초록 ▼

지방산 합성에 관여하는 효소인 acetyl-CoA carboxylase 및 ATP-citrate lyase의 조절 기전을 SREBP 및 새로운 결합단백질의 규명을 중점으로 연구하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. DNaseI footprint assay와 electrophoretic mobility shift assay 실험을 통하여 ACL promoter 상에서 SREBP의 결합부위를 관찰하였다. 그 결과 region A, B, C 세부위임을 확인할 수 있었다. 이들 부위의 기능적인 중요성을 관찰하기 위하여 A.

지방산 합성에 관여하는 효소인 acetyl-CoA carboxylase 및 ATP-citrate lyase의 조절 기전을 SREBP 및 새로운 결합단백질의 규명을 중점으로 연구하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. DNaseI footprint assay와 electrophoretic mobility shift assay 실험을 통하여 ACL promoter 상에서 SREBP의 결합부위를 관찰하였다. 그 결과 region A, B, C 세부위임을 확인할 수 있었다. 이들 부위의 기능적인 중요성을 관찰하기 위하여 A. B, C 부위와 NF-Y binding 부위에 각각의의 mutation을 가진 construct를 제조하여 SREBP responsiveness를 측정한 결과 region B 와 C 그리고 NF-Y binding site가 중요한 역할을 하였으며 SREBP1a에 의한 ATP-citrate lyase protmoter의 induction에 NF-Y의 역할이 중요함을 확인하였다.
2. 기존의 보고와는 달리 SREBP와 CBP간의 protein-protein interaction은 나타나지 않는 결과를 얻었다. 이는 기존의 보고된 결과와 상이한 결과로서 현재 이를 확인하는 실험을 진행중에 있다.
3. SREBP1과 SREBP2의 각기 두가지 dominant negative form을 제조하여 실험하였다. 즉 activation domain을 제거한 SREBP1Δ(1-70)과 SREBP2Δ(1-70)을 제조하였으며 DNA binding domain의 263Y/A mutation으로 mSREBP1을 제조하여 이들의 dominant negative action을 cell culture system에서 성능 확인하였다.
4. SREBP1과 SREBP2는 각각 표적으로 하는 대상 유전자가 다르다는 사실에 근거하여 이러한 차이가 activation domain에서 유래되는 것인지 혹은 DNA binding domain의 binding preference의 차이인지를 알고자 실험을 진행하였다. 그 결과 activation domain의 차이에서 유래되지 않음을 증명하였다.
5. 실험동물에 dominant negative SREBP들의 작용을 알기 위하여서는 이들을 간장에서 발현시켜야 한다. 동물 실험을 하기전 예비 실험으로서 치료유전자를 insulin으로 하여 당뇨쥐를 치료하는데 성공하였으며 이를 바탕으로 SREBP dominant negative를 치료유전자로 사용하려 시도하였다. 그러나 유전자 전달단계 및 발현단계에서 문제점을 극복하지 못하여 현재까지 문제해결에 노력하는 중이다,
6. ACC-α의 N-terminus 부위를 overexpression 시킨 결과 H9c2 myotube에서 지방산 합성이 약 60%증가하는 반면 ACC-β의 N-terminus 부위를 overexpression 시킨 경우 지방산산화의 비율이 약 50% 증가하는 사실을 관찰하였다. 이 사실은 ACC-α는 선택적으로 지방산 합성을 조절하여 ACC-β는 지방산 산화를 조절한다는 사실을 보여 주며 이러한 선택적인 기능에는 ACC N-terminus 부위가 중요한 역할을 할 것으로 보여진다.
7.ACC 이성질체의 N-terminus 부위를 발현하는 세포의 ACC 활성도나 ACC 단백질의 양에는 특별한 차이가 없었다, 지방산 합성이나 산화비율이 차이를 보여주고 있음에도 불구하고 ACC의 활성도에는 차이가 없다는 사실은 ACC-N terminus 부위가 protein-protein interaction과 같은 reversible interaction에 의해 조절될 가능성을 보여준다.
8.ACC N-terminus와 결합하는 단백질을 찾기 위해 약 3x10? 개의 colony를 screen하였으며 약 40개의 clone을 선택하여 DNA 염기 서열을 분석하였다.
9. Unknown gene 1을 pcDNA eukaryotic expression vector에 subcloning 한 후 H9c2 cell에 서 stable cell line을 구축한 후 지방산 대사의 변화를 측정한 결과 지방산 합성의 비율이 약 40% 이상 증가하며 지방산 산화의 비율은 거의 변함이 없음을 관찰하였다. 이결과 이 유전자는 지방산 대사를 조절할 수 있는 새로운 단백질을 coding 하고 있음을 규명하였다.
10. SREBP1a의 아미노산 서열중 1에서 70까지의 부위 및 70부터 490까지의 부위에 해당하는 cDNA를 pAS2-1 vector의 multiple cloning site에 삽입하여 pAS-70 및 pAS+70 bait plsmid를 합성하였다. 각각의 bait plasmid 가 transformation된 CG-1945 세포에 다시 사람의 간장 cDNA를 함유하는 GAL4 two-hybrid library를 trnsformation 시킨 후 -His/-Leu/-Try 배지에서 배양하여 형성되는 colony를 선택하였다. Library를 screen한 결과 약 200여개의 SREBP와 결합할 것으로 추정되는 cDNA를 함유한 clone을 얻었으며 현재까지 새로운 전사인자는 밝혀지지 않은 상태이나 p/CAF등 기조의 보고된 cofactor의 clone이 분리되어 있는 상태로 계속적인 screen 및 선별을 진행하고 있다.
11. 연구과정에서 REBP가 CMV promoter를 강력하게 억제한다는 사실을 관찰하였다.
12. Adipocyte 로의 differentiation 과정중에 발현되는 전사인자 중 SREBP에 의하여 발현에 영향을 받을 것으로 추정되고 있는 PPARγ와 heterodimer를 이루어 작용을 나타내는 retinoic acid receptor (RXR) α의 ligand 인 9-cis-retinoic acid를 배양된 3Te-L1 preadipocyte에 처리한 결과 ACL promoter 부위중 -252까지의 부위에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 밝혔다

