[논문]RAW 264.7 세포에서 분비나무(Abies nephrolepis MAX.) 추출물의 항염 효과에 대한 연구

오민정; 염현지; 이진영

doi:10.5352/jls.2024.34.3.160

RAW 264.7 세포에서 분비나무(Abies nephrolepis MAX.) 추출물의 항염 효과에 대한 연구
A Study of the Anti-inflammatory Effects of Abies nephrolepis MAX. Extract in RAW 264.7 Cells 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.34 no.3, 2024년, pp.160 - 169

오민정 (호서대학교 화장품생명공학부) , 염현지 (호서대학교 화장품생명공학부) , 이진영 (호서대학교 화장품생명공학부)

초록
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본 연구에서는 분비나무(Abies nephrolepis MAX.)를 분비나무 줄기(Abies nephrolepis MAX. stem) 추출물과 분비나무 잎(Abies nephrolepis MAX. leaf) 추출물로 나누어 항염 관련 기능성을 연구하여 화장품 소재로서의 이용가능성을 알아보고자 하였다. MTT assay를 통해 세포 생존율을 확인한 결과, 대식세포(RAW 264.7)에서 분비나무 줄기와 잎 추출물의 500 ㎍/ml의 농도에서 각각 97.8%, 95.6%의 생존율을 보였다. 이에 따라 세포 관련 실험을 세포의 생존율이 100%에 가까운 25, 50, 100 ㎍/ml의 농도로 진행하였다. 염증을 유발하는 활성산소인 NO 생성에 대해 분비나무 추출물을 측정한 결과, 분비나무 추출물을 처리한 구에서 NO 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있었으며, 분비나무 줄기와 잎은 100 ㎍/ml의 농도에서 71.1%, 42.9%의 저해율을 나타내었다. 분비나무 추출물을 RAW 264.7 세포에 처리하여 단백질 발현을 측정한 결과, COX-2, iNOS 및 pro-inflammatoty cytokine인 IL-1β, IL-6, TNF-α 인자에서 농도 의존적으로 단백질 발현이 억제되었으며, 분비나무 줄기의 iNOS와 분비나무 잎의 COX-2, iNOS, IL-6 및 TNF-α의 인자가 대조군인 Vit. C와 비교하였을 때 우수한 단백질 발현 억제를 보였다. 또한, RAW 264.7 세포에 분비나무 추출물을 처리하여 mRNA 발현을 측정한 결과, 분비나무 줄기의 iNOS, 분비나무 잎의 COX-2와 iNOS의 mRNA 발현양은 대조군인 Vit. C와 비교하였을 때 우수한 억제율을 확인할 수 있었으며, pro-inflammatoty cytokine인 IL-1β, IL-6 및 TNF-α인자에서는 분비나무 줄기 추출물의 IL-1β는 대조군과 유의한 결과를 나타냈지만, 나머지 인자에서는 대조군인 Vit. C와 비교하였을 때 mRNA 발현 억제율이 우수한 것을 확인할 수 있었다. 이에 따라 분비나무 추출물이 항염 관련 기능성 활성에 우수함을 나타내어 화장품 소재로써의 이용가능성을 확인할 수 있었다.

Abstract ▼ AI-Helper

In this study, Abies nephrolepis MAX. was divided into A. nephrolepis MAX. stem (AS) extract and A. nephrolepis MAX. leaf (AL) extract. Their anti-inflammatory abilities and applicability as cosmetic materials were determined. Tests of the cell survival rate measured using RAW 264.7 cells and extracts of AS and AL showed 97.8% and 95.6% cell viability at a 500 ㎍/ml concentration. To determine anti-inflammatory activity, we examined the inhibitory effects on the production of LPS-induced NO in RAW 264.7 cells by Griess assay. The results showed that the AS and AL extracts presented a concentration-dependent inhibition of NO production. The protein expression inhibitory effects of AS and AL extracts were measured by western blot at 25, 50, and 100 ㎍/ml concentrations. β-actin was used as a positive control. The results of western blot of extracts from AS showed that the expression inhibition rate of the iNOS protein was decreased by 50.1% at the 100 ㎍/ml concentration. Additionally, the results of western blot of AL extracts showed that the expression inhibition rate of COX-2 and iNOS protein was decreased by 66% and 8.2% at the 100 ㎍/ml concentration. The mRNA inhibitory effect was measured by RT-PCR at 25, 50, and 100 ㎍/ml concentrations. GAPDH was used as a positive control. Consequently, the iNOS mRNA expression effect by RT-PCR of AS extract demonstrated by RT-PCR decreased by 27.9% at the 100 ㎍/ml concentration, and the iNOS and IL-6 mRNA expression effect of AL extract measured by RT-PCR decreased by 48.6% and 48.7% at the 100 ㎍/ml concentration.

