[논문]홍맥 추출물의 3T3-L1세포에 대한 지방 축적 저해 활성평가

권기석; 김병혁; 이준형; 황학수; 이중복

doi:10.5352/jls.2021.31.2.192

홍맥 추출물의 3T3-L1세포에 대한 지방 축적 저해 활성평가
Evaluation of Lipid Accumulation's Inhibitory Activity on 3T3-L1 Cells with Red Yeast Barley Extracts 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.31 no.2, 2021년, pp.192 - 198

권기석 (국립안동대학교 생명과학대학 원예생약융합학부) , 김병혁 (교촌에프앤비(주) 교촌중앙연구소) , 이준형 (국립안동대학교 생명과학대학 원예생약융합학부) , 황학수 (교촌에프앤비(주) 교촌중앙연구소) , 이중복 (교촌에프앤비(주) 교촌중앙연구소)

초록
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홍국은 동아시아 국가에서 예로부터 음식과 전통의학에 이용되어 왔다. 홍국은 특정 미생물(일반적으로 Monascus purpureus)이 쌀을 발효시켜 생산되어진다. Monascus sp.는 2차 대사과정을 통해 Monascus 색소, monacolins, γ-aminobutyric acid 등을 생산할 수 있다. Monascus 종의 대사산물인 monacolin K, γ-aminobutyric acid와 dimerumic acid 및 monascus pigments는 항산화 효과, 콜레스테롤과 혈압과 항비만 효과들이 알려져 있다. 본 연구에서는 Monascus sp.로 발효된 홍맥 에탄올 추출물의 항비만 활성을 알아보고자 지방 세포를 이용하여 실험을 실시하였다. 홍국 에탄올 추출물의 항비만 효과는 MDI로 유도된 3T3-L1 전지방세포의 Oil Red O staining과 Real time RT-PCR을 이용하여 비만 유전자 발현을 통해 확인하였다. 홍맥 추출물을 3T3-L1 전지방세포에 각각 200 ㎍/ml, 400 ㎍/ml, 800 ㎍/ml을 처리한 결과 5.04%, 12.24%, 23.52%로 지방축적을 감소시키는 것을 확인하였다. 또한, 홍맥 추출물은 3T3-L1 전지방세포로부터의 C/EBPα, SREBP-1, PPAR-γ 유전자의 발현이 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인하였다. 본 연구를 통해 홍맥 추출물의 지방 합성 억제활성을 확인하였으며, 향후 항비만 기능성 식품소재로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Red yeast rice has been extensively used as food and traditional medicine for thousands of years in East Asian countries. It is produced by the fermentation of a particular yeast (in general, Monascus purpureus) as rice and various cereals (barley, soybean, etc.). Monascus sp. produces many secondary metabolites during its growth, including pigments, monacolins, and γ-aminobutyric acid. Some metabolites―specifically, monacolin K, γ-aminobutyric acid, dimerumic acid, and monascus pigments―have been reported to lower cholesterol and blood pressure while showing anti-obesity effects. In this study, we investigated the anti-obesity effect of ethanol extract from red yeast barley (RYB) fermented with Monascus sp. BHN-MK 2 on 3T3-L1 cells. The anti-obesity effects of RYB extract were examined: its lipid accumulation inhibitory effect was tested by Oil Red O staining, and obesity-related mRNA expression levels were tested by real-time RT-PCR in MDI stimulated 3T3-L1 cells. The intracellular lipid content of MDI-stimulated 3T3-L1 cells decreased significantly to 5.04%, 12.24%, and 23.52% in response to 200, 400, and 800 ㎍/ml RYB, respectively. Moreovers, we evaluated that RYB extract significantly downregulated the expression of C/EBPα, SREBP-1, and PPAR-γ gene in a dose-dependent manner. As a result, red yeast barley ethanol extracts exerted the strongest anti-obesity effects. Also, the results indicate that red yeast barley could be used as a functional anti-obesity food material.

