초록 ▼

암환자의 20-30%에서 Ras 암유전자의 변이가 발견되기 때문에 oncogenic Ras에 의한 암의 치료제 개발은 중요하다. 본 연구과제에서는 Ras 암유전자로 인한 암의 유전자 치료법의 개발을 목표로 하고 있다. 이를 위해 이 비정상적인 신호전달요인을 차단할 수 있는 여러 새로운 방법을 확립하였다.
Ras 암유전자의 활성 억제를 위해 oncogenic Ras 유전자를 확보하여 이의 다양한 발현 system 및 활성검색을 위한 system을 만들어 DNA합성유도능을 조사하였다. 이들을 transient transfect

암환자의 20-30%에서 Ras 암유전자의 변이가 발견되기 때문에 oncogenic Ras에 의한 암의 치료제 개발은 중요하다. 본 연구과제에서는 Ras 암유전자로 인한 암의 유전자 치료법의 개발을 목표로 하고 있다. 이를 위해 이 비정상적인 신호전달요인을 차단할 수 있는 여러 새로운 방법을 확립하였다.
Ras 암유전자의 활성 억제를 위해 oncogenic Ras 유전자를 확보하여 이의 다양한 발현 system 및 활성검색을 위한 system을 만들어 DNA합성유도능을 조사하였다. 이들을 transient transfection이나 single cell microinjection시 발현시킨 세포에서 DNA 합성을 유도하였다. 그러나 세포 기원에 따라 DNA합성을 유도하는 능력이 H-Ras, N-Ras, K-Ras간에 상이하였다. 즉 fibroblast에서는 그 능력은 H〉N〉K순이었고, CV-1과 같은 epithelial 세포주의 경우 N-ras가 가장 강함을 알 수 있었다. Ras의 downstream effector로 알려진 Racl 단백질을 GST-fusion시켜 단백질을 제조하여 oncogenic Ras와 함께 injection시 DNA합성을 억제하였다. 그러나 wlid-type의 Ras와 coinjection시에는 흥미롭게도 억제능이 없었다. 즉 dominant-negative Rac1N17이 oncogenic Ras만 선택적으로 그 효능을 억제함을 알 수 있었다. 또한 정상적인 ras는 MAP kinase 경로를 의존하는 반면, oncogenic ras의 경우는 MAP kinase 비 의존적이며 racl 의존적인 것을 발견하였다. Antisense RNA를 제조하여 DNA와 같이 injection한 결과 제조부위와 방법에 따라 DNA합성 억제능이 다름을 알 수 있었다. 또한 이들은 isoform-specific하게 억제하였다. Anti-sense 유전자를 liposome계열의 chemical gene transfer system을 사용하여 주입하면 세포 중식속도가 억제되고 세포 형태로 정상으로 환원됨을 알 수 있었다. 또한 Rac cascade의 downstream mediators들을 규명하는 연구를 통해 phospholipase A2 (PLA2)가 이러한 신호계의 중요한 중간 물질로 작용하는 결과들을 얻었다.

Abstract ▼

Mutation of Ras oncogene has been found in 20-30% of cancer patients. Therefore, it is important to develop therapy targeting Ras activity. In this project, our purpose is to fine proper Ras oncogene therapy. For this, we try to establish various methods to inhibit the abnormal signaling factors.

Mutation of Ras oncogene has been found in 20-30% of cancer patients. Therefore, it is important to develop therapy targeting Ras activity. In this project, our purpose is to fine proper Ras oncogene therapy. For this, we try to establish various methods to inhibit the abnormal signaling factors.
First, we obtained various oncogenic Ras isoform mutants and made construct expression systems such as GST fusion proteins. Also, we established the optimal methods for examing DNA synhesis induced by oncogenic Ras isoform. When these mutants are transiently transfected or microinjected, DNA synthesis was induced. Interestingly oncogenic H-Ras, K-Ras or N-Ras differentially induced DNA synthesis depending on cell origin. In fibroblasts, order of the potency was H〉N〉K, while in epithelial CV-1 the order was M〉H〉K. Racl protein was known to locate downstream of Ras. When co-injected with oncogenic Ras, it suppressed Ras-induced DNA synthesis. But when co-injected with oncogenic Ras, it suppressed Ras-induced DNA synthesis. But when co-injected with wild type normal Ras, it did not inhibit. Therefore, Racl selectively inhibitd oncogenic Ras-induced DNA synthesis. Also DNA synthesis induced by normal Ras was MAP kinase-dependent, but that induced by onocogenic Ras was MAP kinase-independendent and Racl-dependent. Next, various anti-sense DNAs of Ras were constructed and co-injected with oncogenic H/K/N-ras plasmid. The co-injected anti-sense ras inhibited DNA synthesis in isoform specific manner. Also when co-transfected into oncogenic Ras cell lines, the proliferation of the cells was slow-down and cell morphology was reverted back to normal. Also after searching the downstream functional effectors of Racl, we identifed PLA2 as regulator of Ras oncogenicity and Racl downstream signaling molecules.

목차 Contents

• 총괄연구개발과제 연구결과...6
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...6
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...8
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...10
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...10
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획...13
• 6. 첨부서류...13
• 제1세부연구개발과제 연구결과...41
• 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...42
• 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...42
• 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...47
• 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...60
• 5. 제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...62
• 6. 제1세부연구개발과제의 활용계획...64
• 7. 참고문헌...64
• 제2세부연구개발과제 연구결과...66
• 1. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...67
• 2. 제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...67
• 3. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...68
• 4. 제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...74
• 5. 제2세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...75
• 6. 제2세부연구개발과제의 활용계획...76
• 7. 참고문헌...76