[논문]마우스 대식세포 RAW264.7에서 어성초와 야관문의 항염증 효과

김정태; 정정욱; 박성익; 이만효; 노중희; 손호용; 김종식

doi:10.5352/jls.2023.33.1.73

마우스 대식세포 RAW264.7에서 어성초와 야관문의 항염증 효과
Anti-inflammatory Effects of Houttuynia cordata and Lespedeza cuneata on Lipopolysaccharide-stimulated RAW264.7 Cells 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.33 no.1, 2023년, pp.73 - 81

김정태 (국립안동대학교 생명과학과) , 정정욱 (국립안동대학교 생명과학과) , 박성익 (경북보건환경연구원) , 이만효 (경북바이오산업연구원) , 노중희 (웰츄럴바이오) , 손호용 (국립안동대학교 식품영양학과) , 김종식 (국립안동대학교 생명과학과)

초록
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본 연구에서는 어성초(Houttuynia cordata, HC) 와 야관문(Lespedeza cuneata, LC)의 열수 추출물과 메탄올 추출물의 순차적 유기용매 분획물을 제조하였다. LPS를 처리한 RAW264.7세포에서 HC와 LC의 열수 추출물과 메탄올 추출물의 유기용매 분획물의 항염증 활성을 연구하였다. 어성초와 야관문의 hexane, chloroform, ethyl acetate 분획물의 처리에 의해 농도의존적으로 nitric oxide (NO) 생산을 저해하였으며, iNOS의 발현도 감소되었다. 이전 연구에서 HC와 LC의 메탄올 추출물의 ethyl acetate 분획물의 플라보노이드 함량을 분석하였다. 분석된 플라보노이드 중 HC와 LC에 공통적으로 함유된 apigenin을 선택하여 추가실험을 진행하였다. Apigenin은 세포 생존율에 영향을 주지 않으면서 NO 생산을 저해하였으며, iNOS와 COX-2의 단백질 발현도 억제하였다. 또한, apigenin은 p38 MAPK와 JNK의 인산화를 억제함으로써 항염증 활성을 가지는 것으로 생각된다. Apigenin 처리에 의해 차별적으로 발현되는 유전자 발현을 확인하기 위하여 RNA-seq 분석을 수행하였다. 발현이 감소된 유전자 중 4개의 cytokine 유전자(IL-1α, IL-1β, IL-6, CSF2)의 발현 감소를 정량적 real-time PCR을 통해 확인하였다. 종합적으로, 본 연구결과는 어성초와 야관문은 항염증 활성을 가지고 있으며, apigenin이 두 약용 작물의 항염증 활성을 담당하는 중요한 성분 중의 하나가 될 수 있다는 것을 제시한다.

Abstract ▼ AI-Helper

In the present study, we prepared hot water extracts and the subsequent organic solvent fractions of methanol extracts of Houttuynia cordata (HC) and Lespedeza cuneata (LC), and investigated their anti-inflammatory effects on lipopolysaccharide-stimulated RAW264.7 cells. Among the treated samples, hexane, chloroform, and ethyl-acetate fractions of HC and LC inhibited nitric oxide (NO) production in a dose-dependent manner, and decreased inducible nitric oxide synthase (iNOS) protein expression. And, we analyzed the flavonoid contents of the ethyl-acetate fraction of HC and LC, and chose apigenin for the further experiments because apigenin was one of flavonoids commonly found in HC and LC. Apigenin dramatically inhibited NO production in a dose-dependent manner without affecting cell viability and decreased iNOS and cyclooxygenase-2 (COX-2) expression. In addition, apigenin suppressed the phosphorylation of p38 and Jun N-terminal kinase (JNK) indicating that apigenin exerts anti-inflammatory activity via the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway. Subsequently, we conducted RNA-sequencing analysis to detect differentially expressed genes upon apigenin treatment. Among the down-regulated genes, four cytokine genes (interleukin (IL)-1α, IL-1β, IL-6, and colony stimulating factor 2 (CSF2)) were selected for the further analysis, and the reduction of their expression by apigenin was confirmed with quantitative real-time polymerase chain reaction. Overall, our results suggest that Houttuynia cordata and Lespedeza cuneata have the anti-inflammatory effects and apigenin can be the one of key molecules responsible for their anti-inflammatory activities.

