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문제 정의
- GPCR 은 새로운 살충표적 개발을 위한 잠재적 표적들 중 하나로 인식되고 있다[16]. 본 연구는 다른 온도조건 아래, 배추좀나방의 생리적 대사중심인 지방체에서 GPCR 발현 차이를 확인하기 위해, 전사체 분석을 통해서 GPCR을 동정하고, 차등발현 유전자 발현양을 추정하였다. 전사체 분석을 통해 Family A, B, F에 속하는 다양한 GPCR이 지방체에서 발현되었다.
제안 방법
- 또한 non-coding RNA를 제거하기 위해, Ribo-Zero Plus rRNA Depletion Kit(Illumina, USA)을 사용하였다. Short read sequencing을 위한 정제된 mRNA 절편 화를 수행하였고, cDNA 합성을 위한 역전사 과정을 수행하였다. cDNA 절편의 양끝에 adaptor를 붙이고, PCR을 수행하였다.
- 대략적인 read quality, 전체염기의 수, 절편수의 GC (%) 등을 산출하였다. Trimmomatic (Ver. 0.32; [17])를 사용하여, low quality read, adaptor 서열, DNA 오염 등의 분석 결과에 영향을 미칠 수 있는 요소들을 제거하였다. 모든 시료에서 교정된 read들은 전사 체를 구축하는데 사용되었으며, Trinity 프로그램을 이용하여 합쳐진 결과들을 구축하였다[18].
- gov/blast)를 이용하였다. Unigene 유전자의 발현빈도는 전사체 기반 차등발현 유전자 발현양(Fragments Per Kilobase of transcript per Million, FPKM)으로 분석하였고, 발현의 수준은 read count로 산출하였다. 본 연구에 사용된 전사체 정보는 NABIC(http:// nabic.
- Short read sequencing을 위한 정제된 mRNA 절편 화를 수행하였고, cDNA 합성을 위한 역전사 과정을 수행하였다. cDNA 절편의 양끝에 adaptor를 붙이고, PCR을 수행하였다. 약 200-400 bp 크기의 증폭 크기를 가진 DNA를 선택하고, pair-end sequencing을 통해 절편 서열을 분석하였다.
- 추출한 total RNA 시료에서 DNA를 제거하기 위해 DNase를 처리하였다. mRNA를 분리하기 위해, poly-A tail을 갖는 특성을 이용하여 poly-T magnetic bead를 사용하였다. 또한 non-coding RNA를 제거하기 위해, Ribo-Zero Plus rRNA Depletion Kit(Illumina, USA)을 사용하였다.
- 이들의 차등 발현 유전자 발현양은 대조구(25℃)에 비해 저온에서 현저히 낮았으며 고온에서는 약간 높은 것으로 나타났다(Table 1). 계통분석에서 배추좀나방의 opsine 5-HT1A 수용체와 가까운 분지를 형성하였다(Fig. 1). Opsine 나비목 곤충에서 교미 결정에 영향을 주는 것으로 알려져 있다[52].
- control을 수행하였다. 대략적인 read quality, 전체염기의 수, 절편수의 GC (%) 등을 산출하였다. Trimmomatic (Ver.
- 이들 중에서 30개의 G 단백질 연관 수용체(GPCR)를 동정하였다(Table 1). 동정된 GPCR에 대해 구조의 유사성에 따라 3개 그룹으로 분류하였다: family A(16개 수용체), family B(11개 수용체), family F(3개 수용체)(Table 1). 동정된 GPCR을 다른 곤충의 GPCR의 서열 유사성을 기준으로 정렬하였고, 유전자들 간의 계통 분석을 수행하였다(Fig.
- 동정된 GPCR에 대해 구조의 유사성에 따라 3개 그룹으로 분류하였다: family A(16개 수용체), family B(11개 수용체), family F(3개 수용체)(Table 1). 동정된 GPCR을 다른 곤충의 GPCR의 서열 유사성을 기준으로 정렬하였고, 유전자들 간의 계통 분석을 수행하였다(Fig. 1, 2, 3).
- mRNA를 분리하기 위해, poly-A tail을 갖는 특성을 이용하여 poly-T magnetic bead를 사용하였다. 또한 non-coding RNA를 제거하기 위해, Ribo-Zero Plus rRNA Depletion Kit(Illumina, USA)을 사용하였다. Short read sequencing을 위한 정제된 mRNA 절편 화를 수행하였고, cDNA 합성을 위한 역전사 과정을 수행하였다.