주제어

표/그림 (6)

그림 Fig. 1. Cell viability of 3T3-L1 adipocytes under various concen-trations of Red Yeast Barely (RYB) extracts by MTT assay. 3T3-L cells were cultured in DMEM media in 96 well microtiter plate and after attachment different con-centrations of RYB extracts were added to different wells contained same number of cells. Cells without treatment, only with DMEM was taken as control. Cell viability was calculated for each group by checking the absorbance of the dissolved formazan crystals in DMSO after addi-tion of MTT reagent. Safe and toxic concentrations were determined. Data are expressed as mean ± SEM of five different experiments.
표 Table 1. Primer sequences for Real-Time Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) analysis
그림 Fig. 2. Effects of RYB extracts on lipid droplet formation in 3T3- L1 cells. It was stained with Oil Red O dye and examined using a light microscope. It was captured at 9^th day for adipocyte differentiation. A: the control group cultured with DMEM, B: Positive control group that was cultured using MDI mixed DMEM, C: Negative control group cul-tured with 0.5% DMSO mixed DMEM. Each picture from D to F was cultured with 200, 400, and 800 μg/ml RYB samples in adipocyte differentiation culture media.
그림 Fig. 3. Quantification of the stained lipid droplets were per-formed using the eluted Oil red O stain via measuring absorbance at 490 nm. The readings were normalized to background values of non-induced control DMEM. The OD values of all treatment conditions were com-pared to the adipogenic control group.
그림 Fig. 4. Gene expression in 3T3-L1 cell depending on effect of red yeast barley (RYB). RT-PCR shows gene expression level of differ-entiation for adipocyte formation. A: C/EBP-α, B: SREBP-1, C: PPAR-γ. It was analyzed based on GAPDH as housekeeping gene. The data was expressed as mean ± SEM of three different experiments
표 Table 2. Quantification and ORO reduce rate (%) of the stained lipid droplets were performed using the eluted Oil red O stain via measuring absorbance at 490 nm

AI 본문요약
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문제 정의

반면에 홍국균을 이용해 보리를 발효하고 홍맥으로서의 쓰임과 그에 대한 연구 및 산업화는 미비한 실정이다. 본 연구는 홍맥 추출물을 세포에 직접 처리하고, 홍맥 추출물에 대한 전지방세포의 지방분화능을 평가한 것에 가치가 있다. 이 연구를 기초로 하여 향후 항비만 활성 성분의 분리 또는 정제, 항비만 작용 기전 분석 등의 연구가 이루어 진다면 보리를 활용한 홍맥의 고부가가치화 및 산업화를 위한 기초자료로서 활용될 수 있을 것이다.
BHN-MK 2를 접종 및 배양하여 생산된 홍맥을 70% 에탄올을 이용해 추출하고, 그 추출물이 3T3-L1 전지방세포 모델의 분화 및 지방 축적에 미치는 영향을 관찰하였다. 본 연구를 바탕으로 홍맥의 지방 축적 억제 기능성을 확인하고 비만 예방 소재 또는 다이어트용 기능성 식품소재로의 가능성을 검토하고자 한다.
본 연구에서는 홍맥 추출물의 항비만 효과를 연구하기 위해 3T3-L1 전지방세포에 분화유도물질인 MDI와 홍맥 추출물을 함께 처리하여 분화 과정 중 홍맥 추출물의 지방축적 억제 효과를 확인하고자 하였다.

제안 방법

따라서 본 연구에서는 보리에 Monascus sp. BHN-MK 2를 접종 및 배양하여 생산된 홍맥을 70% 에탄올을 이용해 추출하고, 그 추출물이 3T3-L1 전지방세포 모델의 분화 및 지방 축적에 미치는 영향을 관찰하였다. 본 연구를 바탕으로 홍맥의 지방 축적 억제 기능성을 확인하고 비만 예방 소재 또는 다이어트용 기능성 식품소재로의 가능성을 검토하고자 한다.
MDI를 처리하여 지방세포로 분화된 3T3-L1 전지방세포에홍맥 추출물을 농도별로 처리하여 지방세포 내에 형성된 lipid droplet을 염색하여 지방의 양을 간접적으로 측정하였다. Oil Red O 염색 시약은 3T3-L1 전지방세포의 생존에 영향을 미치지 않는 100 ug/ml을 처리하였으며 세포 내 lipid droplet 염색을 통해 확인한 결과, MDI 만을 처리하여 배양시킨 양성대조군에서는 세포 내 lipid droplet의 형성이 확인되었다(Fig.
분화유도 물질을 처리한 후 2일 마다 FBS 포함 DMEM, 10 μg/ml insulin과 농도별 시료를 교환하여 10일 동안 분화시키면서 지방축적을 관찰하였다.

대상 데이터

마우스 유래 3T3-L1 전지방세포주는 American Type Cul- ture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 분양 받아 사용하였다. Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM, 1X, high glucose) (Welgene, Gyeongsan, Korea)에 10% Bovine Calf Serum (BCS, Welgene, Gyeongsan, Korea)과 1% Antibi- otic antimycotic solution (Welgene, Gyeongsan, Korea)을 첨가하여 100% confluence 될 때까지 배양하였다.

