초록

부티르산이 동물세포 생장에 미치는 영향 및 생산성 증진의 연구
배양중 세포의 사멸(apoptosis) 및 사멸 억제물질의 스크리닝
환원물질(reducing agent)이 동물세포 생장에 미치는 영향 및 생산성 증신의 연구
스크리닝된 생산성 증진 물질의 배지내 농도 최적화
환원 물질에 의한 생산성 증진의 원인 규명
EPO 순수분리법 정착
HPLC를 이용한 당쇄구조의 결정
환원물질이 당쇄형성에 미치는 영향 연구

Abstract ▼

Enhancement of the production of recombinant EPO (Erythropoietin) was studied by using Chinese hamster ovary cell. Butyrate, which is known to alter the differentiation of mammalian cells were used to increase the recombinant protein. However, when butyrate was treated in rapidly growing cells, the

Enhancement of the production of recombinant EPO (Erythropoietin) was studied by using Chinese hamster ovary cell. Butyrate, which is known to alter the differentiation of mammalian cells were used to increase the recombinant protein. However, when butyrate was treated in rapidly growing cells, the death of the cells occurred. Intra-nucleosomal DNA fragmentation showed that the death was due to apoptosis. The induction of apoptotic death of the cells could be partially blocked by treatment with the well-known antioxidant, N-acetycysteine (NAC). Strikingly, the NAC treatment enhanced the production of recombinant EPO two-fold, compared with that of the culture without NAC supplementation. These results show that butyrate supplemented with NAC not only inhibited apoptosis, but also exerted a synergistic effect on the production of recombinant EPO. Considering its role as antioxidant, NAC was thought to scavenge Reactive oxygen species (ROS) that might act as signal to apoptosis. However, mechanism of production of enhancing effect is remained to be investigated.
In order to investigate the mechanism for enhancement of production by NAC, effect of thiol reducing agents that have similar effect to NAC, was studied. Mild reducing agents, Mercaptoethansulfonic acid (MESNA), Thiolactic acid (TLA), Thioglycolate (TG) were shown to block apoptosis and also increase the production of EPO. In order to find out whether the effect was general on CHO cells or not, other transformant cells (EC-2 2C5, EC-2 1H9) that produce different amount of EPO were tested. The production enhancing effect was approximately similar in all the cells. The secretion kinetic study using pulse-chase method revealed that all four thiol reducing agents significantly increased the secretion rate of EPO. It was deduced that the thiol reducing agents increased the secretion rate by altering environmental condition of endoplamic reticulum from the oxidative sate to the slightly reduced state ad facilitate the folding of the proteins.
The morphology of the cells was observed to be altered to irregular shape in presence of thiol reducing agent.
EPO molecule has a complex oligosaccharide structure that plays an important role in biological activity in vitro. To figure out whether thiol reducing agent influence on the glycosylation or not, structural analysis of oligosaccharide was carried out. Cells were cultured in the medium supplemented with 20mM of NAC and then the culture supernatant was withdrawn for purification of EPO. EPO was purified through the procedures employing heparin-sepharose affinity column, anion-exchange (MonoQ) column and gel permeation chromatography (Sephadex G-75) column. The purified EPO was treated with N-glycosidase F, for the isolation of oligosaccharide and the isolated oligosaccharides were labeled with fluorescent dye, 2-aminobezamide. Labeled oligosaccaride was analyzed wit anion-exchange chromatography (MonoQ) and normal-phase chromatography (amide column, Glycosep-N) for the assignment of GU (glucose unit) value. Through the assignment of molecular mass using MALDI-TOF mass spectrometry, final structures of the oligosaccharide were analyzed. As the result, the relative amount of sialylated oligosaccharide in NAC-treated EPO was lower than in EPO obtained from the sample without NAC treatment. This implies that the sialyltransferase activity may not fully support the increased secretion rate of EPO in NAC-treated cells.

