Gyrodinium impudicum strain KG03의 세포외 다당류인 p-KG03은 황함유 다당류로 항바이러스 검색 결과, 조사대상 바이러스 중 특히 뇌심근 경색바이러스 (encephalomyocarditis virus; EMCV)에 항바이러스 활성을 가지는 것으로 조사되었다.
Gyrodinium impudicum strain KG03의 세포외 다당류인 p-KG03은 황함유 다당류로 항바이러스 검색 결과, 조사대상 바이러스 중 특히 뇌심근 경색바이러스 (encephalomyocarditis virus; EMCV)에 항바이러스 활성을 가지는 것으로 조사되었다.
The sulfated exopolysaccharide p-KG03, which is produced by the marine microalga Gyrodinium impudicum strain KG03, exhibited impressive antiviral activity in vitro ($EC_{50}$ = 26.9 g/ml) against the encephalomyocarditis virus (EMCV). Depending on the p-KG03 concentration, the development...
The sulfated exopolysaccharide p-KG03, which is produced by the marine microalga Gyrodinium impudicum strain KG03, exhibited impressive antiviral activity in vitro ($EC_{50}$ = 26.9 g/ml) against the encephalomyocarditis virus (EMCV). Depending on the p-KG03 concentration, the development of cytopathic effects in EMCV-infected HeLa cells was either inhibited completely or slowed. Moreover, p-KG03 did not show any cytotoxic effects on HeLa cells, even at concentrations up to 1,000 g/ml. The polysaccharide was purified by repeated precipitation in ethanol, followed by gel filtration. The p-KG03 polysaccharide had a molecular weight of $1.87\;{\times}\;10^6$, and was characterized as a homopolysaccharide of galactose with uronic acid (2.96%, w/w) and sulfate groups (10.32% w/w). The biological activities of p-KG03 suggest that sulfated metabolites from marine organisms are a rich source of antiviral agents. This is the first reported marine source of antiviral sulfated polysaccharides against EMCV. The p-KG03 polysaccharide may be useful for the development of marine bioactive exopolysaccharides for use in biotechnological and pharmaceutical products.
The sulfated exopolysaccharide p-KG03, which is produced by the marine microalga Gyrodinium impudicum strain KG03, exhibited impressive antiviral activity in vitro ($EC_{50}$ = 26.9 g/ml) against the encephalomyocarditis virus (EMCV). Depending on the p-KG03 concentration, the development of cytopathic effects in EMCV-infected HeLa cells was either inhibited completely or slowed. Moreover, p-KG03 did not show any cytotoxic effects on HeLa cells, even at concentrations up to 1,000 g/ml. The polysaccharide was purified by repeated precipitation in ethanol, followed by gel filtration. The p-KG03 polysaccharide had a molecular weight of $1.87\;{\times}\;10^6$, and was characterized as a homopolysaccharide of galactose with uronic acid (2.96%, w/w) and sulfate groups (10.32% w/w). The biological activities of p-KG03 suggest that sulfated metabolites from marine organisms are a rich source of antiviral agents. This is the first reported marine source of antiviral sulfated polysaccharides against EMCV. The p-KG03 polysaccharide may be useful for the development of marine bioactive exopolysaccharides for use in biotechnological and pharmaceutical products.
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문제 정의
, 1995). 따라서 본 연구는 순수분리한 q impudicum strain KG03이 생산하는 p-KG03의 항바이러스 효과를 조사하였다.
제안 방법
항바이러스효과는 ([A (agent/virus) - A (Virus control)] / A (Cell control) - A (Virus control) x 100 (%)으로 생존율이 100%이면 항바이러스 효과를 100%로 하고, 생존율이 0%이면 항바이러스 효과가 없는 것으로 하였다. Anti-HSV로부터 EC50과 세포독성 값으로부터 CC50을 구한 후 selectivity index (SI, CCWEC50)를 구하였다
Gyrodinium impudicum strain KG03의 세포외다당류인 p-KG03의 생산은 1/ ALBTPR 을 이용하여 최적배지인 M-KG03 액체배지 800 I此에 시료농도를 1 X 103 cells/疏의 농도로 접종한 후 22℃, 16L : 8 D로 CCh 1%, 50 cc/min, 150 llE/m2/s 광도로 유지하여 21일간 배양하였다.
즉, 96 well plate 에 Vero세포를 증식시킨 다음 DME 2% FBS 배양액으로 희석된 바이러스를 각 weU 에 접종량이 100 CCIDso (50% cell culture inhibitory dose)가 되도록 100 必!씩 접종하고 1시간동안 37℃에서 흡착시킨 후 배양액을 제거하였다. 각 농도로 희석된 약물을 duplicate로 각 well에 100 以씩 첨가하고 37℃, CO2 배양기에서 3일 배양한 다음, MTT 검색법으로 50%의 세포를 살아남도록 한 약물의 농도를 EC50 (50% effective concentration)로 결정하였다. Anti-RNA virus의 항바이러스 효과 조사는 성장이 멈춘 HeLa세포에 희석된 바이러스를 96-well plate의 well당 100 CCID50가 되도록 100 及씩 접종시키고 30분 동안 37℃, CO2 배양기에서 흡착시켰다.