이론/모형

홍맥 추출물에 대한 세포 생존율 분화된 3T3-L1 전지방세포와 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) colorimetric assay 방법을 통해 확인하였다 (Fig. 1).

성능/효과

3T3-L1 전지방세포에 MDI와 홍맥 추출물을 처리하여 10일간 분화를 유도하고 시험물질을 반응시킨 결과, 홍맥 추출물을 처리하지 않고 분화유도 물질(MDI)만 처리된 세포는 세포질 내 지방구(lipid droplet)의 형성이 활발하게 유도된 것으로 확인되었다(Fig. 2B).
세포 기반 MTT assay를 통해 홍맥 추출물의 세포 독성을 확인한 결과, 800 ug/ml 농도까지 세포의 생존을 확인하였으며, 가장 높은 농도인 800 μg/ml까지 90% 이상의 생존률을확인하였으며, 홍맥 추출물의 지방분화 억제 활성을 평가하기 위한 처리 농도는 200, 400, 800 μg/ml로 설정하였다. MTT assay를 통해 홍맥 추출물은 세포 생존률에 변화가 없음을 확인하고 3T3-L1에 안전성을 확인하였다.
77%의 발현 억제 활성을 확인하였다. SREBP-1의 발현은 세포 내 처리된 홍맥 추출물의 농도가 증가됨에 따라 각각 1.41, 1.23, 0.99 로 확인되어 MDI 처리군값 2.18 대비 35.32%, 43.58%, 54.58% 의 저해가 확인되었다. PPAR-γ의 발현은 200 ug/ml 농도일 때 4.
세포 기반 MTT assay를 통해 홍맥 추출물의 세포 독성을 확인한 결과, 800 ug/ml 농도까지 세포의 생존을 확인하였으며, 가장 높은 농도인 800 μg/ml까지 90% 이상의 생존률을확인하였으며, 홍맥 추출물의 지방분화 억제 활성을 평가하기 위한 처리 농도는 200, 400, 800 μg/ml로 설정하였다
2F). 이는 Oil Red O 염색을 통해 확인한 결과로, 지방구(lipid droplet)의 수는 큰 차이를 보이지 않으나 처리된 홍맥 추출물의 농도가 높을수록 지방구의 크기가감소된다고 판단할 수 있었다.
3). 이를 통해 홍맥 추출물이 세포 생존에 영향을 끼치지 않고 지방 세포 분화만을 억제하는 것을 나타내며 홍맥이 3T3-L1 전지방세포구의 지방구 억제에 효과가 있음을 확인하였다.
2B). 하지만 분화유도 물질(MDI)과 홍맥 추출물이 함께 처리된 세포의 경우, 첨가된 홍맥 추출물의 농도에 따라 3T3-L1 전지방세포의 지방세포로 분화 및 지방구(lipid droplet)의 성장이 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인하였다(Fig. 2D ~ Fig.

후속연구

이 연구를 기초로 하여 향후 항비만 활성 성분의 분리 또는 정제, 항비만 작용 기전 분석 등의 연구가 이루어 진다면 보리를 활용한 홍맥의 고부가가치화 및 산업화를 위한 기초자료로서 활용될 수 있을 것이다. 또한, 홍맥과 홍맥 추출물의 다양한 효능과 작용 기전이 검증을 통해 항비만 소재로서 대사증후군 관련 증상 또는 질환의 개선을 위한 기능성 소재로서 활용이 가능할 것으로 기대된다.
본 연구는 홍맥 추출물을 세포에 직접 처리하고, 홍맥 추출물에 대한 전지방세포의 지방분화능을 평가한 것에 가치가 있다. 이 연구를 기초로 하여 향후 항비만 활성 성분의 분리 또는 정제, 항비만 작용 기전 분석 등의 연구가 이루어 진다면 보리를 활용한 홍맥의 고부가가치화 및 산업화를 위한 기초자료로서 활용될 수 있을 것이다. 또한, 홍맥과 홍맥 추출물의 다양한 효능과 작용 기전이 검증을 통해 항비만 소재로서 대사증후군 관련 증상 또는 질환의 개선을 위한 기능성 소재로서 활용이 가능할 것으로 기대된다.

참고문헌 (35)

Behall, K. M., Scholfield, D. J. and Hallfrisch, J. 2004. Diets containing barley significantly reduce lipids in mildly hypercholesterolemic men and women. Am. J. Clin. Nutr. 80, 1185-1193.

