[논문]도토리 화분 추출물의 폴리페놀 고함유 분획물의 항산화 및 항혈전 활성

이윤진; 강덕경; 표수진; 손호용

doi:10.5352/jls.2022.32.7.501

도토리 화분 추출물의 폴리페놀 고함유 분획물의 항산화 및 항혈전 활성
Anti-oxidation and Anti-thrombosis Activities of Polyphenol-enriched Fraction of Acorn Pollen Extract 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.32 no.7, 2022년, pp.501 - 509

이윤진 (안동대학교 식품영양학과) , 강덕경 (안동대학교 식품영양학과) , 표수진 (리즈바이오텍) , 손호용 (안동대학교 식품영양학과)

초록
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도토리 화분은 국내에서 가장 많이 생산되는 단일 화분으로, 민간에서는 지혈, 빈혈방지, 전립선염 치료 등에 이용되어 왔다. 본 연구에서는 식물 화분을 이용한 기능성 식의약품 소재 개발 가능성을 검토하고자, 도토리 화분의 에탄올 추출물의 극성별 유기용매 분획물을 제조하고 이의 성분 분석, 항산화, 항응고, 혈소판 응집 저해활성 및 활성 분획물의 적혈구 용혈 활성을 평가하였다. 총 폴리페놀 함량은 도토리 화분 에탄올 추출물 중 에틸아세테이트 분획물에서 가장 높은 225.0 mg/g을 나타내었다. 상기 에틸아세테이트 분획은 DPPH, ABTS 및 nitrite에 대한 RC₅₀값이 각각 72.2, 27.7 및 62.6 ㎍/ml를 나타내어 강력한 항산화 활성을 보였다. 한편 도토리 화분의 항혈전 활성 평가를 위해 혈액응고저해 활성 평가 결과, 모든 분획물에서 5 mg/ml 농도까지 특이한 항응고 활성은 나타나지 않았다. 반면 혈소판 응집저해활성 평가 결과, 도토리 화분 추출물의 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 잔류물에서 우수한 응집저해가 나타났으나, 헥산 분획물에서는 오히려 응집촉진 효과를 나타내었다. 항산화 활성 및 혈소판 응집 저해활성이 우수한 도토리 화분 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 1 mg/ml 농도까지 인간 적혈구 용혈활성이 없었으며, UPLC/MS/MS 분석결과 rutin, isoquercitrin 및 astragalin이 주요 활성물질임을 확인하였다. 본 연구는 도토리 화분 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 이용한 새로운 항산화 및 항혈전제로 개발이 가능함을 제시하고 있다.

Abstract ▼ AI-Helper

Pollen corrected from Quercus species is abundant in Korea and has been used to treat anemia and inflammation of the prostate gland. It is also used for hemostasis in oriental medicine. In this study, the ethanol extract of the acorn pollen and its subsequent organic solvent fractions using hexane, ethylacetate, butanol, and water residue were prepared, and their antioxidant, anti-thrombosis, and hemolysis activities were evaluated. The ethylacetate fraction of acorn pollen (EF-AP) showed the highest polyphenol content (225.0 mg/g) and strong antioxidant activity among the solvent fractions. The RC50 of EF-AP against DPPH, ABTS, and nitrite radicals was 72.2, 27.7, and 62.6 ㎍/ml, respectively. The blood coagulation activities of the all-solvent fractions determined by thrombin time, prothrombin time, and activated partial thromboplastin time were negligible up to 5 mg/ml. Platelet aggregation inhibitory activities were observed in the EF-AP, butanol fraction, and water residue, whereas hexane fraction induced strong platelet aggregation. The EF-AP has no hemolysis activity against human RBC up to 1 mg/ml. UPLC/MS/MS analysis of the EF-AP revealed that rutin, isoquercitrin, and astragalin are major compounds for antioxidant and anti-thrombosis activities. Our results suggest that EF-AP could be developed as a noble antioxidant and anti-thrombosis agent.

