[논문]차세대 염기서열 분석법을 이용한 된장과 간장의 미생물 분포 및 바이오마커 분석

하광수; 정호진; 노윤정; 김진원; 정수지; 정도연; 양희종

doi:10.5352/jls.2022.32.10.803

차세대 염기서열 분석법을 이용한 된장과 간장의 미생물 분포 및 바이오마커 분석
Comparative Microbiome Analysis of and Microbial Biomarker Discovery in Two Different Fermented Soy Products, Doenjang and Ganjang, Using Next-generation Sequencing 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.32 no.10, 2022년, pp.803 - 811

하광수 ((재)발효미생물산업진흥원) , 정호진 ((재)발효미생물산업진흥원) , 노윤정 ((재)발효미생물산업진흥원) , 김진원 ((재)발효미생물산업진흥원) , 정수지 ((재)발효미생물산업진흥원) , 정도연 ((재)발효미생물산업진흥원) , 양희종 ((재)발효미생물산업진흥원)

초록
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우리나라 전통 콩 발효식품은 탄수화물을 주식으로 하는 한국인의 식생활에 중요한 단백질 급원임에도 불구하고 콩 발효식품의 미생물 다양성과 군집 구조에 대해서는 거의 알려진 바가 없다. 본 연구는 16S rDNA 유전자 서열 분석 기반의 차세대 염기서열 분석법을 이용하여 한국 전통 발효식품인 된장과 간장의 미생물 군집 구조를 밝히고자 하였다. Alpha-diversity 분석 결과 미생물 다양성 지표인 Shannon과 Simpson에서 된장과 간장의 미생물 다양성에 통계학적인 차이가 있는 것으로 나타났으나, 종 풍부도 지표인 ACE, CHAO, Jackknife에서는 차이가 없는 것으로 나타났다. 된장과 간장의 미생물 분포 분석 결과 된장과 간장의 공통적인 우점균은 Firmicutes로 나타났으나, 속 수준에서의 미생물 분포를 분석한 결과 된장에서 Bacillus, Kroppenstedtia, Clostridium, Pseudomonas가 간장보다 높은 비율을 차지하고 있는 것으로 나타났으며, 간장에서는 Tetragenococcus, Chromhalobacter, Lentibacillus, Psychrobacter와 같은 호염성 또는 내염성 세균이 된장보다 높은 비율을 차지하는 것으로 나타났다. 된장과 간장의 미생물 군집구조에 통계학적인 차이가 있는지 확인하기 위해 paired-PERMANOVA 분석을 수행하였으며, 그 결과 통계학적으로 매우 유의한 수준의 차이가 있는 것으로 나타났다. 된장과 간장의 미생물 군집구조 차이에 큰 영향을 미치는 biomarker를 분석하기 위해 LEfSe 분석을 수행하였으며, 그 결과 Bacillus와 Tetragenococcus가 된장과 간장의 미생물 군집 구조에 차이를 나타내는 biomarker로 분석되었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Despite the importance of traditional Korean fermented foods, little is known about the microbial communities and diversity of fermented soy products. To gain insight into the unexplored microbial communities of both Doenjang (DJ) and Ganjang (GJ) that may contribute to the fermentation in Korean traditional foods, we carried out next-generation sequencing (NGS) based on the V3-V4 region of 16S rDNA gene analysis. The alpha diversity analysis results revealed that both the Shannon and Simpson diversity indices were significantly different between the two groups, whereas the richness indices, including ACE, CHAO, and Jackknife, were not significant. Firmicutes were the most dominant phylum in both groups, but several taxa were found to be more abundant in DJ than in GJ. The proportions of Bacillus, Kroppenstedtia, Clostridium, and Pseudomonas and most halophiles and halotolerant bacteria, such as Tetragenococcus, Chromohalobacter, Lentibacillus, and Psychrobacter, were lower in DJ than in GJ. Linear discriminant effect size (LEfSe) analysis was carried out to discover discriminative functional biomarkers. Biomarker discovery results showed that Bacillus and Tetragenococcus were identified as the most important features for the classification of subjects to DJ and GJ. Paired-permutational multivariate analysis of variance (PERMANOVA) further revealed that the bacterial community structure between the two groups was statistically different (p=0.001).