상세보기
Chawla, A., Schwarz, E. J., Dimaculangan, D. D. and Lazar, M. A. 1994. Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) gamma: adipose-predominant expression and induction early in adipocyte differentiation. Endocrinology 135, 798-800.

상세보기
Cho, E. J., Lee, S. S. and Kwon, D. J. 2017. Manufacture technology of tofu shake added with red rice. Kor. J. Food Preserv. 24, 942-948.

원문보기 상세보기
Choi, B. H., Ahn, I. S., Kim, Y. H., Park, J. W., Lee, S. Y., Hyun, C. K. and Do, M. S. 2006. Berberine reduces the expression of adipogenic enzymes and inflammatory molecules of 3T3-L1 adipocyte. Exp. Mol. Med. 38, 599.

상세보기
Endo, A. 1979. Monacolin K, a new hypocholesterolemic agent produced by a Monascus species. J. Antibiot. 32, 852-854.
Eun, C. S., Hwang, E. Y., Lee, S. O., Yang, S. A. and Yu, M. H. 2016. Anti-oxidant and anti-inflammatory activities of Barley sprout extract. J. Life Sci. 26, 537-544.

원문보기 상세보기
Gregoire, F. M., Smas, C. M. and Sul, H. S. 1998. Understanding adipocyte differentiation. Physiol. Rev. 78, 783-809.

상세보기
Hong, H., Park, J., Lumbera, W. L. and Hwang, S. G. 2017. Monascus ruber-fermented buckwheat (Red yeast buckwheat) suppresses adipogenesis in 3T3-L1 cells. J. Med. Food 20, 352-359.

상세보기
Huang, C. F., Li, T. C., Lin, C. C., Liu, C. S., Shih, H. C. and Lai, M. M. 2007. Efficacy of Monascus purpureus went rice on lowering lipid ratios in hypercholesterolemic patients. Eur. J. Cardiovasc. Prev. Rehabil. 14, 438-440.

상세보기
Jeon, C. P., Lee, J. B., Choi, C. S. and Kwon, G. S. 2011. Physiological effect of Yogurt with powder two stage fermented Dioscorea batatas dence by Monascus sp. and Lactobacillus sp. Kor. J. Microbiol. 47, 151-157.
Jeon, T., Hwang, S. G., Hirai, S., Matsui, T., Yano, H., Kawada, T., Lim, B. O. and Park, D. K. 2004. Red yeast rice extracts suppress adipogenesis by down-regulating adipogenic transcription factors and gene expression in 3T3-L1 cells. Life Sci. 75, 3195-3203.

상세보기
Kim, S. O., Kim, M. R., Hwang, K. A., Park, N. J. and Jeong, J. S. 2017. Inhibition of differentiation and anti-adipogenetic effect of the Salvia plebeia R. Br. ethanol extract in murine adipocytes, 3T3-L1 cells. J. Kor. Soc. Food Sci. Nutr. 46, 401-108.

원문보기 상세보기
Koutnikova, H. and Auwerx, J. 2001. Regulation of adipocyte differentiation. Ann. Med. 33, 556-561.

상세보기
Lakota, K., Wei, J., Carns, M., Hinchcliff, M., Lee, J., Whitfield, M. L., Sodin-Semrl, S. and Varga, J. 2012. Levels of adiponectin, a marker for PPAR-gamma activity, correlate with skin fibrosis in systemic sclerosis: potential utility as biomarker? Arthritis Res. Ther. 14, R102.

상세보기
Lee, K. S. and Park, G. S. 2014. Studies in the consumption and preference for sprout vegetable. J. East Asian Soc. Dietary Life 24, 896-905.
Ma, J., Li, Y., Ye, Q., Li, J., Hua, Y., Ju, D., Zhang, D., Cooper, R. and Chang, M. 2000. Constituents of red yeast rice, a traditional Chinese food and medicine. J. Agr. Food Chem. 48, 5220-5225.

상세보기
McNeel, R. L. and Mersmann, H. J. 2003. Effects of isomers of conjugated linoleic acid on porcine adipocyte growth and differentiation. J. Nutr. Biochem. 14, 266-274.

상세보기
Moreno, D. A., Ilic, N., Poulev, A., Brasaemle, D. L., Fried, S. K. and Raskin, I. 2003. Inhibitory effects of grape seed extract on lipases. Nutrition 19, 876-879.

