군은 ascorbic acid (Sigma-Aldrich, Co.
ABTS (2,2-Azino-bis-3-ethylbezothiazoline-6-sulfonic acid) radical을 이용한 항산화력 측정은 ABTS cation decolorization assay에 의한 방법을 일부 변형하여 시행하였다[22]. 7.
희석된 ABTS radical 용액 198 μl에 지렁쿠나무 추출액 2 μl를 넣은 후 실온에서 5분간 반응시켜 735 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 각 추출물의 radical 소거 활성은 50% 저해 농도(Inhibitory Concentration, IC₅₀) 값으로 계산하였고, ascorbic acid를 표준곡선으로 사용하였다.
Folin-Ciocalteu reagent를 사용하여 표준물질인 GA를 10-500 μg/ml로 제조하여 작성한 검정 곡선에 기초하여 총 페놀성 화합물 함량을 측정하였다.
따라서 지렁쿠나무 추출물이 macrophage에 대해 세포독성에 영향을 미치지 않은 농도인 100 μg/ml 이하의 다양한 농도에서 실험을 진행하였다.
플라보노이드 함량은 표준물질인 rutin을 20, 40, 60, 80, 100 μg/ml 농도로 제조하여 작성한 검정 곡선으로부터 비교 정량하였다.

대상 데이터

본 실험에 사용된 지렁쿠나무 잎과 가지는 경상북도 봉화군 묘봉(석포면 석포리) 일대에서 2019년 05월 02일에 채집하여 건조 후 사용하였으며, 국립백두대간수목원 변준기박사가 동정하였다. 지렁쿠나무 표본(BDNA-2019-48)은 국립백두대간 수목원 표본실에 보관하였다.
대식세포 계열(murine macrophage cell line)인 RAW 264.7세포주는 한국 세포주 은행(KCLB No 40071, Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 분양 받아 실험에 사용하였다. 세포 성장을 위한 배지로는 10% FBS (fetal bovine serum)와 1% antibiotics (penicillin/streptomycin)를 첨가한 Dulbeco’s modified Eagle’s medium high glucose (DMEM) 배지를 이용하여 37℃ 배양기에서 5%의 CO₂를 유지하면서 배양하였다.
세포 성장을 위한 배지로는 10% FBS (fetal bovine serum)와 1% antibiotics (penicillin/streptomycin)를 첨가한 Dulbeco’s modified Eagle’s medium high glucose (DMEM) 배지를 이용하여 37℃ 배양기에서 5%의 CO₂를 유지하면서 배양하였다. FBS와 antibiotics는 Gibco (Rockville, MD, USA), 배지는 Hyclone (Logan, UT, USA)에서 구입하였다. 배양된 세포는 2-3일마다 배지를 교환하면서 실험에 사용하였으며, 세포가 80% 이상 자랐을 때 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS, Gibco, Rockville, MD, USA)로 세척한 후 계대배양하였다.
Sodium nitrite를 이용하여 표준 검량 곡선을 작성하였고 함량 계산에 이용하였다. 실험에 사용한 시약은 모두 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구하여 사용하였다.
각 추출물의 radical 소거 활성은 50% 저해 농도(Inhibitory Concentration, IC₅₀)를 계산하였다. 양성 대조군은 ascorbic acid (Sigma-Aldrich, Co., ST. Louis, MO, USA)를 사용하였다.
Tyrosinase 활성 억제능은 37℃에서 20분간 반응시킨 후 490 nm에서 흡광도를 측정하여 시료 용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다. 양성대조구로는 arbutin (Sigma-Aldrich, Co., ST. Louis, MO, USA)을 사용하였다.
혼합액에 100 mM sodium carbonate 100 μl를 넣어 반응을 정지시키고 흡광도를 UV-spectrometer를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하여 시료 용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다. 양성대조구로는 acarbose (Sigma-Aldrich, Co., ST. Louis, MO, USA)을 사용하였다.
본 연구에서는 지렁쿠나무 추출물 처리에 대한 tyrosinase 저해 활성을 평가하였다. 양성대조군은 arbutin을 사용하였다. 지렁쿠나무 추출물을 농도별(62.

데이터처리

본 실험에서 얻어진 결과에 모든 값은 3회 이상의 반복 실험의 측정값의 평균(mean)±표준오차(SD)로 나타내었으며, 각 실험 결과 값에 대한 통계적 분석은 student’s t-test를 이용하여 분석하였으며, p값이 0.05 미만(p-value<0.05)이면 유의성이 있다고 판단하였다.