목차 Contents

• 제 1 장 서론...19
• 1절 연구개발의 필요성...19
• 1. 연구개발의 경제·사회·기술적 필요성...19
• 가. 기술적 측면...19
• 나. 경제·산업적 측면...20
• 다. 사회·문화적 측면...21
• 2. 지금까지의 연구개발 실적...22
• 가. 국외의 경우...22
• 나. 국내의 현황...22
• 3. 현기술상태의 취약성...23
• 4. 앞으로의 전망...24
• 5. 기술 도입...25
• 2절 연구개발 목표...25
• 제 2 장 국내의 기술개발 현황...26
• 1절 연구사례의 조사...26
• 1. 외국의 경우...26
• 2. 국내의 경우...27
• 3. 조사연구개발사례에 대한 평가...28
• 2절 세부기술사항의 검토분석...29
• 1. 국내외 기술수준 비교...29
• 2. 공정단위별로 주요 기술사항 및 그 기술수준의 분석평가...29
• 3. 기준공정방법, 기술의 사례...30
• 4. 주요관련기술의 검토...30
• 3절 특허 및 기술도입과의 중복여부에 대한 검토, 분석...31
• 1. 관련기술의 특허내용과 차이점 비교...31
• 2. 관련기술도입 내용과 차이점 비교...31
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과...32
• 1절 이론적, 실험적 접근방법...32
• 1. 재조합 CHO세포 배양 및 EPO의 생산 증진 연구...32
• 가. 연구의 방향...32
• 나. 연구개발목표를 향한 접근방법 및 최근 결과...32
• 다. 기술정보수집 및 전문가 확보를 통한 문제점해결...34
• 2. EPO의 당쇄구조 분석연구...34
• 가. 연구의 배경...34
• 나. 연구의 방향...35
• 다. 연구개발목표를 향한 접근방법 및 문제점...36
• 라. 기술정보수집 및 전문가 확보를 통한 문제점 해결...37
• 2절 연구개발 추진체계...38
• 3절 연구내용 및 결과...39
• 1. 총론...39
• 가. 재조합 Erythropoietin(EPO)...39
• (1) 분자적 특성과 기능...39
• (2) EPO의 치료적인 이용...40
• 나. 재조합 당단백질의 생산 증가...41
• (1) 부티르산(Sodium butyrate)이 동물세포에 미치는 효과...41
• (2) 부티르산이 유발하는 예정사(Apoptosis)의 특징과 그 억제제...41
• (3) N-acetylcystiene과 그 외 다른 환원제...42
• 다. 환원제가 EPO의 당쇄구조에 미치는 효과...43
• (1) EPO의 당기질...43
• (2) 당쇄구조에 영향을 미치는 배양조건...43
• 2. Apoptotic Chinese Hamster Ovary 세포에서 재조합 EPO의 생합성에 N-Acetylcystiene이 미치는 효과...44
• 가. 서론...44
• 나. 재료 및 방법...45
• (1) 시약 및 배지...45
• (2) 세포주 및 배양조건...45
• (3) 세포수 계산...45
• (4) Apoptosis 여부 평가...45
• (5) 절편화된 DNA의 정량...46
• (6) EPO 분석...46
• 다. 결과...46
• (1) Apoptosis 여부 평가...46
• (2) apoptosis의 진행...47
• (3) 세포의 예정사(Apoptosis Death)에 NAC가 미치는 효과...47
• (4) 재조합 EPO의 생합성에 NAC가 미치는 효과...47
• 라. 고찰...53
• 3. 황환원제에 의한 재조합 EPO의 분비속도 증가...54
• 가. 서론...54
• 나. 재료 및 방법...55
• (1) 시약 및 배지...55
• (2) 세포주 및 배양조건...56
• (3) 대사 표지on)...56
• (5) SDS-polyacrylamide Gel Electrophoresis...57
• 다. 연구결과...57
• (1) 배지에 첨가된 항환원제에 의한 EPO의 생산 증가...57
• (2) 환원제를 다양한 농도로 처리했을 때의 EPO 생산...61
• (3) 황환원제에 의한 EPO의 분비증가...61
• 라. 고찰...66
• 4. 황환원제인 N-acetylcysteine이 재조합 EPO의 당쇄구조에 미치는 효과...69
• 가. 서론...69
• 나. 재료 및 방법...70
• (1) 재료...70
• (2) 배양조건 및 배양액...70
• (3) 재조합 EPO의 분리정제...70
• (4) 재조합 EPO의 N-linked 당쇄 준비...71
• (5) 2-Aminobenzamide(2-AB) 표지...71
• (6) HPLC를 이용한 당쇄구조분석...71
• (7) MALDI-TOF-MS 분석...72
• 다. 결과...72
• (1) 상업적으로 판매되는 standard EPO (Recormon)의 당분리...72
• (2) 2-Aminobenzamide 표지와 MonoQ 크로마토그래피(chromatography)...75
• (3) GU값 결정 및 MALDI-TOF...75
• (4) 재조합 EPO의 분리정제...84
• (5) 배양중에 NAC 첨가여부에 따른 EPO의 당쇄구조 비교 연구...84
• 라. 고찰...92
• 5. 결론...93
• 제 4 장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도...94
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획...95
• 제 6 장 참고문헌...96