- 배추잎을 공급하여 사육하였다. 성충의 사육은 아크릴 사육 상에서 먹이로 10% 설탕물을 공급하였고, 산란을 위해 배추잎을 매일 공급하였다. 사육조건에서 습도는 60 ± 10%을유지하였고, 대조구는 항온 25℃, 시험구는 35℃ 항온조건과 저온(3-10℃)에서 각각 사육하였고, 광조건 16:8(L:D) h 이었다.
- cDNA 절편의 양끝에 adaptor를 붙이고, PCR을 수행하였다. 약 200-400 bp 크기의 증폭 크기를 가진 DNA를 선택하고, pair-end sequencing을 통해 절편 서열을 분석하였다.
- 저온조건(3~10℃), 고온조건(35℃)과 항온조건(25℃)에서 사육한 배추좀나방 4령 유충이 되었을 때, 해부용 가위를 이용하여 지방체를 분리하였다. 분리한 지방체로부터 total RNA를 분리하기 위해, RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen, USA)를 사용하였다.
- 대개 opsine 흡수하는 파장의 길이에 따라서 크게 2 그룹으로 분류한다: 1) 긴 파장을 흡수하는 무척추동물 시각 색소, 2) 짧은 파장을 흡수하는 무척 추동 물의 시각 색소[50, 51]. 전사체로부터 3개의 긴 파장에 반응하는 opsin contig(c54142_g2_i1, i2, i3)를 동정하였다. 이들의 차등 발현 유전자 발현양은 대조구(25℃)에 비해 저온에서 현저히 낮았으며 고온에서는 약간 높은 것으로 나타났다(Table 1).
- 모든 시료에서 교정된 read들은 전사 체를 구축하는데 사용되었으며, Trinity 프로그램을 이용하여 합쳐진 결과들을 구축하였다[18]. 전사체에 대한 de novo reconstruction을 수행하여 유전자 염기서열인 contig를 확보하였다. 확보된 유전자들에 대해 가장 긴 길이를 가지는 contig를 분석하여, 중복되지 않는 unigene을 구성하였다.
- 확보된 unigene을 통해 유전자의 annotation, 염기 및 아미노산 서열을 추정하였다. 추정된 아미노산서열을 이용하여 GPCR의 특징인 7개의 transmembrane domain 포함여부를 TMPred(https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_ form.html)를 이용하여 확인하였다. 유전자의 annotatione BlastX(http://www.
- 분리한 지방체로부터 total RNA를 분리하기 위해, RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen, USA)를 사용하였다. 추출한 total RNA 시료에서 DNA를 제거하기 위해 DNase를 처리하였다. mRNA를 분리하기 위해, poly-A tail을 갖는 특성을 이용하여 poly-T magnetic bead를 사용하였다.
- 확보된 1차 서열 분석 결과(sequenced raw data)에 대한 quality control을 수행하였다. 대략적인 read quality, 전체염기의 수, 절편수의 GC (%) 등을 산출하였다.
- 확보된 유전자들에 대해 가장 긴 길이를 가지는 contig를 분석하여, 중복되지 않는 unigene을 구성하였다. 확보된 unigene을 통해 유전자의 annotation, 염기 및 아미노산 서열을 추정하였다. 추정된 아미노산서열을 이용하여 GPCR의 특징인 7개의 transmembrane domain 포함여부를 TMPred(https://embnet.
- 전사체에 대한 de novo reconstruction을 수행하여 유전자 염기서열인 contig를 확보하였다. 확보된 유전자들에 대해 가장 긴 길이를 가지는 contig를 분석하여, 중복되지 않는 unigene을 구성하였다. 확보된 unigene을 통해 유전자의 annotation, 염기 및 아미노산 서열을 추정하였다.
대상 데이터
- Unigene 유전자의 발현빈도는 전사체 기반 차등발현 유전자 발현양(Fragments Per Kilobase of transcript per Million, FPKM)으로 분석하였고, 발현의 수준은 read count로 산출하였다. 본 연구에 사용된 전사체 정보는 NABIC(http:// nabic.rda.go.kr)에 등록하였다(NN-1865-000001, NN1863-000001, NN-1864-000001).