이론/모형

세포의 생존율 정도를 확인하기 위하여 MTT 시험법으로 측정하였다. RAW 264.
α-Glucosidase에 대한 저해 활성 측정은 Tibbot과 Skadsen의 방법에 따라 pNPG (p-nitrophenyl β-D-glucoside)에서 유리되어 나오는 반응 생성물인 p-nitrophenol을 측정하여 수행하였다[17].
멜라닌(Melanin) 합성 주요 단계에 관여하는 tyrosinase 저해 활성 측정은 효소 작용 결과 형성되는 DL-β-3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) chrome을 비색법으로 측정하였다[28].
NO는 대표적인 자유라디칼 중 하나로 생체 내에서 중요한 세포 신호전달물질로서 작용하고 있으며, 세포막을 쉽게 통과할 수 있는 성질이 있어 생체 내에서 다양한 작용을 하나 과잉 생산 시 산화적 스트레스의 유발을 통해 염증 및 세포 손상의 원인이 된다[15, 26]. 배양액 내의 산화질소(II) 함량 측정은 아질산염(nitrite)을 산화질소(II) 생산의 지표로 이용한 Griess 반응을 이용하여 실시하였다. RAW 264.
1). 지렁쿠나무 추출물의 세포독성은 MTT assay를 이용하여 확인하였다. 지렁쿠나무 추출물은 100 μg/ml 농도에서 세포 생존율이 99.

성능/효과

그 결과, 지렁쿠나무 추출물의 농도별(12.5, 25, 50, 100 μg/ml) 처리에 대한 NO 생성이 각각 23.5%, 43.2%, 79.6%, 96.3% 로 모두 유의적으로 감소시키는 것으로 나타나 항염 효과가 매우 우수함을 확인하였다(Fig. 1).
지렁쿠나무 추출물은 100 μg/ml 농도에서 세포 생존율이 99.5%로 측정되어 고농도 처리에서도 세포 생존에 영향을 미치지 않아 지렁쿠나무 추출물의 RAW264.7 macrophage에 대한 독성이 없음을 확인할 수 있었다.
지렁쿠나무 추출물을 농도별(62.5, 125, 250, 500 μg/ml)로 처리하여 tyrosinase의 저해 활성에 관하여 평가한 결과, 각각 15.4%, 35.6%, 46.9%, 54.5%의 저해능이 나타났다(Fig. 2).
지렁쿠나무 추출의 DPPH 라디칼 소거 활성의 IC50은 124.0 μg/ml, ABTS 라디칼 소거 활성의 IC50은 85.6 μg/ml로 나타났다(Table 1).
지렁쿠나무 추출물의 폴리페놀 및 플라보노이드 분석 결과, 폴리페놀 함량은 mg/g, 플라보노이드 함량은 1.73±0.1 mg/g으로 측정되었다(Table 1).
2). 지렁쿠나무 추출물의 처리 농도가 증가함에 따라 유의적으로 tyrosinase를 억제하는 것으로 관찰되었다. 따라서 지렁쿠나무 추출물의 처리는 melanin 형성에 관여하는 tyrosinase 효소활성을 억제함으로써 멜라닌 생합성 저해에 기여하는 것으로 생각된다.
지렁쿠나무 추출물의 농도별(62.5, 125, 250 μg/ml) 처리에 대한 α-glucosidase 저해 활성이 각각 27.9%, 45.7%, 53.7% 억제되는 것으로 나타났다.
지렁쿠나무 추출물 250 μg/ml 농도에서 53.7% 억제되는 결과는 positive control로 사용된 acarbose 500 μg/ml 농도에서 54.4% 억제되는 것과 유사한 활성을 나타내었다(Fig. 3).
지렁쿠나무 추출물의 처리 농도가 증가함에 따라 유의적으로 tyrosinase를 억제하는 것으로 관찰되었다. 따라서 지렁쿠나무 추출물의 처리는 melanin 형성에 관여하는 tyrosinase 효소활성을 억제함으로써 멜라닌 생합성 저해에 기여하는 것으로 생각된다.

후속연구

6 μg/ml로 나타났다(Table 1). 이는 postive control인 BHT, viatmin과 비교해서도 더 우수한 결과를 나타내어 천연 항산화제로서의 산업화 적용 가능성은 매우 높다고 할 수 있을 것이다.
최근 부작용이 적은 천연물로부터 α-glucosidase 저해활성을 조사하여 혈당조절 효과가 우수한 소재를 발굴하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 지렁쿠나무 추출물은 혈당 조절에 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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