주제어

표/그림 (11)

표 Table 1. Sequence of the primers used for RT-PCR
그림 Fig. 1. Cell viability of extract from Abies nephrolepis MAX. on macrophage cell (RAW 264.7). After RAW 264.7 cells were incubated for 24 hr in DMEM, the cells were treated with various concentrations of Abies nephrolepis MAX. for 24 hr, and not treated with LPS. Result are means ± SD of triplicate data. ▮ AS : Abies nephrolepis MAX. stem, ▯AL : Abies nephrolepis MAX. leaf.
그림 Fig. 2. Effect of Abies nephrolepis MAX. extract on production of nitric oxide in RAW 264.7. After RAW 264.7 cells were incubated with 1 μg/ml of LPS for 2 hr and then treated with various concentrations (5, 10, 50, 100, 500 and 1,000 μg/ml) of extract from Abies nephrolepis MAX. Con: control, treated with LPS; Nor: normal, not treated with LPS. Data are represented as means ± SD of three individual experiments. ▮AS : Abies nephrolepis MAX. stem, ▯AL : Abies nephrolepis MAX. leaf.
그림 Fig. 3. COX-2, iNOS protein expression rate of Abies nephrolepis MAX. stem extract on macrophage cell (RAW 264.7). After RAW 264.7 cells (1×10⁶ cells) were incubated in DMEM for 24 hr, the cells were treated Abies nephrolepis MAX. stem extract of 25, 50 and 100 μg/ml concentrations for 24 hr. Con: control, treated with LPS; Nor: normal, not treated with LPS. The results were expressed as the average of triplicate samples.
그림 Fig. 4. COX-2, iNOS protein expression rate of Abies nephrolepis MAX. leaf extract on macrophage cell (RAW 264.7). After RAW 264.7 cells (1×10⁶ cells) were incubated in DMEM for 24 hr, the cells were treated Abies nephrolepis MAX. leaf extract of 25, 50 and 100 μg/ml concentrations for 24 hr. Con: control, treated with LPS; Nor: normal, not treated with LPS. The results were expressed as the average of triplicate samples.
그림 Fig. 5. IL-1β, IL-6, TNF-α protein expression rate of Abies nephrolepis MAX. stem extract on macrophage cell (RAW 264.7). After RAW 264.7 cells (1×10⁶ cells) were incubated in DMEM for 24 hr, the cells were treated Abies nephrolepis MAX. stem extract of 25, 50 and 100 μg/ml concentrations for 24 hr. Con: control, treated with LPS; Nor: normal, not treated with LPS. The results were expressed as the average of triplicate samples.
그림 Fig. 6. IL-1β, IL-6, TNF-α protein expression rate of Abies nephrolepis MAX. leaf extract on macrophage cell (RAW 264.7). After RAW 264.7 cells (1×10⁶ cells) were incubated in DMEM for 24 hr, the cells were treated Abies nephrolepis MAX. leaf extract of 25, 50 and 100 μg/ml concentrations for 24 hr. Con: control, treated with LPS; Nor: normal, not treated with LPS. The results were expressed as the average of triplicate samples.
그림 Fig. 7. COX-2, iNOS mRNA expression rate of Abies nephrolepis MAX. stem extract on macrophage cell (RAW 264.7). After RAW 264.7 cells (1×10⁶ cells) were incubated in DMEM for 24 hr, the cells were treated Abies nephrolepis MAX. stem extract of 25, 50 and 100 μg/ml concentrations for 24 hr. Con: control, treated with LPS; Nor: normal, not treated with LPS. The results were expressed as the average of triplicate samples.
그림 Fig. 8. COX-2, iNOS mRNA expression rate of Abies nephrolepis MAX. leaf extract on macrophage cell (RAW 264.7). After RAW 264.7 cells (1×10⁶ cells) were incubated in DMEM for 24 hr, the cells were treated Abies nephrolepis MAX. leaf extract of 25, 50 and 100 μg/ml concentrations for 24 hr. Con: control, treated with LPS; Nor: normal, not treated with LPS. The results were expressed as the average of triplicate samples.
그림 Fig. 9. IL-1β, IL-6, TNF-α mRNA expression rate of Abies nephrolepis MAX. stem extract on macrophage cell (RAW 264.7). After RAW 264.7 cells (1×10⁶ cells) were incubated in DMEM for 24 hr, the cells were treated Abies nephrolepis MAX. stem extract of 25, 50 and 100 μg/ml concentrations for 24 hr. Con: control, treated with LPS; Nor: normal, not treated with LPS. The results were expressed as the average of triplicate samples.
그림 Fig. 10. IL-1β, IL-6, TNF-α mRNA expression rate of Abies nephrolepis MAX. leaf extract on macrophage cell (RAW 264.7). After RAW 264.7 cells (1×10⁶ cells) were incubated in DMEM for 24 hr, the cells were treated Abies nephrolepis MAX. leaf extract of 25, 50 and 100 μg/ml concentrations for 24 hr. Con: control, treated with LPS; Nor: normal, not treated with LPS. The results were expressed as the average of triplicate samples.