주제어

표/그림 (10)

그림 Fig. 1. The representative photographies of (A) acorn pollen, (B) grinded acorn pollen, (C) water-treated acorn (x800) and (D) ethanol treated acorn pollen (x800) used in this study
표 Table 1. Conditions of UPLC/MS/MS analysis for acorn pollen extract
$Table 2. Contents of total polyphenol, total flavonoid and total sugar of the ethanol extract of acorn pollen and subsequent organic solvent fractions$ 표 Table 2. Contents of total polyphenol, total flavonoid and total sugar of the ethanol extract of acorn pollen and subsequent organic solvent fractions
$Table 3. Anti-oxidation activities of the ethanol extract of acorn pollen and its subsequent organic solvent fractions$ 표 Table 3. Anti-oxidation activities of the ethanol extract of acorn pollen and its subsequent organic solvent fractions
$Table 4. Calculated RC<sub>50</sub> of the ethanol extract of acorn pollen and its subsequent organic solvent fractions$ 표 Table 4. Calculated RC₅₀ of the ethanol extract of acorn pollen and its subsequent organic solvent fractions
$Table 5. In-vitro anticoagulation activity of the ethanol extract of acorn pollen and its subsequent organic solvent fractions$ 표 Table 5. In-vitro anticoagulation activity of the ethanol extract of acorn pollen and its subsequent organic solvent fractions
그림 Fig. 2. Diagram of impedance changes during platelet aggregation after addition of aspirin and samples of acorn pollen in whole blood aggregometer. Symbols: (A) DMSO, (B) aspirin (0.25 mg/ml), (C) aspirin (0.125 mg/ml), (D) ethanol extract, (E) HF-AP, (F) EF-AP, (G) BF-AP and (H) water residue. The sample concentrations used were 0.25 mg/ml. Platelet aggregation was induced by addition of 2.5 μl of collagen (1 mg/ml) into cuvette containing 50 μl of washed PRP and measured the impedance change for 12 min.
$Table 6. Platelet aggregation activities of the ethanol extract of acorn pollen and its subsequent organic solvent fractions$ 표 Table 6. Platelet aggregation activities of the ethanol extract of acorn pollen and its subsequent organic solvent fractions
$Table 7. Hemolytic activities of the ethanol extract of acorn pollen and its subsequent organic solvent fractions against human red blood cells$ 표 Table 7. Hemolytic activities of the ethanol extract of acorn pollen and its subsequent organic solvent fractions against human red blood cells
$Table 8. Flavonoids and phenolic acids identified in the ethylacetate fraction of arcorn pollen$ 표 Table 8. Flavonoids and phenolic acids identified in the ethylacetate fraction of arcorn pollen

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 국내 다양한 식물 화분의 생리활성 평가 연구의 일환으로, 도토리 화분의 항산화 및 항혈전 소재로 개발 가능성을 검토하고자 도토리화분 에탄올 추출물과 이의 극성별 용매분획물을 제조하고 이의 항산화, 항응고, 혈소판 응집저해 활성 및 활성분획물의 적혈구 용혈 활성을 평가하였다. 그 결과 도토리 화분 추출물의 폴리페놀 고함유 에틸아세테이트 분획물이 우수한 항산화 및 항혈전 활성을 나타내어 항산화 및 항혈전제로서의 기능성 식의약품 소재로 개발 가능하며, 상기 에틸아세테이트 분획물의 다양한 페놀산 및 플라보노이드 물질을 분석하여 활성물질을 확인하였기에 이에 보고하는 바이다.
또한 도토리 화분을 포함한 식물의 화분 표면은 sporopollenin이라 불리는 단단한 껍질로 덮여 있어 화분의 가열 및 추출 등의 별도의 전처리 없이 섭취시에는 소화흡수율이 낮아 생체 이용률이 매우 낮다는 문제점도 알려져 있다[6, 7]. 본 연구에서는 국내 다양한 식물 화분의 생리활성 평가 연구의 일환으로, 도토리 화분의 항산화 및 항혈전 소재로 개발 가능성을 검토하고자 도토리화분 에탄올 추출물과 이의 극성별 용매분획물을 제조하고 이의 항산화, 항응고, 혈소판 응집저해 활성 및 활성분획물의 적혈구 용혈 활성을 평가하였다. 그 결과 도토리 화분 추출물의 폴리페놀 고함유 에틸아세테이트 분획물이 우수한 항산화 및 항혈전 활성을 나타내어 항산화 및 항혈전제로서의 기능성 식의약품 소재로 개발 가능하며, 상기 에틸아세테이트 분획물의 다양한 페놀산 및 플라보노이드 물질을 분석하여 활성물질을 확인하였기에 이에 보고하는 바이다.