주제어

표/그림 (9)

표 Table 1. Collected Doenjang and Ganjang from respective province area
그림 Fig. 1. Variations in alpha-diversity indices between Doenjang and Ganjang. Statistical tests showed no difference for ACE and CHAO reflecting species richness, while Shannon and Simpson diversity indices were statistically significant.
표 Table 2. Summary of reads remained after trimmed with MTP
그림 Fig. 2. Mean relative abundances of bacterial proportion by type of fermented foods at phylum (A), class (B), order (C), family (D), genus (E) and species (F) levels.
표 Table 3. Comparison of the dominant bacterial taxa at respective biological classification levels
표 Table 4. Pair-wise comparison between Doenjang and Ganjang by Permutational multivariate analysis of variance with p-values obtained using 999 permutations
그림 Fig. 3. Principal coordinate analysis and UPGMA tree of Jensen-Shannon distances of bacterial community on genus (A) and species (B) levels.
그림 Fig. 4. Metagenomic biomarker discovery by LEfSe analysis between Doenjang and Ganjang on genus (A) and species (B) levels.
표 Table 5. Biomarker analysis between Doenjang and Ganjang using LEfSe analysis

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 차세대염기서열분석법을 활용하여 우리 전통발효식품의 주원료로 사용되는 메주로부터 제조되는 대표적인 콩 발효식품인 된장과 간장의 미생물 다양성과 미생물 군집구조를 비교분석하여 된장과 간장의 미생물학적 기초자료를 제공하고자 한다.

제안 방법

각 library에 index를 붙이기 위한 PCR 반응조건으로 95℃에서 3분 동안 pre-denaturation을 수행한 후, 95℃에서 30초 동안 denaturation, 55℃에서 30초 동안 annealing, 72℃에서 30초 동안 extension 반응을 8회 반복한 후, 최종 72℃에서 5분간 extension 반응을 수행하였으며, AMpure XP (BECKMAN COULTER, Brea, California, USA) bead를 사용하여 library를 제외한 불순물을 모두 제거하였다. 최종적으로 Qubit 4 장비를 이용하여 double strand library의 농도를 측정하고, Naondrop One 분광광도계를 이용하여 순도를 분석하였으며, 1.5% agarose gel 전기영동을 수행하여 각 library의 크기(base pair)를 분석하여 품질검사를 수행하였다. 각 library의 농도를 모두 4 nM로 동일하게 희석하였으며, 모든 library를 pooling한 후 MiSeq Reagent Kit v3 (Illumina) cartridge에 주입하여 Miseq platform (Illumina)을 이용하여 paired-end 2x301회의 sequencing cycle을 수행하였다.

대상 데이터

전통 된장과 간장의 미생물 다양성 및 군집구조를 분석하기 위한 시료로 된장 40종, 간장 40종, 총 80종의 시료를 수집하였다. 발효식품의 유형에 따른 미생물 군집 구조를 일반화하기 위해 원재료, 제조지역 및 제조공정과 무관하게 종균을 사용하지 않고 재래식 방법으로 제조된 시료를 수집하였으며, 된장은 경기도 9종, 강원도 5종, 충청도 8종, 전라도 11종, 경상도 5종, 제주도 2종을 수집하였으며, 간장은 경기도 8종, 강원도 3종, 충청도 6종, 전라도 12종, 경상도 7종, 제주도 4종을 수집하였다(Table 1).
전통 된장과 간장의 미생물 다양성 및 군집구조를 분석하기 위한 시료로 된장 40종, 간장 40종, 총 80종의 시료를 수집하였다. 발효식품의 유형에 따른 미생물 군집 구조를 일반화하기 위해 원재료, 제조지역 및 제조공정과 무관하게 종균을 사용하지 않고 재래식 방법으로 제조된 시료를 수집하였으며, 된장은 경기도 9종, 강원도 5종, 충청도 8종, 전라도 11종, 경상도 5종, 제주도 2종을 수집하였으며, 간장은 경기도 8종, 강원도 3종, 충청도 6종, 전라도 12종, 경상도 7종, 제주도 4종을 수집하였다(Table 1).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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