AI 본문요약
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제안 방법

RAW 264.7 세포에 대해 분비나무 줄기와 잎 추출물은 500 μg/ml 농도에서 97.8%, 95.6%의 세포 생존율을 나타내었으며 이에 본 실험에서는 시료용액을 100%에 가까운 세포 생존율이 확인된 25, 50, 100 μg/ml의 농도구간으로 설정하여 실험을 진행하였다.
RAW 264.7 세포에 추출물을 25, 50, 100 μg/ml의 농도구간별로 처리한 후, LPS를 처리하여 염증 활성을 과발현시킨 control 구간과 LPS를 처리하지 않은 normal 구간으로 설정하였다
화장품 제조 시 함유되는 추출물이 독성을 함유하고 있는지 판단하기 위해 MTT assay를 통한 세포 생존율 측정을 진행하였다. 기질로써 사용된 MTT를 이용하여 생세포에서 formazan을 생성시킨 후 사멸한 세포에서는 반응하지 않아 formazan이 환원되지 않는 정도를 확인하여 세포의 생존율을 알아보았다[24].
분비나무 줄기와 잎 추출물을 LPS로 염증이 유도된 RAW 264.7 세포에서 pro-inflammatoty cytokine인 IL-1β, IL-6, TNF-α 인자의 mRNA 발현양을 RT-PCR을 사용하여 측정하였으며, 결과를 Fig

대상 데이터

ATCC (USA)사에서 대식세포인 RAW 264.7을 구입 후 사용하였다. 세포 배양을 위해 Thermo Scientific Hyclone(USA)에서 penicillin/streptomycin, fetal bovine serum (FBS), trypsin, dulbecco`s modified eagle medium (DMEM), phosphate buffered saline (PBS)을 구입 후 사용하였으며, 세포 독성 측정 실험에 사용된 dimethyl sulfoxide (DMSO)는 BioShop (Canada)에서 구입 후 사용하였다.
본 연구의 시료로써 사용된 분비나무는 2020년 9월 경기도산림환경연구소에서 채취하였으며 70% 에틸 알코올을 가하여 추출하였다. 채취한 시료는 세척 및 건조하여 분쇄 후 70% 에틸 알코올을 시료 무게의 10배로 가하여 상온에서 24시간 침지 과정을 진행하였다.

이론/모형

분비나무 줄기와 잎 추출물에 대한 염증유발 인자인 COX-2와 iNOS의 단백질 발현 억제 효과를 확인하기 위해 western blot을 이용하여 실험을 진행하였다. 그 결과를 Fig.
분비나무 줄기와 잎 추출물의 염증유발 인자인 COX-2와 iNOS에 미치는 mRNA 발현 정도를 측정하기 위해 RT-PCR을 이용하여 실험하였다. 이때 GAPDH을 세포의 다양한 조건에서도 발현의 정도 차이가 매우 적은 house keeping gene인 positive control로 사용하였다.
염증유발 인자인 LPS로 염증이 유도된 RAW 264.7 세포에서 분비나무 줄기와 잎 추출물이 pro-inflammatoty cytokine인 IL-1β, IL-6, TNF-α 단백질 발현양에 미치는 영향을 측정하기 위해 western blot을 진행하였다
화장품 제조 시 함유되는 추출물이 독성을 함유하고 있는지 판단하기 위해 MTT assay를 통한 세포 생존율 측정을 진행하였다. 기질로써 사용된 MTT를 이용하여 생세포에서 formazan을 생성시킨 후 사멸한 세포에서는 반응하지 않아 formazan이 환원되지 않는 정도를 확인하여 세포의 생존율을 알아보았다[24].

성능/효과

그 결과 Fig. 7, 8과 같이 LPS에 의해 증가된 COX-2와 iNOS mRNA 발현양이 억제된 것을 확인할 수 있었으며, 분비나무 줄기의 COX-2 mRNA 발현양은 같은 농도의 대조군과 비교하였을 때 유의한 억제율을 확인할 수 있었다. 반면에, 100 μg/ml의 농도에서 분비나무 줄기의 iNOS는 27.
2와 같이 나타내었다. LPS 처리구는 LPS 무처리구에 비해 NO 발현량이 높았음을 확인할 수 있었으며, 분비나무 추출물의 농도가 증가함에 따라 NO의 발현이 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 분비나무 줄기 추출물의 경우 500 μg/ml의 농도에서 71.
분비나무 줄기 추출물의 경우 500 μg/ml의 농도에서 71.1%, 분비나무 잎 추출물은 42.9%의 저해율을 나타내었으며, 분비나무 추출물이 염증발현 억제에 우수한 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
C보다 우수하였다. 분비나무 줄기와 잎의 iNOS 발현량은 줄기가 50.1%, 잎이 8.2%로 분비나무 줄기의 단백질 발현 억제가 우수함을 확인할 수 있었다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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