- html)를 이용하여 확인하였다. 유전자의 annotatione BlastX(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)를 이용하였다. Unigene 유전자의 발현빈도는 전사체 기반 차등발현 유전자 발현양(Fragments Per Kilobase of transcript per Million, FPKM)으로 분석하였고, 발현의 수준은 read count로 산출하였다.
- 154개의 contig를 만들었다. 이들 중에서 30개의 G 단백질 연관 수용체(GPCR)를 동정하였다(Table 1). 동정된 GPCR에 대해 구조의 유사성에 따라 3개 그룹으로 분류하였다: family A(16개 수용체), family B(11개 수용체), family F(3개 수용체)(Table 1).
데이터처리
- 32; [17])를 사용하여, low quality read, adaptor 서열, DNA 오염 등의 분석 결과에 영향을 미칠 수 있는 요소들을 제거하였다. 모든 시료에서 교정된 read들은 전사 체를 구축하는데 사용되었으며, Trinity 프로그램을 이용하여 합쳐진 결과들을 구축하였다[18]. 전사체에 대한 de novo reconstruction을 수행하여 유전자 염기서열인 contig를 확보하였다.
- 배추좀나방 지방체 전사로부터 얻은 아미노산 서열을 ClustalW (MegAlign ver. 7.1.0.)로 정렬하였다, 정렬된 아미노산 서열에 대한 계통분류는 neighbor-joining 방법을 통해 분석되었고, Molecular Evolutionary Genetic Analysis (Ver. 7.0) 프로그램으로 작성되었다.
성능/효과
- Chemokines 은 염증반응에 중요한 분자로 면역반응조절자로 역할하며, 림프구 형성에도 중요하며[29], CCR7 과 ligands는 면역 관련 류머티즘 관절염의 자가면역 모델의 필수적이 구성요소로 알려져 있다[30]. CCR 유전자는 1개의 contig(c48220g1_i1) 가 확인되었으며, 유전자의 발현양은 대조구에 비해서 저온과 고온에서 모두 발현양이 높았다. 특히 고온에서 발현양의 차이는 10배에 가까웠다(Table 1).
- 배추좀나방 지방체 전사체에서 Frizzed 관련 유전자는 2개 contig(c38254 g1_i1과 35480 g1_i1)가 확인되었다. Frizzled 관련 유전자들의 발현양은 대조 구(25℃)에 비해 저온과 고온에서 높게 나타났으며, 특히 고온에서 발현양은 현저히 증가하였다(Table 1). 계통분석에서 Frizzled 관련 유전자들은 독립적인 분지를 형성하였다(Fig.
- GPCR moody는 Gαi, Gαo, Gβ13f, Gγ1을 순차적으로활성화시켜 glia 표면에서 actin 축적을 변화시켜, septate junction 단백질을 조직화하는데 영향을 준다[7]. GPCR moody 는 2개의 contig(c52289_g1_i1, c52289_g1_i4) 확인되었으며, 유전자의 발현양은 대조구에 비해 저온에서 약간 높았으나, 고온에서는 발현양이 현저히 낮았다(Table 1). 계통분류에서 GPCR moody는 독립적인 분지를 형성하였다(Fig.
- aegypti AKH 수용체와 CRZ 수용체는 척추동물의 GnRH에 상응하며, 모기에서 생식에 관여하며[34], 다른 곤충의 AKRH와 ligand 특이 성에서 차이를 보인다[35]. GnRH 수용체는 1개의 contig(c43218 g1_i1)가 확인되었으며, 유전자의 발현양은 대조구에 비해서 저온에서 약간 많았으나, 고온에서는 발현양이 현저히 낮았다 (Table 1). 계통분류에서 GnRH 수용체는 rhodopsin과 같은 분지를 형성하였다(Fig.
- Stan 유전자 발현양은 대조구(25℃)에 비해 저온과 고온에서 현저히 높게 나타났으며, 특히 고온에서 발현양은 30배 이상으로 증가하였다(Table 1). Stane frizzled 3와 같은 분지를 형성하였다(Fig.
