초록 ▼

아데노 부속 바이러스(AAV)의 전사조절기전과 발암억제기능을 규명하기 위하여 AAV의 P4O promoter에 결합하는 전사조절인자를 탐색하였고 AAV Rep단백질과 상호작용하는 세포인자를 검색하였다. AAV의 P5, Pl9, P40 promoter에서의 전사는 AAV Rep gene과 아데노 바이러스 특히 아데노 바이러스의 EIA에 의해 조절 받는다. Rep gene과 EIA의 전사조절기능을 알아보기 위하여 AAV P40 promoter를 모델체계로 하였다. 아데노 바이러스와 AAV로 감염시킨 헬라세포의 단백질 추출물에서 P40

아데노 부속 바이러스(AAV)의 전사조절기전과 발암억제기능을 규명하기 위하여 AAV의 P4O promoter에 결합하는 전사조절인자를 탐색하였고 AAV Rep단백질과 상호작용하는 세포인자를 검색하였다. AAV의 P5, Pl9, P40 promoter에서의 전사는 AAV Rep gene과 아데노 바이러스 특히 아데노 바이러스의 EIA에 의해 조절 받는다. Rep gene과 EIA의 전사조절기능을 알아보기 위하여 AAV P40 promoter를 모델체계로 하였다. 아데노 바이러스와 AAV로 감염시킨 헬라세포의 단백질 추출물에서 P40 promoter에 특이적으로 결합하는 인자를 확인하였다. 이 전사조절인자는 P5 promoter에도 결합함을 확인 하였다. 이 전사조절인자의 핵산결합부위를 검정한 결과 major late transcription factor (MLTF)가 결합하는 부위로 밝혀 졌다. P40 promoter에서 MLTF의 기능을 알아보기 위하여 MLTF가 잘 결합하지 않도록 사종의 single point 변이주를 제조하였다. 이 mutant 클론들을 헬라세포에 도입하여 생성되는 P40 mRNA양을 서로 비교하므로서 P40 promoter에서의 MLTF의 기능을 확실히 할 수 있을 것이다. AAV의 Rep gene은 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40 단백질의 유전정보를 갖고 있다. Rep78단백질은 DNA에 결합하는 단백질로서 hairpin구조의 AAV terminal repeats에 결합하나 AAV promoter에는 결합하지 않는다. Rep 단백질의 전사조절작용 및 발암억제기능은 세포전사조절인자 또는 세포내 이차전령을 통하여 나타날수 있으므로 Rep단백질과 상호작용하는 세포단백질들을 검색 하였다. Glutathione-agarose에 결합할 수 있는 glutathione S-transferase(GT) leader sequence를 이용하여 사종의 GT-Rep fusion단백질을 대장균에서 분리 정제 하였다. 사종의 GT-Rep fusion 단백질을 결합시킨 glutathione-agarose에 방사선 동위원소로 표시한 헬라세포주의 단백질추출액을 가하여 반응시켰을때 수종의 세포단백질이 GT-Rep단백질에 결합함을 확인할 수 있었다. 이 단백질들의 특성 규명은 Rep 단백질의 발암억제기능을 이해하는데 기여할 수 있을 것이다.

Abstract ▼

Adeno-associated virus(AAV) encodes Rep gene which plays a role in AAV DNA replication, transcription, and oncosuppression. To know transcritional control mechanism and oncosuppression activity of AAV, we tried to look for transcription factor(s) which can bind to the AAV p40 promoter as a model sys

Adeno-associated virus(AAV) encodes Rep gene which plays a role in AAV DNA replication, transcription, and oncosuppression. To know transcritional control mechanism and oncosuppression activity of AAV, we tried to look for transcription factor(s) which can bind to the AAV p40 promoter as a model system and cellular proteins which can interact with Rep proteins. The Rep gene and adenovirus, above all, EIA of adenovirus, are required to control p5, p19, and p40 promoter of AAV. We found a cellular factor which specifically bound to the p40 promoter region from protein extract prepared from HeLa cells coinfected with adenovirus and AAV. This factor also bound to the p5 promoter region. DNase 1 footprinting method was used to determine the transcription factor-binding site. The DNA sequence of this factor binding-site was 5'-AGGATCACGTGGTTGAGG-3' in the p40 promoter and 5'-AGAGGTCACGTGAGTGTTT-3' in the p5 pormoter. This factor-binding site in the p5 promoter was known as major late transcription factor(MLTF)-binding site. We concluded that the cellular factor bound to the p40 promoter was MLTF. To know the role of MLTF in the p40 promoter, we constructed four different kinds of clones which have single point mutation in the core element of MLTF binding-site of p40 promoter. In gel retardation assay, MLTF did not bind well to the mutated sequence of p40 promoter. The function of MLTF in the p40 promoter can be answered by comparing mRNA level of these mutants in tissue culture in the presence or absence of the Rep gene and/or adenovirus or EIA. The Rep gene encodes four different kinds of Rep proteins, Rep 78, Rep68, Rep52, and Rep40. Rep78 and Rep68 bind to the hairpinned terminal repeats of AAV, but not to any known promoters. Rep78 which is known to have oncosuppression activity may function through protein-protein interaction. To find cellular protein(s) which interact(s) with Rep78, Rep52, and Rep40. We used glutathione S-transferase(GT) leader sequence which can bind to glutathione-agarose. Four different kinds of pGT-Rep fusion clones such as pGT-Rep78, pGT-Rep78 (dl:1-102), pGT-Rep52, and pGT-Rep40 were constructed and transformed into E. coli. Each transformant produced GT-Rep fusion proteins by IPTG induction, which was then purified by glutathione-agarose. When protein extracts obtained from 293 cells labeled with radioactive methionine passed through each glutathione-agarose loaded with GT-Rep78, GT-Rep78 (dl:1-102), GT-Rep52, and GT-Rep40, a few cellular proteins bound to the GT-Rep fusion proteins. These cellular proteins may well be secondary messenger(s) of the transcriptional control and oncosuppression activity of Rep protein.

목차 Contents

• 1. 서론...11
• 2. 실험재료 및 방법...15
• 3. 실험결과...21
• 4. 고찰...30
• 5. 참고문헌...37