[논문]외형 및 행동 습관 관련 50개 SNP 마커 분석을 위한 targeted amplicon next-generation sequencing 패널 개발

박희연; 노윤지; 김응수; 박현철

doi:10.5806/ast.2024.37.3.189

외형 및 행동 습관 관련 50개 SNP 마커 분석을 위한 targeted amplicon next-generation sequencing 패널 개발
Development of targeted amplicon next-generation sequencing panel of 50 SNPs related to externally visible characteristics and behavior

분석과학 = Analytical science & technology, v.37 no.3, 2024년, pp.189 - 199

박희연 (국립과학수사연구원 유전자과) , 노윤지 (국립과학수사연구원 유전자과) , 김응수 (국립과학수사연구원 유전자과) , 박현철 (국립과학수사연구원 유전자과)

초록
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법유전학에서 개인의 신원확인을 위한 STR 프로필 분석이 불가한 경우, DNA를 이용한 외형추정특성을 이용하여 개인에 대한 정보를 얻을 수 있다. 최근 눈동자, 머리카락, 피부 색과 같은 외형추정특성을 확인하는 방법들이 연구되고 있지만, 이러한 외형추정특성 정보만 가지고는 한국을 비롯한 동아시아 지역에서 적용하기에는 한계가 있다. 본 연구에서는 개인의 외형과 관련된 표현형을 수사정보로서 활용하기 위해 눈 모양, 머리카락 굵기, 피부 색 뿐만 아니라 탈모, 체형, 고도근시, 얼굴모양, 여드름, 행동습관과 관련된 SNP를 탐색하였다. 이들 표현형과 관련된 50개의 SNP를 선정하여 한 번에 증폭할 수 있는 targeted amplicon NGS 방식의 multiplex PCR 패널을 개발하였다. 실험 결과 14개 샘플에서 50개 SNP의 대립유전자 유형과 빈도를 확인할 수 있었다. 향후 본 패널을 가지고 더 많은 샘플을 이용하여 유전형과 표현형 간 연관성 확인 및 결과 해석 방법을 분석할 예정이다.

Abstract ▼ AI-Helper

In forensic genetics, when it is not possible to confirm an individual's identity through STR profile analysis, additional information about the individual can be obtained using DNA-based phenotypic traits estimation. Recently, various researches have been conducted on methods to determine externally visible characteristics (EVC) such as eyes, hair, and skin color. However, relying solely on such phenotypic traits information has limitations for application in East Asian regions, including Korea. In this study, in order to utilize EVC related to an individual's appearance as investigative information, SNPs related to eye shape, hair thickness, skin color, as well as baldness, body type, high myopia, facial shape, acne, and behavioral habits were explored. A total of 50 SNPs were selected, and a targeted amplicon NGS panel capable of amplifying them all at once was developed. Experimental results confirmed the allelic types and frequencies of the 50 SNPs in 14 samples. We plan to use this panel to investigate the correlation between genotype and phenotype using various samples, and to develop methods for interpreting the results.

주제어

표/그림 (7)

표 Table 1. Selected 50 SNP markers associated with external visible characteristics(EVCs) and behavior
표 Table 2. Primer sequences to amplify selected 50 SNP markers
그림 Fig. 1. Visualization of read sequence of rs3114908 using IGV. Target SNP is located at 101 bp.
표 Table 3. Targeted NGS results for 50 SNP markers
표 Table 3. Continued
표 Table 4. Genotypes obtained with targeted NGS results from 14 additional samples
표 Table 3. Continued

AI 본문요약
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문제 정의

법과학 시료에서 외형 예측 방법을 적용하기 위해서는 표현형을 구체적으로 구별할 수 있는 외형 관련 SNP 마커를 찾고, SNP 마커의 분석을 통한 외형 예측 모델을 개발하는 것이 매우 중요하다. 따라서 본 연구에서는 법과학 시료에 적용 가능한 외형 추정 및 행동 습관 관련된 SNP를 선별하고, 선별된 다수의 SNP 마커를 NGS 기반으로 분석하기 위한 패널을 개발하였다.
본 연구에서는 법과학 시료의 분석을 위한 50개의 외형 추정 및 행동 습관 관련 SNP를 선별하였고, targeted amplicon NGS 방법을 이용하여 각 SNP의 유전형을 확인할 수 있는 NGS 패널을 개발하였다. 본 실험 기법은 DNA의 양이 적거나 고도로 분해되어 STR 분석이 어려운 시료에서 효과적으로 분석을 수행할 수 있어 개인을 추정하는 데 법과학적인 증거를 제공할 수 있을 것으로 사료된다.

