[논문]인체 폐암 세포주 A549에서 Euonymus porphyreus 추출물의 항산화 및 항암활성 분석

진수정; 오유나; 손유리; 배수빈; 박정하; 김병우; 권현주

doi:10.5352/jls.2021.31.2.199

인체 폐암 세포주 A549에서 Euonymus porphyreus 추출물의 항산화 및 항암활성 분석
Antioxidant and Anticancer Activities of Euonymus porphyreus Extract in Human Lung Cancer Cells A549 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.31 no.2, 2021년, pp.199 - 208

진수정 (동의대학교 생체조직재생 핵심연구지원센터) , 오유나 (동의대학교 생체조직재생 핵심연구지원센터) , 손유리 (동의대학교 생체조직재생 핵심연구지원센터) , 배수빈 (동의대학교 생체조직재생 핵심연구지원센터) , 박정하 (동의대학교 생체조직재생 핵심연구지원센터) , 김병우 (동의대학교 블루바이오 소재개발센터) , 권현주 (동의대학교 생체조직재생 핵심연구지원센터)

초록
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Euonymus porphyreus는 노박덩굴과에 속하는 식물로 동아시아 지역에 널리 분포하며, 식물학상의 특징에 대한 보고는 있으나 항산화능과 항암활성 등에 관한 연구는 아직까지 밝혀진 바가 없다. 이에 본 연구에서는 인체 폐암세포인 A549를 사용하여 E. porphyreus 에탄올 추출물(EEEP)의 항산화 및 항암활성과 그 분자적 기전에 관하여 연구하였다. 먼저 EEEP의 총 폴리페놀 화합물과 플라보노이드 함량을 측정한 결과, 각각 115.42 mg/g, 23.07 mg/g이었다. EEEP의 DPPH radical 소거활성을 측정한 결과, IC50가 11.09 ㎍/ml로 뛰어난 항산화능을 보유한 것을 확인하였다. 또한 EEEP는 농도의존적으로 인체폐암세포주인 A549의 세포 성장을 저해하였으며, 세포 주기 변화를 분석한 결과 A549 세포의 SubG1기 세포비율이 증가하는 것을 확인하였다. Annexin V 염색과 DAPI 염색으로 EEEP 처리에 의해 apoptotic 세포와 apoptotic body가 증가하는 것을 확인하였으며, 이러한 결과는 EEEP에 의해 A549 세포의 apoptosis가 유도되는 것을 시사한다. 또한 관련 단백질들의 발현변화를 분석한 결과, EEEP에 의해 Fas, p53, Bax의 발현이 증가하고 Bcl-2의 발현은 감소하였으며, caspase-8, -9와 caspase-3의 활성화를 통해 PARP가 분해되어 apoptosis가 유도되었음을 확인하였다. 이러한 결과들로부터 EEEP는 내인성 및 외인성 경로를 통한 apoptosis 유도에 의하여 A549 세포의 증식을 억제하는 항암활성을 보유하였음을 확인하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

Euonymus porphyreus, a species of plant in the Celastraceae family, is widely distributed in East Asia, especially in Southern China. The botanical characteristics of E. porphyreus have been reported, but its antioxidative and anticancer activities remain unclear. In this study, we evaluated the antioxidative and anticancer effects of ethanol extracts of E. porphyreus (EEEP) and the molecular mechanism of its anticancer activity in human lung adenocarcinoma A549 cells. The total polyphenol and flavonoid compound contents from EEEP were 115.42 mg/g and 23.07 mg/g, respectively. EEEP showed significant antioxidative effects with a concentration at 50% of the inhibition (IC50) value of 11.09 ㎍/ml, as measured by 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging assay. EEEP showed cytotoxic activity by increasing the SubG1 cell population of A549 cells in a dose-dependent manner. Apoptosis in A549 cells treated with EEEP was evident due to increased apoptotic cells and apoptotic bodies, as detected by Annexin V and 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining, respectively. EEEP-induced apoptosis resulted in increased expression of the First apoptosis signal (Fas), p53, and Bax, with decreased expression of Bcl-2 and subsequent activation of caspase-8, -9, and caspase-3, leading to cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP). Collectively, these results suggest that EEEP may exert an anticancer effect by inducing apoptosis in A549 cells through both intrinsic and extrinsic pathways.