- c36149_g1_i1은 대조구에 비해서 저온과 고온 모두 발현양이 낮았다. c28836 g1_i1은 5-HT1A에 속하는 수용체로 분류되었고, 전사체 기반 차등발현 유전자 발현양은 저온 온도에서는 대조구와 발현양의 차이가 나타나지 않았으나, 고온에서 발현양은 감소되었다(Table 1). 계통분류에서 2개 contig 들은 서로 다른 분지도를 형성하였고, 각각 rhodopsin과 opsin 수용체와 같은 분지를 형성하였다(Fig.
- Rhodopsin-like 수용체는 발달, 생식, 행동, 섭식 등의 다양한 생리적 활동을 조절하며, 여러 곤충에서도 보고가 되어 있다[10, 49, 57]. 배추좀나방 지방체 전사 체에서 Rhodopsin-like 수용체는 1개 contig(c49354 g1_i1) 가동정되었고, 유전자 발현양은 대조구(25℃)에 비해 저온에서 절반 수준으로 낮았으며, 고온에서는 발현양이 현저히 감소하였다(Table 1). 계통분석에서 배추좀나방의 Rhodopsin-like 수용체는 GnRH 수용체와 NPF와 가까운 분지를 형성하였다 (Fig.
- 이를 통해, Frizzled는 초파리에서 세포 안의 Ca 이동 뿐만 아니라 발달을 조절한다[82, 83]. 배추좀나방 지방체 전사체에서 Frizzed 관련 유전자는 2개 contig(c38254 g1_i1과 35480 g1_i1)가 확인되었다. Frizzled 관련 유전자들의 발현양은 대조 구(25℃)에 비해 저온과 고온에서 높게 나타났으며, 특히 고온에서 발현양은 현저히 증가하였다(Table 1).
- 일부 나비목 곤충에서 Mth 유전자가 밝혀졌으나, 초파리의 경우와 달리 Mth 유전자의 생물학적 기능은 연구가 필요하다[49, 57, 71], 각 Mth 유전자는 종류에 따라 발육단계에서 발현의 차이가 있는 것으로 보고되었다[72, 73]. 배추좀나방 지방체 전사체에서 Mth 수용체는 9개 contig(c97944 g1_i1, c47085 g1_i1, c47085 g1_i2, c47085 g1_i3, c47085 g1_i4, c47085 g1_i5, c47085 g1_i6, c47085 g1_i7, c49241 g1_i1)가 동정되었고, 유전자 발현양은 대체로 대조구(25℃)에 비해 저온에서는 비슷하거나 낮았으나, 고온에서는 현저히 높은 발현양을 나타냈다(Table 1). 예외적으로 Mth-like 3 수용체는 저온과 고온 모두에서 발현양이 낮게 나타났다(Table 1).
- 신호전달경로는 Gi와 adenylate cyclase를 통해 forskolin이 자극하는 cAMP 생산을 저해한다. 배추좀나방 지방체 전사체에서 NPF 수용체는 1개 contig(c42962 g1_i1)가 동정되었고, 대조 구에 비해 저온에서 발현양이 현저히 높았으나 고온에서는발현양의 차이를 보이지 않았다(Table 1). 계통분류에서 NPF 수용체는 prolactin 분비 펩타이드 수용체와 가까운 분지를 형성하였다(Fig.
- 대부분 곤충에서 sNPF 유전자는 다수의 sNPF isoforms을 가진다[56]. 배추좀나방 지방체 전사체에서 Prp 수용체는 2개 contig (c45810 g1_i1, c45810 g1_i2)가 동정되었고, 전사체 기반 차등 발현 유전자 발현양은 대조구(25℃)에 비해 저온에서 현저히 낮았으며, 고온에서는 약간 높은 것으로 나타났다(Table 1). 계통분석에서 배추좀나방의 Prp 수용체는 독립된 분지를 형성하며, NPF와 가까운 분지를 형성하였다(Fig.
- 이들 수용체는 세포 내부의 칼슘의 농도를 증가시켜 신호전달 경로를 유기한다[65, 66]. 배추좀나방 지방체 전사체에서 Substance K 수용체는 1개 contig(c50243 g1_i1)가 동정되었고, 유전자발현양은 대조구(25℃)에 비해 저온에서 대조구에 비해 현저히 낮았으나 고온에서는 발현양이 2.5배정도로 증가하였다 (Table 1). 계통분석에서 배추좀나방의 Substance K 수용체는 독립된 분지를 형성하였다(Fig.