주제어

표/그림 (8)

표 Table 1. Sequences of primers used for quantitative real time-RCR
$Fig. 1. Effects of extract and its organic solvent fractions of Houttuynia cordata (HC) and Lespedeza cuneate (LC) on NO production and cell viability in RAW264.7 cells. LPS-activated RAW264.7 cells were treated with water extracts and solvent fractions of methanol extracts of HC and LC for 16 hr. (A) Nitric oxide production was measured by Griess assay. (B) Cell viability was measured using MTS assay. RAW264.7 cells were incubated with various concentrations of hexane (Hex), Chloroform (Chl), and ethyl acetate (EA) fractions of methanol extracts of HC and LC for 16 hr. (C) NO production was measured by NO assay. (D) Cell viability was measured using MTS assay. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs LPS.$ 그림 Fig. 1. Effects of extract and its organic solvent fractions of Houttuynia cordata (HC) and Lespedeza cuneate (LC) on NO production and cell viability in RAW264.7 cells. LPS-activated RAW264.7 cells were treated with water extracts and solvent fractions of methanol extracts of HC and LC for 16 hr. (A) Nitric oxide production was measured by Griess assay. (B) Cell viability was measured using MTS assay. RAW264.7 cells were incubated with various concentrations of hexane (Hex), Chloroform (Chl), and ethyl acetate (EA) fractions of methanol extracts of HC and LC for 16 hr. (C) NO production was measured by NO assay. (D) Cell viability was measured using MTS assay. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs LPS.
$Fig. 2. Down-regulation of iNOS protein by the treatment of Hex, Chl, and EA fractions. LPS-stimulated RAW264.7 cells were incubated with 20 μg/ml of Hex, Chl, EA fractions for 16 hr. (A) Cell lysates were prepared from treated cells and western blot analysis was performed by using anti-iNOS and anti-Actin antibodies. (B) iNOS protein expression was quantified with$ 그림 Fig. 2. Down-regulation of iNOS protein by the treatment of Hex, Chl, and EA fractions. LPS-stimulated RAW264.7 cells were incubated with 20 μg/ml of Hex, Chl, EA fractions for 16 hr. (A) Cell lysates were prepared from treated cells and western blot analysis was performed by using anti-iNOS and anti-Actin antibodies. (B) iNOS protein expression was quantified with "Image studio" program.
그림 Fig. 3. Effects of apigenin (APG) on NO production and cell viability in RAW264.7 cells. LPS-treated RAW264.7 cells were treated with various concentreations (10, 20, 50, and 100 μM) of apigenin for 16 hr. (A) NO production was measured by NO assay. (B) Cell viability was measured using MTS assay. ***p<0.001 vs LPS.
그림 Fig. 4. Down-regulation of iNOS and COX-2 protein expression by apigenin. LPS-activated RAW264.7 cells were incubated with apigenin (APG) for 16 hr. (A) Cell lysates were prepared from treated cells and Western blot analysis was performed by using anti-iNOS, anti-COX-2 and anti-Actin antibodies. And, protein expression was quantified with "Image studio" program. (B) iNOS/Actin, (C) COX-2/Actin.
그림 Fig. 5. Suppression of p38 and JNK phosphorylation by apigenin. RAW264.7 cells were pre-treated with 50 μM of apigenin (APG) for 4 hr and then stimulated with LPS (0.2 μg/ml) for 30 min. (A) Cell lysates were prepared from treated cells and Western blot analysis was performed by using anti-p-p38, anti-p38, anti-p-JNK, anti-JNK, anti-p-ERK, anti-ERK and anti-Actin antibodies. And, protein expression was quantified with "Image studio" program. (B) p-38/p38, (C) p-JNK/JNK, (D) p-ERK/ERK.
그림 Fig. 6. Down-regulation of pro-inflammatory cytokine expression by apigenin. LPS-treated RAW264.7 cells were incubated with 50 μM of apigenin (APG) for 16 hr. Total RNAs were prepared from treated cells and then cDNA was synthesized. Real-time PCR was performed using gene-specific gene primers whereas GAPDH was used as an internal control. The result of qRT-PCR was indicated as a bar graph, whereas the result of FPKM measured by RNA-seq was indicated by dot. (FPKM: Fragments Per Kilobase of transcript per Million).
표 Table 2. Several selected cytokine genes which were down-regulated by apigenin

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 in vitro 모델에서 어성초와 야관문의 메탄올 추출물의 유기용매 분획물에 의한 항염증 활성을 연구하고, 두 약용작물에 공통적으로 함유되어 있는 플라보노이드 중 하나인 apigenin의 항염증 활성과 작용기전을 연구하였다.
본 연구에서는 어성초와 야관문의 메탄올 추출물의 ethyl acetate 분획물에 공통적으로 함유되어 있는 플라보노이드 성분 중 apigenin을 선택하여 항염증 활성 및 작용기전을 연구하였다. LPS를 처리한 RAW264.

제안 방법

Apigenin의 항염증 활성과 MAPK 신호전달 경로와의 관련성을 규명하기 위하여 MAPK 단백질 발현과 인산화를 확인하였다. MAPK 신호전달 경로의 인산화 시간을 고려하여 50 μM apigenin을 4시간 처리한 후 LPS를 0.