MTT검색법으로 시료의 독성 및 약효를 평가하였다. 바이러스가 접종되지 않은 세포가 약물에 더해지는 mock-infected well의 살아남은 세포 수를 약물이 첨가되지 않은 cell control well 과 비교하여 50%의 세포를 죽도록 한 약물의 농도를 CC5o (50% cytotoxic concentration)으로 결정하여 약물의 독성을 조사하였다. 바이러스에 감염된 세포의 50%를 살아남도록 한 약물의 농도를 EC50 (50% effective concentration)으로 항바이러스 약효를 평가하였다.
바이러스가 접종되지 않은 세포가 약물에 더해지는 mock-infected well의 살아남은 세포 수를 약물이 첨가되지 않은 cell control well 과 비교하여 50%의 세포를 죽도록 한 약물의 농도를 CC5o (50% cytotoxic concentration)으로 결정하여 약물의 독성을 조사하였다. 바이러스에 감염된 세포의 50%를 살아남도록 한 약물의 농도를 EC50 (50% effective concentration)으로 항바이러스 약효를 평가하였다.
배양액에서 균체를 제거한 후 상등액을 2 배의 100% cold ethanol을 첨가하여 4笆에냉침하고, 이를 70% cold ethanol로 2회 세척한 후 다시 증류수에 녹인 후 4C에서 3 배의 3차 증류수를 연속적으로 첨가하여 연속 투석기(Pellicon 2, Millipore, USA)로 투석하고 2 배의 100% cold ethanol을 첨가하여 4℃에서 24시간 냉침하고 침전된 P-KG03을 회수하였다. 투석이 완료된 p-KG03은 동결, 건조하여 조다당으로 분리하였다.
바이러스 용액을 제거하고 HSV에서와 같이 약물을 100 成씩 duplicate로 첨가한 후 2일 동안 배양하였다. 배양액을 제거한 후 HSV와 같은 방법으로 MTT용액을 첨가하여 약효를 평가했다. Anti-HIV 의 항바이러스 효과 조사는 CPE 저해법을 이용하였다.
약물의 독성에 의한 영향을 알 수 있도록 3일 배양 후 MIT검색법으로 약물이 첨가된 각 mock-infected well의 살아남은 세포 수를 약물이 첨가되지 않은 세포 control well과 비교하여 50%의 세포를 죽도록 한 약물의 농도를 CC50 (50% cytotoxic concentration)으로 결정하였다. 세포독성 측정을 위한 mock-infected의 세포 생존율(% survival)은 |[A (agent) - A (Blank)] / [A (Cell control) - A (Blank)]) x 100 (%) 으로생존율이 100%이면 독성이 없는 것이고, 0%일 경우 독성이 가장 강하다.
투석이 완료된 p-KG03은 동결, 건조하여 조다당으로 분리하였다. 정제시료는 CTAB (cetyltrimethylammonium bromide)처리, 투석막(cut off 11,000 Da, Sigma, USA), 및 Sepadex G-200에 의한 gel chromatography를 이용하여 정제한 후 동결, 건조하여 얻은 p-KG03을 항바이러스 조사에 이용하였다.
Anti-HIV 의 항바이러스 효과 조사는 CPE 저해법을 이용하였다. 즉, MT-4 세포를 원심분리한 다음 상등액은 제거하고 세포침전물에 바이러스를 100 COD% 가 되도록 접종한 다음, RPMI 1640/10%를 첨가하여 세포를 lxl05 cells/畝이 되도록 희석하였다. 두 배 희석된 약물이 담겨져 있는 plate에 well당 100 成의 세포 희석액을 첨가하고, 37 ℃ CO2 배양기에서 5일 배양하였다.
대상 데이터
또한 사용세포는 Vero (African Green monkey kidney cell), HeLa (human cervical carcinoma cell) 및 MT-4 (HTLV-1 -infected human T lymphocyte) 이다. 각 시험에 사용한 표준 약물은 Anti-HSV는 Acyclovir (ACV), Cytosine P-D-arabinofuranoside (ArmC)이며, Anti-PC는 Ribavirin (Rⅳ) 이고 Anti-HIV는 Azidothymidine (AZT), 2', 3'-dideoxycytidine (ddC) 및 2', 3'-dideoxyinosine (ddl)이었다. P-KG03은 10-40 mg/砒로 100% DMSO에 녹이고, 20℃에 보존하다가 배양액에 시험농도의 1 배 또는 2 배로 희석하여 사용하였고, 96-well culture flask 내에 DMSO의 농도가 0.
