[논문]차세대 염기서열 분석법을 이용한 전통 된장과 청국장의 미생물 분포 분석

하광수; 김진원; 신수진; 정수지; 양희종; 정도연

doi:10.5352/jls.2021.31.10.922

차세대 염기서열 분석법을 이용한 전통 된장과 청국장의 미생물 분포 분석
Comparison of Microbial Community Compositions between Doenjang and Cheonggukjang Using Next Generation Sequencing 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.31 no.10, 2021년, pp.922 - 928

하광수 ((재)발효미생물산업진흥원) , 김진원 ((재)발효미생물산업진흥원) , 신수진 ((재)발효미생물산업진흥원) , 정수지 ((재)발효미생물산업진흥원) , 양희종 ((재)발효미생물산업진흥원) , 정도연 ((재)발효미생물산업진흥원)

초록
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본 연구는 우리나라 전통 장류인 된장과 청국장의 미생물 분포와 시료간의 미생물학적 차이에 대해 차세대 염기서열 분석법(NGS)을 이용하여 분석하였다. α-diversity 분석 결과 된장에서 종 추정치와 풍부도가 통계학적으로 유의한 수준으로 높은 것으로 나타났다. 세균 분포를 분석한 결과 문 수준에서 Firmicutes가 된장에서 97.02%, 청국장에서 99.67%를 차지하여 공통적으로 가장 우점하는 것으로 나타났으며, 속 수준에서는 된장과 청국장에서 Bacillus가 각각 71.70%, 59.87%를 차지하여 가장 우점하는 것으로 확인되었다. 된장과 청국장의 미생물 분포에 차이가 있는지 분석하기 위해 PERMANOVA 분석을 수행한 결과 된장과 청국장의 미생물 분포에 통계학적으로 유의한 수준으로 차이가 나는 것으로 나타났다. 각 된장과 청국장 미생물 군집을 대표하는 biomarker를 분석하기 위해 LEfSe분석을 수행한 결과 된장에서 Bacillus subtilis, Tetragenococcus halophilus, Clostridium arbusti가 상대적으로 많이 분포하였으며, 청국장에서는 Bacillus thermoamylovorans, Enterococcus faecium, Lactobacillus sakei가 상대적으로 많이 분포하는 것으로 나타났다. 본 연구를 통해 콩을 주원료로 하는 우리나라 대표 전통장류인 된장과 청국장의 시료별 유사성과 차이점에 대한 미생물 분포를 정의하고 전통장류의 생화학적, 생리학적 특성과 미생물 분포의 상관관계를 규명하기 위한 기초 연구자료로 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

Abstract ▼ AI-Helper

To profile the microbial compositions of Korean traditional fermented paste made from whole soybeans, Doenjang and Cheonggukjang, and compare their taxonomic differences, we analyzed the V3-V4 region of 16S rRNA of naturally fermented foods by using next generation sequencing. α-Diversity results showed that values indicating bacterial community abundances (OTUs) and richness (ACE, Chao1) were statistically significant (p=0.0001) in Doenjang and Cheonggukjang. Firmicutes was the most common phylum in both groups, representing 97.02% and 99.67% in the Doenjang and Cheonggukjang groups, respectively. Bacillus was the most dominant genus, accounting for 71.70% and 59.87% in both groups. Linear discriminant (LDA) effect size (LEfSe) analysis was performed to reveal the significant ranking of abundant taxa in different fermented foods. A size-effect threshold of 2.0 on the logarithmic LDA score was used for discriminative functional biomarkers. On the species level, Bacillus subtilis, Tetragenococcus halophilus, and Clostridium arbusti were significantly more abundant in Doenjang than in Cheonggukjang, whereas Bacillus thermoamylovorans, Enterococcus faecium, and Lactobacillus sakei were significantly more abundant in Cheonggukjang than in Doenjang. Permutational multivariate analysis of variance (PERMANOVA) showed that the statistical difference in microbial clusters between the two groups was significant at the confidence level of p=0.001. This research could be used as basic research to identify the correlation between the biochemical characteristics of Korean fermented foods and the distribution of microbial communities.

주제어

표/그림 (7)

표 Table 1. Information on samples collected in respective province area
표 Table 2. Sequence summary and α-diversity indices
그림 Fig. 1. Microbial composition and relative abundance in Doenjang (DO) and Cheonggukjang (CH) based on taxonomic levels of classification at phylum (A), class (B), order (C), family (D), genus (E), species (F).
표 Table 3. Taxonomic classification at the phylum (A), genus (B) and species (C) levels showing microbial communities of each Doenjang and Cheonggukjang
그림 Fig. 2. Principal coordinate analysis and UPGMA clustering result based on Bray-Curtis dissmimilarity metric of bacterial communities on genus (A) and species (B) level (red circle & bar : Doenjang, green circle & bar : Cheonggukjang).
표 Table 4. Permutational multivariate analysis of variance table for bacterial communities from Doenjang and Cheonggukjang
표 Table 5. Biomarker analysis between Doenjang and Cheonggukjang using LEfSe analysis

AI 본문요약
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문제 정의

따라서, 본 연구에서는 콩을 주원료로 Bacillus 균에 의해 발효되는 공통점을 가진 우리나라 전통 발효식품인 된장과 청국장의 미생물 군집구조를 차세대염기서열분석기술(Next generation sequencing)을 활용하여 비교분석하고, 된장과 청국장을 미생물학적으로 구분하기 위한 biomarker를 탐색하여 전통식품의 미생물 군집구조와 생리활성간의 상관관계를 규명하기 위한 기초자료를 제공하고자 한다.