제안 방법

본 연구에서 개발된 NGS 패널을 이용하여 14개의 추가 시료를 분석하였다. 14개 시료에서 multiplex PCR을 통해 50개의 SNP 부위를 증폭하여 라이브러리를 제작하였다. NGS 분석결과 일루미나 시스템 플랫폼의 종류와 관계없이 모든 SNP에서 read가 확인되었고 50개 SNP의 유전형과 대립유전자 빈도를 확인할 수 있었다(Table 4 ).
본 연구에서는 눈동자 색, 머리카락 색 외 다른 외형을 특정하기 위해 피부 색과 관련된 SNP 17개, 눈모양, 머리카락 굵기, 피부 색, 탈모, 체형, 고도근시, 얼굴모양, 여드름과 관련된 SNP 28개(외형 추정)와 알코올 대사체 및 니코틴 대사체와 같이 행동 추정과 관련된 SNP 5개를 탐색하였고, 이들 SNP를 한 번에 분석하기 위해 targeted amplicon NGS 방식의 multiplex PCR 패널을 개발하였다. 본 패널을 이용하여 총 14개 샘플에서 50개 SNP가 성공적으로 분석되었고, 각 SNP의 대립유전자 빈도(allele frequency)도 확인할 수 있었다.

대상 데이터

본 연구에서 사용한 시료는 국립과학수사연구원 기관생명윤리심사 승인(IRB: 906-240131-BR-016-01)에 따라 14명의 구강 시료를 채취하여 사용하였다. 14명은 흡연자, 음주 가능 여부, 탈모, 주근깨 여부, 체형 차이 등을 고려하여 선별하였고, 남성과 여성 각각 7명의 시료를 사용하였다.
본 연구에서 개발된 NGS 패널을 이용하여 14개의 추가 시료를 분석하였다. 14개 시료에서 multiplex PCR을 통해 50개의 SNP 부위를 증폭하여 라이브러리를 제작하였다.
본 연구에서 사용한 시료는 국립과학수사연구원 기관생명윤리심사 승인(IRB: 906-240131-BR-016-01)에 따라 14명의 구강 시료를 채취하여 사용하였다. 14명은 흡연자, 음주 가능 여부, 탈모, 주근깨 여부, 체형 차이 등을 고려하여 선별하였고, 남성과 여성 각각 7명의 시료를 사용하였다.
패널 검증을 위한 14개의 추가 시료의 라이브러리 제작을 위해 NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina (New England Biolabs, Ipswich, MA)의 매뉴얼에 따라 라이브러리를 제작하였다. 제작된 라이브러리는 MiSeq FGx 시스템(Illumina, San Diego, CA)을 이용해 NGS 분석을 진행하였다.

데이터처리

NGS 결과로 얻은 fastq 파일은 리눅스 기반 운영체제에서 프라이머를 설계할 때 사용했던 201 bp sequence를 참조서열(GRCh38)로 mapping하였다. Bowtie2 (2.
13)을 이용해 변환하였다. 각 SNP는 FreeBayes (1.0.0)을 이용해 변이가 있는 유전형을 vcf 파일로 추출하고 Integrative Genomics Viewer(IGV, 2.6.1)를 이용하여 시각화하였다.
13)를 이용해 파일을 변환하였다. 결과는 Integrative Genomics Viewer (IGV, 2.6.1)를 이용하여 시각화하였다.
패널 검증을 위한 14개의 추가 시료의 라이브러리 제작을 위해 NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina (New England Biolabs, Ipswich, MA)의 매뉴얼에 따라 라이브러리를 제작하였다. 제작된 라이브러리는 MiSeq FGx 시스템(Illumina, San Diego, CA)을 이용해 NGS 분석을 진행하였다.

이론/모형

각 SNP 위치의 앞과 뒤 100 bp 서열을 포함한 201 bp 서열을 대상으로 프라이머 부위를 탐색하였다. National Center for Biotechnology (NCBI)의 Primer designing tool 및 Primer3 프로그램을 기반으로 프라이머를 디자인하였다. 각 50개 마커의 증폭 산물 길이가 135 bp에서 150 bp 사이에 위치하도록 하였으며, GC% 범위는 30 %에서 70 % 였으며, Tm 값은 55 ℃에서 68 ℃ 사이가 되도록 프라이머를 제작하였다.