제안 방법

, Tokyo, Japan)하여 분말로 조제하였으며, 이후 추출물을 물에 현탁한 후 n-hexane, ethylacetate 및 butanol을 이용하여 순차적으로 극성별 용매 분획하고, 물 잔류물을 회수하였다. 각각의 분획물들은 감압 농축하여 분말화하였으며, 이후 분말 시료들은 99.9% DMSO 용액에 적당한 농도로 녹여, 항산화 활성, 항혈전 활성, 적혈구 용혈 활성 및 성분 분석 평가에 사용하였다.
도토리 화분 추출물 및 분획물을 대상으로 각각 TT, PT, aPTT를 측정하여 항응고 활성을 평가하였다. 먼저 임상에서 항혈전제로 사용되고 있는 aspirin은 1.
도토리 화분 추출물 및 분획물의 항산화 활성은 DPPH (1,1-diphenyl2-picryl hydrazyl) 음이온 소거능[24], ABTS [2,2-azobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)] 양이온 소거능, nitrite 소거능[10] 및 환원력 측정으로 평가하였다. DPPH 음이온 소거능, ABTS 양이온 소거능 및 환원력의 비교 평가 시 추출물 및 분획물의 최종 농도는 0.
도토리 화분 추출물 및 분획물의 혈액응고 저해 활성은 thrombin time (TT), prothrombin time (PT) 및 activated partial thromboplastin time (aPTT)을 측정하여 평가하였다[23, 25]. 모든 실험은 3회 반복하여 평균치로 나타내었으며, 각각의 항응고 활성은 시료 첨가 시의 응고 시간의 평균치를 대조구 DMSO 응고시간의 평균치의 비로 나타내었다[12].
도토리 화분 추출물의 에틸아세테이트 분획물의 flavonoids 및 phenolic acids를 UPLC/MS/MS를 이용하여 분석하였다[26]. UPLC 분석 조건은 ACQUITY UPLC® BEH C18 1.
항산화 활성 및 혈소판 응집저해 활성이 우수한 도토리 화분의 에틸아세테이트 분획물을 대상으로 flavonoid 및 phenolic acids 성분을 분석하였다. 그 결과 상기 에틸아세테이트 분획물에서 rutin, isoquercitrin, astragalin, luteolin, hyperoside의 flavonoid와 4-hydroxybenzoic acid, p-couma- ric acid, vanillic acid, caffeic acid, ferulic acid 및 syringic acid의 phenolic acids가 확인되었다(Table 8).

대상 데이터

본 실험에 사용된 도토리 화분은 2019년 봄에 강원도 지역에서 채취 한 화분을 구입하여 -20℃에서 냉동 보관하면서 사용하였다. 도토리 화분은 마쇄기(FoodMix-150W, Angel Electric Co.

데이터처리

실험 결과는 SPSS 23.0 버전을 사용하여 mean±SD로 나타내었으며, 각 군 간의 차이는 ANOVA로 분석하였으며 유의수준은 p<0.05로 하였다.

이론/모형

Total polyphenol 및 Total flavonoid 함량 측정은 기존 보고된 방법[27]에 따라 측정하였으며, 각각 rutin과 tannic acid를 표준시약으로 사용하였다. 총당 정량은 phenol sulfuric acid법[19]을 사용하였으며, 표준 시약은 sucrose를 사용하였다.
도토리 화분 추출물 및 분획물의 인간 적혈구 용혈 활성은 기존 보고된 방법[11]으로 측정하여 평가하였다. 용혈 활성은 다음의 수식을 이용하여 계산하였다.
도토리 화분 추출물 및 분획물의 혈소판 응집저해 활성은 Whole Blood Aggregometer (Chronolog, Havertown, PA, USA)를 사용하여 impedance 법으로 평가하였다[28]. 먼저 인간 농축 혈소판(platelet rich plasma: PRP)을 전처리 및 수세한 후 최종 혈소판 농도가 5×108/ml이 되도록 조정하여 사용하였으며 응집 유도제로 collagen (1 mg/ml)을 사용하였다.
Total polyphenol 및 Total flavonoid 함량 측정은 기존 보고된 방법[27]에 따라 측정하였으며, 각각 rutin과 tannic acid를 표준시약으로 사용하였다. 총당 정량은 phenol sulfuric acid법[19]을 사용하였으며, 표준 시약은 sucrose를 사용하였다. 각각의 분석결과는 3회 반복한 실험의 평균과 편차로 나타내었다.