- 대벌레의 일종인 Carausius morosus에서 adhesion GPCR G2는 소화기관과 신경절에서 발현되었으나[75], 생물학적 기능에 대해서는 아직 연구보고가 없다. 배추좀나방 지방체 전사체에서 adhesion GPCR G2는 1개 contig(c55174 g1_i1)가 동정되었고, 유전자 발현양은 대조구(25℃)에 비해 저온에서는 비슷하거나 낮았으나, 고온에서는 현저히 높은 발현양을 나타냈다(Table 1). 계통분석에서 배추좀나방의 adhesion GPCR G2는 독립된 분지를 형성하였다(Fig.
- 전달된 Sex peptide는 암컷의 페로몬 샘과 뇌에 있는 수용체에 결합하여, 산란과 교미억제를 유도하고[59], 암컷의 수면패턴을 변화시키고[60], 항균 펩타이드(anti-microbial peptide) 발현을 증가시킨다[61]. 배추좀나방 지방체 전사체에서 sex peptide 수용체는 1개 contig(c47082 g1_i1)가 동정되었고, 유전자 발현양은 대조구(25℃)에 비해 저온과 고온에서 모두 낮게 나타났다(Table 1). 계통분석에서 배추좀나방의 sex peptide 수용체는 독립된 분지를 형성하였다(Fig.
- 곤충의 biogenic amine 수용체는 dopamine, serotonin(5-hydroxytryptamine, 5-HT), octopamine/tyramine, muscarinic acetylcholine 수용체 등이 있다. 배추좀나방의 지방체 전사체에서는 2개의 5-HT 수용체 contig (c36149_g1_i1와 c28836 g1_i1)가 확인되었다. c36149_g1_i1은 대조구에 비해서 저온과 고온 모두 발현양이 낮았다.
- 이뇨호르몬 수용체 유전자 발현양은 대조구(25℃)에 비해 저온에서는 현저히 낮았으나, 고온에서는 발현양이 약간 높았다(Table 1). 신경펩타이드 B1 수용체의 유전자 발현양은 대조구(25℃)에 비해 저온에서는 현저히 높게 나타났으나, 고온에서는 오히려 낮게 나타났다(Table 1). 계통분석에서 배추좀나방의 이뇨 호르몬 수용체와 신경펩타이드 B1 수용체는 서로 같은 분지를 형성하였다(Fig.
- 배추좀나방 지방체 전사체에서 이뇨 호르몬 수용체와 신경펩타이드 수용체 B1는 각각 c49260 g1_i1과 c29403 g1_i1이 동정되었다. 이뇨호르몬 수용체 유전자 발현양은 대조구(25℃)에 비해 저온에서는 현저히 낮았으나, 고온에서는 발현양이 약간 높았다(Table 1). 신경펩타이드 B1 수용체의 유전자 발현양은 대조구(25℃)에 비해 저온에서는 현저히 높게 나타났으나, 고온에서는 오히려 낮게 나타났다(Table 1).
- 전사체로부터 3개의 긴 파장에 반응하는 opsin contig(c54142_g2_i1, i2, i3)를 동정하였다. 이들의 차등 발현 유전자 발현양은 대조구(25℃)에 비해 저온에서 현저히 낮았으며 고온에서는 약간 높은 것으로 나타났다(Table 1). 계통분석에서 배추좀나방의 opsine 5-HT1A 수용체와 가까운 분지를 형성하였다(Fig.
- 이상의 결과는 온도에 따른 GPCR의 발현 패턴도 종류에 따라 차이가 있음을 보여주었다. 저온에서 발현이 높은 GPCR 은 CCR, opsin, Prp 수용체, substance K 수용체, Mth-like 수용체, 이뇨호르몬 수용체, frizzled, stan으로 이들의 기능은 면역반응, 섭식 및 이동, 냄새감각 및 대사, 이뇨, 발달 등에 관여하는 것으로 알려져 있다.
후속연구
- 고온에 노출되면 면역활동이 활발하며, 대사관련 효소 활성이 증가하여, 병원체에 대한 저항성 또한 높아지는 것으로 알려져 있다. 따라서 지방체에서 다양한 GPCR 발현은 지방체의 생리적기능이 대사과정에만 국한되지 않을 수 있음을 보여주며, 대사활동의 중심인 지방체에서 GPCR의 동정은 새로운 해충 방제의 표적으로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
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