[논문]Saccharomyces cerevisiae에서의 비만 억제용 재조합 단백질 leptin 생산 연구

강환구; 이충열; 윤지선; 김원철; 박형수

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강환구 (한남대학교 화학공학과) , 이충열 (한남대학교 화학공학과) , 윤지선 (한남대학교 화학공학과) , 김원철 (한남대학교 화학공학과) , 박형수 (한남대학교 화학공학과)

Human leptin is a 16kDa protein and is known to influence body weight control. It is composed of 146 amino acids. In this study, human leptin gene was obtained from homosapiens leptin mRNA using RT-PCR. And leptin gene was inserted into secretion vectors and Saccharomyces cerevisiae was transformed. In flask culture, Saccharomyces cerevisiae transformant showing high leptin expression titre was selected and with the best transformant, fed-batch fermentation and purification was optimized. As a result, about 2 g/L of leptin was expressed and the yield of purification was about 80%.

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문제 정의

또한 Indianopolis의 Lilly Research Lab에서의 결과에 의하면 insect cell의 일종인 Spodoptera fmgiperda (Sf-9) cell을 recombinant ba c니ovir기s로 infection시켜 leptin을 생산한 결과 folding이 잘되고 unmodified 형태루 발현되어짐이 확인되었으나 발현량이 메우 낮은 수준임을 알 수 있었다. 따라서 이 연구과제에서는 효모를 이용한 leptin 1발힌 연구를 수행하였다.

제안 방법

수행하였다. Chromatography로는 anion exchanger (DEAE sepharose CL-6B) 및 gel filtration (Sephadex G-75)를 사용하였다.
플라스크 배양을 통하여 고발현 균주룔 선텍하고 이 균주를 이용한 최적.I의 발효방법 개발을 위하여 5L scale의 발효기 (코바이오텍(주))를 이용하여 발효실험을 진행하였다. 최적의 발효를 위하여 fed-batch 방식에 의한 발효로 진행하였는데 균주의 비성장속도, 기질수율에 따라 feeding 속도가 조절되는 프로그램을 이용하여 최 적량의 C-source와 N-source를 peristaltic pump를 이용하여 feeding함으로써 최적의 균주 성장을 유지하였다.
발효하여 언은 배지중의 leptin을 정제하기 위해 chromatography를 수행하였다. Chromatography로는 anion exchanger (DEAE sepharose CL-6B) 및 gel filtration (Sephadex G-75)를 사용하였다.
최소배지 배양을 통하여 얻어긴 균주들의 발현랑 확인을 위한 기초적인 회분식 실험올 위하여 플라스크 베양을 진행하였는데, 플라스크로는 500ml의 baffled flask를 이용하고 100 ml의 베지에 균주를 접종한후 250rpm의 진탕배양기에서 실험하였다. 플라스크 배양을 통하여 고발현 균주룔 선텍하고 이 균주를 이용한 최적.
I의 발효방법 개발을 위하여 5L scale의 발효기 (코바이오텍(주))를 이용하여 발효실험을 진행하였다. 최적의 발효를 위하여 fed-batch 방식에 의한 발효로 진행하였는데 균주의 비성장속도, 기질수율에 따라 feeding 속도가 조절되는 프로그램을 이용하여 최 적량의 C-source와 N-source를 peristaltic pump를 이용하여 feeding함으로써 최적의 균주 성장을 유지하였다.

대상 데이터

발현을 위해 S.cerevisiae Y2805(his-, ura-)를 사용하였다.

성능/효과

Secretion 형태로 발현된 발효기의 발효 베지를 chromatography로 정제한 결과 leptin 회수율은 약 80%이었다.
coli는 바람직하지 않다고 생각되어진다. 또한 Indianopolis의 Lilly Research Lab에서의 결과에 의하면 insect cell의 일종인 Spodoptera fmgiperda (Sf-9) cell을 recombinant ba c니ovir기s로 infection시켜 leptin을 생산한 결과 folding이 잘되고 unmodified 형태루 발현되어짐이 확인되었으나 발현량이 메우 낮은 수준임을 알 수 있었다. 따라서 이 연구과제에서는 효모를 이용한 leptin 1발힌 연구를 수행하였다.

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