Mock (Cytostatic effects)이다. 또한 사용세포는 Vero (African Green monkey kidney cell), HeLa (human cervical carcinoma cell) 및 MT-4 (HTLV-1 -infected human T lymphocyte) 이다. 각 시험에 사용한 표준 약물은 Anti-HSV는 Acyclovir (ACV), Cytosine P-D-arabinofuranoside (ArmC)이며, Anti-PC는 Ribavirin (Rⅳ) 이고 Anti-HIV는 Azidothymidine (AZT), 2', 3'-dideoxycytidine (ddC) 및 2', 3'-dideoxyinosine (ddl)이었다.
이론/모형
배양액을 제거한 후 HSV와 같은 방법으로 MTT용액을 첨가하여 약효를 평가했다. Anti-HIV 의 항바이러스 효과 조사는 CPE 저해법을 이용하였다. 즉, MT-4 세포를 원심분리한 다음 상등액은 제거하고 세포침전물에 바이러스를 100 COD% 가 되도록 접종한 다음, RPMI 1640/10%를 첨가하여 세포를 lxl05 cells/畝이 되도록 희석하였다.
5% 또는 1%가 넘지 않도록 하였다. Anti-HSV (Herpes simplex virus) 항바이러스 조사는 virus-induced cytopathic effect (CPE) 저해법을 이용하였다. 즉, 96 well plate 에 Vero세포를 증식시킨 다음 DME 2% FBS 배양액으로 희석된 바이러스를 각 weU 에 접종량이 100 CCIDso (50% cell culture inhibitory dose)가 되도록 100 必!씩 접종하고 1시간동안 37℃에서 흡착시킨 후 배양액을 제거하였다.
두 배 희석된 약물이 담겨져 있는 plate에 well당 100 成의 세포 희석액을 첨가하고, 37 ℃ CO2 배양기에서 5일 배양하였다. MTT검색법으로 시료의 독성 및 약효를 평가하였다. 바이러스가 접종되지 않은 세포가 약물에 더해지는 mock-infected well의 살아남은 세포 수를 약물이 첨가되지 않은 cell control well 과 비교하여 50%의 세포를 죽도록 한 약물의 농도를 CC5o (50% cytotoxic concentration)으로 결정하여 약물의 독성을 조사하였다.
성능/효과
pKG03의 Anti-PC에 대한 항바이러스 검색 결과, p-KG03은 EMCV, Cox. B3 및 VSV에 대하여 antivial activity (EC%)가 각각 26.9, 1,000, 1,000으로 항바이러스 효과가 대조약품인 Rib의 27.15, 236.35, 13.65에 대하여 EMCV의 경우에만 대조 약품과 유사한 antivial activity (EC50)의 항바이러스 효과가 있었다. 특히 p-KG03의 세포독성이 없는데, 비교하여 Rid의 세포독성이 > 300으로 p-KG03은 selectivity index가 > 37.
같다. P-KG03의 Anti-HSV에 대한 항바이러스 검색 결과, p-KG03은 HSV-1 및 HSV-2에 대하여 antivial activity (EC50)가 각각 159.85로 항바이러스 효과가 대조약품인 ACV 의 0.83, 2.39 및 Ara-C의 1.63, 2.97로 p-KG03은 selectivity index가 1이하로 대조 약품에 비교하여 우수하지 못한 것으로 조사되었으며, 세포독성은 159.85로 ACV의 10 및 Ara-C의 4.83 등의 대조약품에 비교하여 세포독성이 적은 것으로 조사되었다.
한 결과는 Table 2와 같다. p-KG03의 Anti-HIV에 대한 항바이러스 검색 결과, P-KG03 는 HIB 및 ROD 에 대하여 anti vial activity (EC50) 가 각각 540.14로 항바이러스효과가 대조약품인 Heparin의 0.86, > 1,000, PS의 0.85, 2.24, AZT-2의 0, 0.1, ddC의 0.06, 0.06 및 ddl의 2.1, 11.05로 p*G03은 selectivity index가 1이하로 대조약품에 비교하여 우수하지 못한 것으로 조사되었으며, 세포독성은 540.14로 ddC 및 AZT-2보다는 세포독성이 비교적 적은 것으로 조사되었다.
18로 대조약품보다 우수하였다. 따라서 j>KG03은 조사된 바이러스 중 EMCV에 대하여 항바이러스 효과가 있는 것으로 조사되었다.
세포독성 측정을 위한 mock-infected의 세포 생존율(% survival)은 |[A (agent) - A (Blank)] / [A (Cell control) - A (Blank)]) x 100 (%) 으로생존율이 100%이면 독성이 없는 것이고, 0%일 경우 독성이 가장 강하다. 항바이러스효과는 ([A (agent/virus) - A (Virus control)] / A (Cell control) - A (Virus control) x 100 (%)으로 생존율이 100%이면 항바이러스 효과를 100%로 하고, 생존율이 0%이면 항바이러스 효과가 없는 것으로 하였다. Anti-HSV로부터 EC50과 세포독성 값으로부터 CC50을 구한 후 selectivity index (SI, CCWEC50)를 구하였다
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