성능/효과

항산화 활성 및 혈소판 응집저해 활성이 우수한 도토리 화분의 에틸아세테이트 분획물을 대상으로 flavonoid 및 phenolic acids 성분을 분석하였다. 그 결과 상기 에틸아세테이트 분획물에서 rutin, isoquercitrin, astragalin, luteolin, hyperoside의 flavonoid와 4-hydroxybenzoic acid, p-couma- ric acid, vanillic acid, caffeic acid, ferulic acid 및 syringic acid의 phenolic acids가 확인되었다(Table 8). 가장 높은 함량을 나타낸 성분은 rutin (1192.
총 플라보노이드 함량 분석에서도 폴리페놀 함량 분석패턴과 유사하게 나타났다. 도토리 화분 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물 수율이 4.9%임을 감안한다면, 에탄올 추출물내의 총 폴리페놀 함량의 47%, 총 플라보노이드 함량의 77%가 에틸아세테이트 분획물에서 확인되며, 물 잔류물의 경우 도토리 화분 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량의 0.12%만을 포함하고 있음을 알 수 있었다. 한편 분획물들의 총당 함량 분석 결과, 물 잔류물 및 부탄올 분획물에서 957.
먼저, 대조구로 사용된 DMSO는 용혈 활성이 없었으며, Triton X-100은 1 mg/ml 농도에서 적혈구를 100% 용혈시킴을 확인하였다. 도토리 화분 추출물 및 헥산 분획물을 제외한 다른 분획물은 시료 1 mg/ml 농도까지 용혈 활성이 전혀 나타나지 않았으나 헥산 분획물에서는 89.8% 의 강력한 용혈 활성이 확인되었다. 특히 헥산 분획물의 경우 0.
도토리 화분 추출물 및 분획물을 대상으로 각각 TT, PT, aPTT를 측정하여 항응고 활성을 평가하였다. 먼저 임상에서 항혈전제로 사용되고 있는 aspirin은 1.5 mg/ml 농도에서 용매 대조구에 비해 TT는 1.45배, PT는 1.4배, aPTT 는 1.64배 연장시켜 우수한 혈액 응고저해 활성을 나타내었다(Table 5). 한편 도토리 화분 추출물의 다양한 분획물의 경우 5 mg/ml 농도에서 트롬빈에 대한 유의적인 저해활성은 인정되지 않았으나, 헥산 분획물 및 에틸아세테이트 분획물에서 프로트롬빈 저해활성이 나타났으며, 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물에서 혈액응고인자 저해활성이 확인되었다.
64배 연장시켜 우수한 혈액 응고저해 활성을 나타내었다(Table 5). 한편 도토리 화분 추출물의 다양한 분획물의 경우 5 mg/ml 농도에서 트롬빈에 대한 유의적인 저해활성은 인정되지 않았으나, 헥산 분획물 및 에틸아세테이트 분획물에서 프로트롬빈 저해활성이 나타났으며, 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물에서 혈액응고인자 저해활성이 확인되었다. 그러나 이는 흑생강 및 복분자 추출물에 비해 미약한 활성[12, 15]을 보였으며, 임상에서 항혈전제로 사용되고 있는 아스피린에 비해서도 미약하여 실제적인 항응고 효과를 기대할 수는 없었다.
4%의 혈소판 응집율을 나타내어 농도 의존적인 혈소판 응집저해 활성을 나타내었다. 한편 도토리 화분의 분획물 중에서는 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 잔류물이 0.25 mg/ml에서 각각 48.3, 50.9, 59.1%의 응집도를 나타내어 아스피린 0.125 mg/ml에 필적하는 혈소판 응집저해 활성이 나타냄을 확인하였다. 한편 헥산 분획물은 오히려 동일 농도에서 142.

후속연구

상기 결과는 도토리 화분 추출물 및 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물은 혈전 생성에는 영향을 미치지 않을 것으로 판단되며, 물 잔류물의 경우 내인성 혈액응고반응을 활성화하여 혈전생성을 촉진할 수 있음을 제시하고 있다[32]. 그러나 혈전 생성에 산화적 스트레스 [18, 19]와 니트로화[4] 반응이 관여되어 있으므로 항산화활성 및 nitrite 소거능이 우수한 에틸아세테이트 분획물의 경우 활성성분의 단리 이후의 추가적인 항응고 활성 연구가 필요하다고 판단된다.
2E). 이러한 결과는 도토리 화분의 에탄올 추출물이 다양한 혈소판 응집촉진 및 응집저해 활성 물질을 동시에 함유하고 있으며, 활성물질의 분리 동정시에는 각각 응집촉진을 통한 지혈제, 응집저해를 통한 항혈전제로 개발 가능함을 제시하고 있다.
이상의 결과는 도토리 화분의 폴리페놀 고함유 에틸아세테이트 분획물은 항산화, 항혈전 기능성 소재로 개발가능함을 제시하고 있으며, 현재 도토리 화분으로부터 신규의 항산화, 항혈전 활성물질 분석이 진행중에 있다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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