성능/효과

14개 시료에서 multiplex PCR을 통해 50개의 SNP 부위를 증폭하여 라이브러리를 제작하였다. NGS 분석결과 일루미나 시스템 플랫폼의 종류와 관계없이 모든 SNP에서 read가 확인되었고 50개 SNP의 유전형과 대립유전자 빈도를 확인할 수 있었다(Table 4 ). 이후에는 표현형을 알고 있는 200명의 시료를 대상으로 SNP 유전형을 확인하고, 표현형과의 연관 정도 분석 등을 통하여 외형 및 행동 습관 추정 과정의 확립을 이룰 수 있을 것으로 기대된다.
19%)의 read가 mapping 되었다. 그리고 50개의 SNP 마커에 대해 모두 read가 확인되었으므로, 50개 SNP 부위가 multiplex PCR로 증폭된 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1, Table 3).
본 연구에서는 눈동자 색, 머리카락 색 외 다른 외형을 특정하기 위해 피부 색과 관련된 SNP 17개, 눈모양, 머리카락 굵기, 피부 색, 탈모, 체형, 고도근시, 얼굴모양, 여드름과 관련된 SNP 28개(외형 추정)와 알코올 대사체 및 니코틴 대사체와 같이 행동 추정과 관련된 SNP 5개를 탐색하였고, 이들 SNP를 한 번에 분석하기 위해 targeted amplicon NGS 방식의 multiplex PCR 패널을 개발하였다. 본 패널을 이용하여 총 14개 샘플에서 50개 SNP가 성공적으로 분석되었고, 각 SNP의 대립유전자 빈도(allele frequency)도 확인할 수 있었다.

후속연구

본 연구에서는 법과학 시료의 분석을 위한 50개의 외형 추정 및 행동 습관 관련 SNP를 선별하였고, targeted amplicon NGS 방법을 이용하여 각 SNP의 유전형을 확인할 수 있는 NGS 패널을 개발하였다. 본 실험 기법은 DNA의 양이 적거나 고도로 분해되어 STR 분석이 어려운 시료에서 효과적으로 분석을 수행할 수 있어 개인을 추정하는 데 법과학적인 증거를 제공할 수 있을 것으로 사료된다. 향후, 개발된 NGS 패널을 이용하여 더 많은 시료를 분석하고, 머신러닝을 통해 대립유전자형 빈도에 따라 해당 유전자형과 표현형의 상관관계를 분석하여 표현형 예측 성능을 평가할 예정이다.
향후, 개발된 NGS 패널을 이용하여 더 많은 시료를 분석하고, 머신러닝을 통해 대립유전자형 빈도에 따라 해당 유전자형과 표현형의 상관관계를 분석하여 표현형 예측 성능을 평가할 예정이다. 이러한 데이터를 기반으로 배경 정보가 없는 시료에서 유전자형을 통한 실제 표현형 추정에 적용할 예정이다. 이러한 실험 기법은 다양한 SNP 마커를 활용한 분석에 적용할 수 있을 것으로 생각되며, 범죄 현장 증거물에서의 용의자 추정 및 신원 불상 변사자의 신원 추정에서 중요한 증거를 제공할 것으로 기대된다.
이러한 데이터를 기반으로 배경 정보가 없는 시료에서 유전자형을 통한 실제 표현형 추정에 적용할 예정이다. 이러한 실험 기법은 다양한 SNP 마커를 활용한 분석에 적용할 수 있을 것으로 생각되며, 범죄 현장 증거물에서의 용의자 추정 및 신원 불상 변사자의 신원 추정에서 중요한 증거를 제공할 것으로 기대된다.
NGS 분석결과 일루미나 시스템 플랫폼의 종류와 관계없이 모든 SNP에서 read가 확인되었고 50개 SNP의 유전형과 대립유전자 빈도를 확인할 수 있었다(Table 4 ). 이후에는 표현형을 알고 있는 200명의 시료를 대상으로 SNP 유전형을 확인하고, 표현형과의 연관 정도 분석 등을 통하여 외형 및 행동 습관 추정 과정의 확립을 이룰 수 있을 것으로 기대된다.
1, Table 3). 하지만 비만 관련 SNP인 rs633715 마커의 경우 100 read 미만으로 확인되었으므로, 감도가 더 높은 NGS 장비/시약의 사용 또는 프라이머의 교체 등의 추가적인 보완 있어야 할 것으로 판단된다.
본 실험 기법은 DNA의 양이 적거나 고도로 분해되어 STR 분석이 어려운 시료에서 효과적으로 분석을 수행할 수 있어 개인을 추정하는 데 법과학적인 증거를 제공할 수 있을 것으로 사료된다. 향후, 개발된 NGS 패널을 이용하여 더 많은 시료를 분석하고, 머신러닝을 통해 대립유전자형 빈도에 따라 해당 유전자형과 표현형의 상관관계를 분석하여 표현형 예측 성능을 평가할 예정이다. 이러한 데이터를 기반으로 배경 정보가 없는 시료에서 유전자형을 통한 실제 표현형 추정에 적용할 예정이다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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