주제어

표/그림 (7)

표 Table 1. Contents of total polyphenol and flavonoid compounds, and DPPH activity of ethanol extract of Euonymus por-phyreus
표 Table 2. Cell cycle distribution of ethanol extract of Euonymus porphyreus
그림 Fig. 1. Effects of EEEP on cell growth and morphology in human lung carcinoma A549 cells. (A) Human fetal lung IMR90 cell line as a normal cell control and human lung adenocarcinoma A549 cells, hu-man colon adenocarcinoma HT29 cells and hu-man hepatocellular carcinoma HepG2 cells were treated with indicated concentration of EEEP for 48 hr. Cytotoxic effect of EEEP was determined by WST assay. Results are expressed as percent-age of the vehicle treated control ± SD of three independent experiments. *p<0.01 and **p<0.005 compared with dissolved in dimethyl sulfoxide treated cells. (B) Morphological changes by EEEP in A549 cells. The cells were treated with in-dicated concentration of EEEP for 48 hr, and then visualized by light microscopy. Magnification, ×100 and ×200.
그림 Fig. 2. Induction of SubG1 accumulation in EEEP-treated A549 cells. A549 Cells were cultured and treated with EEEP for 48 hr. Cells were harvested, and then stained with propidium iodide for 30 min and analyzed by flow cytometry. DNA-flourescence histogram is shown. M1, SubG1 phase; M2, G1 phase; M3, S phase; M4, G2/M phase.
그림 Fig. 3. Apoptosis induction by EEEP in A549 cells. A549 cells were cultured and treated with indicated concentrations of EEEP for 48 hr. Cells were harvested and stained with Muse™ Annexin V & Dead Cell Kit for 20 min, followed by analysis using Muse™ Cell Analyzer. The X axis shows the intensity of Annexin V fluorescence and the Y axis shows that of 7-AAD fluorescence. Dot plots rep-resented four independent sections (UL: dead cells, UR: late apoptotic/dead cells, LL: live cells, LR: early apop-totic cells).
그림 Fig. 4. Apoptotic morphological changes of A549 cells by EEEP. Cells were treated with indicated concentrations of EEEP for 48 hr. The cells were fixed and stained with DAPI for 20 min. The stained cells were observed by fluo-rescence microscopic analysis and imaged using Axio Vision Program. Arrows indicate the apoptotic bodies. Scale bars, 50 μm.
그림 Fig. 5. Modulation of apoptosis-related protein expression in A549 cells by EEEP. EEEP-treated A549 cells were lysed and proteins were then separated by SDS-PAGE, followed by Western blotting using antibodies against (A) p53, Fas, Bax and Bcl-2, (B) caspase-3, -8, -9 and PARP. Actin was used as an internal control. (C, D) Relative band intensity of apoptosis-related proteins was normalized against the signal intensity of actin internal control for each sample. *p<0.05 and **p<0.01 compared with dissolved in dimethyl sulfoxide treated cells.

AI 본문요약
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제안 방법

암세포 성장에 미치는 EEEP의 영향을 알아보기 위하여 인체 폐암세포 A549, 인체 대장암세포 HT29, 인체 간암세포 HepG2 등 다양한 암세포주와 정상 폐섬유모세포인 IMR90에적정농도의 EEEP를 처리하고 48시간 배양 후 WST assay를 실시하였다. 그 결과, Fig.

대상 데이터

본 실험에서 사용한 E. porphyreus 에탄올 추출물은 해외 생물 소재 허브센터(한국생명공학연구원; 분양번호 FBM123-020) 에서 구입하였다. E.

데이터처리

실험의 측정결과는 평균(mean) ± 표준편차(SD)로 나타내었으며, 각 실험군 사이의 통계학적 유의성 검정은 student’s t test를 통해 p값이 0.05 미만(p-value<0.05)인 경우 유의성이 있는 것으로 평가하였다.

성능/효과

1A에서와 같이 정상 세포(IMR90)에서는 EEEP에 의한 세포독성이 관찰되지 않았으나, 인체 폐암 세포인 A549의 경우, EEEP 농도의존적으로 세포 생존율이 감소되는 것을 확인하였으며, 200 μg/ml EEEP의 처리에 의해 약 51.5%의 A549 세포의 사멸 효과가 관찰되었다
반면에 HT29와 HepG2에서는 유의미한 세포 성장 억제 효과는 확인되지 않았다. 또한, EEEP의 처리에 따른 A549 세포의 형태 변화를 도립현미경으로 관찰하였으며, 그 결과, EEEP의 농도가 증가할수록 A549 세포의 수가 감소하고 세포의 형태가 불규칙적으로 변하여 세포의 밀도가 점차 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1B).
1B). 이러한 결과로부터 EEEP는 폐암 세포주에 더 효과적으로 세포 사멸을 유도하는 것을 알 수 있었다. 따라서 이후 실험은 A549 세포를 사용하여 수행하였다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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