상세보기
Morrison, R. F. and Farmer, S. R. 2000. Hormonal signaling and transcriptional control of adipocyte differentiation. Nutr. J. 130, 3116S-3121S.

상세보기
Ntambi, J. M. and Kim, Y. C. 2000. Adipocyte differentiation and gene expression. Nutr. J. 130, 3122S-3126S.

상세보기
Ono, Y., Hattori, E., Fukaya, Y., Imai, S. and Ohizumi, Y. 2006. Anti-obesity effect of Nelumbo nucifera leaves extract in mice and rats. J. Ethnopharmacol. 106, 238-244.

상세보기
Park, E. S., Lee, S. M. and Park, K. Y. 2018. In vitro anti-obesity effects of Kimchi prepared with solar salts without bittern on 3T3-L1 Adipocytes. J. Kor. Soc. Food Sci. Nutr. 47, 229-234.

상세보기
Park, Y. S., Nam, G. H., Jo, K. J., Kawk, H. W., Kim, M. J., Kim, J. T., Jang, S. H., Kim, M. J. and Kim, Y. M. 2020. The anti-obesity effect of Barley sprout ethanol extract. KSBB J. 35, 72-77.

상세보기
Patakova, P. 2012. Monascus secondary metabolites: production and biological activity. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 40, 169-181.

상세보기
Patel, L., Buckels, A. C., Kinghorn, I. J., Murdock, P. R., Holbrook, J. D., Plumpton, C., Macphee, C. H. and Smith, S. A. 2003. Resistin is expressed in human macrophages and directly regulated by PPARγ activators. Biochem. Biophys. Res. Commun. 300, 472-476.

상세보기
Poppitt, S. D., Van Drunen, J. D., McGill, A. T., Mulvey, T. B. and Leahy, F. E. 2007. Supplementation of a high-carbohydrate breakfast with barley β-glucan improves postprandial glycaemic response for meals but not beverages. Asia Pac. J. Clin. Nutr. 16, 16-24.
Reynolds, C. J., Koszewski, N. J., Horst, R. L., Beitz, D. C. and Goff, J. P. 2019. Localization of the 1, 25-dihydroxyvitamin d-mediated response in the intestines of mice. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 186, 56-60.

상세보기
Rosen, E. D. and MacDougald, O. A. 2006. Adipocyte differentiation from the inside out. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 885.

상세보기
Rosen, E. D. and Spiegelman, B. M. 2000. Molecular regulation of adipogenesis. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 16, 145-171.

상세보기
Sargent, J. M. and Taylor, C. G. 1989. Appraisal of the MTT assay as a rapid test of chemosensitivity in acute myeloid leukaemia. Br. J. Cancer 60, 206-210.

상세보기
Sferrazzo, G., Palmeri, R., Vanella, L., Parafati, L., Ronsisvalle, S., Biondi, A., Basile, F., Li Volti, G. and Barbagallo, I. 2019. Mangifera indica L. leaf extract induces adiponectin and regulates adipogenesis. Int. J. Mol. 20, 3211.

상세보기
Shimizu, C., Kihara, M., Aoe, S., Araki, S., Ito, K., Hayashi, K., Watari, J., Sakata, Y. and Ikegami, S. 2008. Effect of high beta-glucan barley on serum cholesterol concentrations and visceral fat area in Japanese men--a randomized, double-blinded, placebo-controlled trial. Plant Foods Hum. Nutr. 63, 21-25.

상세보기
Srianta, I., Ristiarini, S., Nugerahani, I., Sen, S. K., Zhang, B. B., Xu, G. R. and Blanc, P. J. 2014. Recent research and development of Monascus fermentation products. Int. Food Res. J. 21, 1-12.
Tsukahara, M., Shinzato, N., Tamaki, Y., Namihira, T. and Matsui, T. 2009. Red yeast rice fermentation by selected Monascus sp. with deep-red color, lovastatin production but no citrinin, and effect of temperature-shift cultivation on lovastatin production. Appl. Biochem. Biotechnol. 158, 476-482.

상세보기
Tu, T. H., Kim, C. S., Nam Goong, I. S., Nam, C. W., Kim, Y. I., Goto, T., Kawada, T., Park, T., Yoon Park, J. H., Ryoo, Z. Y., Park, J. W. Choi, H. S. and Yu, R. 2015. 4-1BBL signaling promotes cell proliferation through reprogramming of glucose metabolism in monocytes/macrophages. FEBS J. 282, 1468-1480.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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