대상 데이터

마우스 대식세포 RAW264.7 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, USA)에서 구입하였다. 세포주 배양은 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco, Grand Island, NY, USA), 1% penicillin 및 streptomycin (WelGene, Korea)이 첨가된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, Korea)을 이용하였다.
실험 재료인 2종의 약용작물 어성초와 야관문은 영천시 소재 한약업사에서 구입하였다. 어성초와 야관문을 음건 후 분쇄한 시료에 10배량(w/v)의 메탄올과 증류수를 가해 각 80, 90℃에서 4시간씩 2회 환류 추출 후 추출액을 합하여 여과지(5C, Advantec, Tokyo, Japan)로 여과 후 여액을 감압농축기(N-1000, Eyela, Tokyo, Japan)로 감압 농축하여 추출물을 얻었다.

데이터처리

기준은 아무것도 처리하지 않은 대조구(Vehicle, VEH)와 LPS 처리군으로 설정하였다. Image studio를 사용하여 단백질 양을 수치화하였으며 SigmaPlot program을 사용하여 그래프로 나타냈다.
모든 실험은 최소한 3회 이상 반복 실험을 실시하였으며 실험 결과는 평균±표준편차로 나타내었고, 각 실험 결과의 유의성 검토는 시료가 포함되지 않은 LPS 처리군과 비교하여 student’s t-test에 의해 판정하였으며 p<0.05일 때 유의성이 있다고 판단하였다.

이론/모형

MAPK 신호전달 경로의 인산화 시간을 고려하여 50 μM apigenin을 4시간 처리한 후 LPS를 0.2μg/ml의 농도로 30분 처리한 다음 Western blot analysis를 수행하였다
Western blot 분석을 통해 확인한 단백질 발현을 비교하기 위해 image 분석 program인 Image studio (Li-cor, USA)를 사용하였다. 기준은 아무것도 처리하지 않은 대조구(Vehicle, VEH)와 LPS 처리군으로 설정하였다.
어성초와 야관문의 메탄올 추출물의 hexane, chloroform, ethyl acetate 유기용매 분획물 처리에 의한 NO 생산을 담당하는 iNOS 단백질 발현을 확인하기 위해 western blot analysis를 수행하였다. LPS를 처리한 RAW264.

성능/효과

LPS를 처리한 RAW264.7 세포주에 apigenin을 10, 20, 50, 100 μM의 농도로 16시간 처리한 결과 50 μM apigenin 처리군 까지는 세포 생존율에 큰 영향이 없으면서 NO 생산을 농도 의존적으로 감소시키는 것으로 확인되었다(Fig
그 결과, 50 μM apigenin을 처리한 경우 p38, JNK의 인산화는 억제된 반면, ERK의 인산화에는 큰 변화가 없음을 확인하였다(Fig
7 세포주에 각 시료를 20 μg/ml 농도로 16시간 처리한 후 iNOS 발현을 확인하였다. 그 결과, LPS의 단독처리에 의해 증가된 iNOS 단백질 발현이 어성초의 유기용매 분획물(Hex, Chl, EA) 처리군에서 iNOS 단백질 발현이 완전히 저해되었으며, 야관문의 유기용매 분획물(Hex, Chl, EA) 처리군에서는 현저하게 iNOS 단백질 발현이 감소됨을 확인하였다(Fig. 2A).
그 결과, LPS의 단독처리에 의해 증가된 iNOS 단백질이 apigenin의 처리에 의해 농도의존적으로 감소함을 확인하였으며, COX-2의 경우 50 μM apigenin 처리군에서 현저하게 발현이 감소됨을 확인하였다(Fig
7 세포에서 항염증 활성을 가지고 있음을 보고하였다. 또한, 두 약용작물의 메탄올 추출물의 ethyl acetate 분획물에 공통적으로 함유되어 있는 플라보노이드 apigenin이 항염증 활성을 가지고 있으며, 이러한 항염증 활성은 p38 MAPK와 JNK 경로를 억제하고 친염증성 cytokine들의 발현을 억제함으로써 작용한다는 것을 제시하였다. 이러한 결과는 apigenin이 어성초와 야관문의 항염증 활성을 담당하는 핵심 물질 중 하나가 될 수 있음을 시사한다.
5D). 이러한 연구 결과는 apigenin이 p38 MAPK와 JNK 경로를 억제함으로써 염증반응을 억제한다는 것을 의미한다.
4C). 이러한 연구결과는 apigenin의 항염증 활성이 친 염증성 단백질인 iNOS와 COX-2의 발현 억제와 관련이 있다는 것을 시사한다.
종합적으로, 본 연구에서는 어성초와 야관문의 메탄올 추출물의 유기용매 분획물이 LPS로 염증이 유도된 RAW 264.7 세포에서 항염증 활성을 가지고 있음을 보고하였다. 또한, 두 약용작물의 메탄올 추출물의 ethyl acetate 분획물에 공통적으로 함유되어 있는 플라보노이드 apigenin이 항염증 활성을 가지고 있으며, 이러한 항염증 활성은 p38 MAPK와 JNK 경로를 억제하고 친염증성 cytokine들의 발현을 억제함으로써 작용한다는 것을 제시하였다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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