제안 방법

된장과 청국장의 세균 분포를 분석하기 위해 된장 30종, 청국장 30종의 그룹별 분류 후 평균값을 산출하여 그룹간 비교를 하였으며, 된장과 청국장의 세균 분포도를 미생물학적 분류단계 수준별로 차지하는 미생물의 비율을 Fig. 1에 나타냈다.
미생물 군집구조를 분석하기 위한 된장과 청국장 시료는 제품의 원료 및 제조지역, 발효 또는 숙성 기간 등의 특정 항목에 대한 편견(bias)을 제거하기 위해 전국에서 종균을 사용하지 않고 자연발효를 통해 생산되는 제품을 무작위로 수집하였다. 된장은 경기도 3종, 강원도 3종, 충청도 3종, 전라도 15종, 경상도 4종, 제주도 2종 총 30종을 수집하였으며, 청국장은 경기도 4종, 강원도 3종, 충청도 3종, 전라도 13종, 경상도 4종, 제주도 3종 총 30종을 수집하였다(Table 1).

대상 데이터

미생물 군집구조를 분석하기 위한 된장과 청국장 시료는 제품의 원료 및 제조지역, 발효 또는 숙성 기간 등의 특정 항목에 대한 편견(bias)을 제거하기 위해 전국에서 종균을 사용하지 않고 자연발효를 통해 생산되는 제품을 무작위로 수집하였다. 된장은 경기도 3종, 강원도 3종, 충청도 3종, 전라도 15종, 경상도 4종, 제주도 2종 총 30종을 수집하였으며, 청국장은 경기도 4종, 강원도 3종, 충청도 3종, 전라도 13종, 경상도 4종, 제주도 3종 총 30종을 수집하였다(Table 1).

이론/모형

수집한 된장과 청국장으로부터 total DNA를 추출하기 위해 PowerFood Microbial Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)를 사용하였으며, 제조사의 추출 방법에 따라 DNA를 추출하였다. 각 시료로부터 추출된 dsDNA의 농도를 정밀하게 측정하기 위해 Qubit 4 (Invitrogen, Waltham, Massachusetts, USA) 장비를 이용하였으며, Nanodrop One 분광광도계(Thermo- fisher scientific, waltham, Massachusetts, USA) 장비를 이용하여 흡광도를 측정(Abs260nm/Abs280nm ratio)한 후 1.

성능/효과

87%로 가장 우점하는 것으로 나타났다. 된장과 청국장 시료에 분포하는 유산균을 속 수준에서 분석한 결과 된장 시료에서는 유산균 계열의 미생물 중 Lactobacillus와 Leuconostoc 속은 나타나지 않았으나, 청국장 시료에서는 Lactobacillus와 Leuconostoc 속미생물의 분포가 각각 10.56%, 4.53%로 청국장 시료 내에서 각각 3번째, 7번째로 우점하는 속으로 나타났다. 또한, Enterococcus 속 미생물의 경우 된장에서는 1.
된장과 청국장의 미생물 분포에 통계학적으로 차이가 있는지 분석하기 위해 Jensen-Shannon, Bray-Curtis 두 가지 distance metric 기반의 PERMANOVA 분석을 수행한 결과 p-value가 0.001로 나타나 '된장과 청국장 미생물 군집의 중심과 산포가 동일하다'는 귀무가설이 기각되어 된장과 청국장 미생물 군집 분포의 중심 또는 확산이 서로간에 다르다는 것을 확인함으로써 된장과 청국장의 미생물 분포가 다르다는 것을 통계학적으로 검증하였다(Table 4).
53%로 청국장 시료 내에서 각각 3번째, 7번째로 우점하는 속으로 나타났다. 또한, Enterococcus 속 미생물의 경우 된장에서는 1.60%를 차지하였으나 청국장에서는 12.4%를 차지하는 미생물로 나타나 청국장의 Enterococcus 속 미생물이 약 7.8배의 높은 비율을 차지하는 것으로 나타났다. 종(species) 수준에서 된장에 가장 우점하는 미생물은 Bacillus subtilis (50.
1에 나타냈다. 문(phylum) 수준에서 된장과 청국장에서 공통적으로 Fir- micutes가 된장과 청국장에서 각각 97.02%, 99.67%를 차지하여 가장 우점하였으며, 속(genus) 수준에서는 된장과 청국장에서 Bacillus속이 된장과 청국장에서 각각 71.70%, 59.87%로 가장 우점하는 것으로 나타났다. 된장과 청국장 시료에 분포하는 유산균을 속 수준에서 분석한 결과 된장 시료에서는 유산균 계열의 미생물 중 Lactobacillus와 Leuconostoc 속은 나타나지 않았으나, 청국장 시료에서는 Lactobacillus와 Leuconostoc 속미생물의 분포가 각각 10.
8배의 높은 비율을 차지하는 것으로 나타났다. 종(species) 수준에서 된장에 가장 우점하는 미생물은 Bacillus subtilis (50.83%), Bacillus licheniformis (18.58%), Tetragenococcus halophilus (5.04%), Clostridium arbusti (3.95%), Kroppenstedtia sanguinis (3.00%) 순으로 나타났으며, 청국장에서는 Bacillus thermoamylovorans (24.73%), Bacillus licheniformis (18.65%), Enterococcus faecium (12.38%), Bacillus subtilis (10.29%), Lactobacillus sakei (9.24%) 순으로 나타나(Table 3) 생물학적 분류수준이 문(phylim)에서 종(species) 수준으로 낮아질수록 미생물 분포의 차이가 크게 나타나는 것으로 확인되었다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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