Abstract ▼

In this study we studied the mechanism of expression mechanism of lipogenic acetyl-CoA carboxylase and ATP-citrate lyase with the focus on SREBP and the protein interacting with it. The findings are as follows ;

1. By DNaseI footprint assay and gel mobility shift assay we identified the thre

In this study we studied the mechanism of expression mechanism of lipogenic acetyl-CoA carboxylase and ATP-citrate lyase with the focus on SREBP and the protein interacting with it. The findings are as follows ;

1. By DNaseI footprint assay and gel mobility shift assay we identified the three exact location for SREBP binding to ACL promoter denoted by region A, B, and C By mutational analysis of region A, B, C and the binding site for NF-Y disclosed the importance of these sites in ACL promoter activity.
2. On the basis of previous reports we tried to demonstrate the interaction of CBP with SREBP without success. These different results should be more studied for fine discriminations.
3. Dominant negative forms for SREBP1 and SREBP2 were constructed i.e SREBP1Δ(1-70) and SREBP2Δ(1-70) by removing the activation domain mSREBP1 by 263Y/A mutation on DNA binding domain. The function of these negative dominant forms were assayed in cell culture systems
4. We demonstrated that the difference in the each target of SREBP1 and SREBP2 is not resulted from the difference in its activation domain but from the difference in its DNA-binding domains.
5. For verification of the function on dominant negative SREBP in vivo such as rats it is necessary that these forms of SREBP were transferred to living animal. As a preliminary study we constructed the insulin producing plasmid connected to liver-type pyruvate kinase (LPK) promoter to be injected to diabetic rats induced by streptozotocin. The transduced plasmid has worked to modulate the blood glucose level consistently to maintain normal concentration depending on the changes of blood glucose level. We are now trying to develop to increase the efficiency of gen transfer and expression of this gene transfer technique.
6. Over expression of N-terminal region of ACC-α in H9c2 myotube led to 60% increase in fatty acid biosynthesis whereas expression of counter part of ACC-β resulted in 50% increase in oxidation. These data represent the fact that ACC-α regulates the processes of fatty acid synthesis while ACC-β regulates the processes of fatty acid oxidation. These selectivity of function could be postulated to depend on the importance of N-terminal region of ACCs.
7. Expression of the different isoforms of N-terminus did not resulted in difference in activity and the amount of ACC in cells. It is supposed that N-terminal region of ACC might participate in protein-protein interaction with reversible manner because the discrepancy of metabolic changes with enzyme amount or activity.
8. For cloning of proteins binding to ACC N-terminus 3 x 10? colonies were screen with 40 primary positive clones The sequence of these clones were determined.
9. One clone identifed as unknown gene was subcloned into pcDNA3 eukaryotic expression vector and stably transfected into H9c2 cells. It is demonsrated that fatty acid biosynthesis increased over 40% but the rate of fatty acid oxidation did no changed in these cells. The results suggest that these unknown gene could regulate the metabolism of fatty acid with novel mechanism.
10. For identification of novel proteins interacting with SREBP pAS-70 and pAS+70 bait plasmid were constructed by inserting the cDNA encoding the region from amino acid 1 to 70 and 70 to 490 respectively of SREBP1a into pAS2-1 vector. The GAL4 two-hybrid library were transformed into CG-1945 cells which were transformed with the corresponding bait plasmid. These constructs were grown on the media without His/Leu/Try and surviving colonies were selected and the DNA sequences were determined. About 200 clones were initially identified and the DNA sequence analysis is on going.
11. We demonstrated that SREBP strongly suppress the CMV promoter.
12. We demonstrated that PPARγmodulate the ACL promoter activity with the hope that-252 region of ACL might be involved in the action of Troglitazone a new therapeutic chemical for non-insulin dependent diabete melitus.

목차 Contents

• 총괄연구개발과제 연구결과...9
• 1.총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...9
• 2.총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...12
• 3.총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...16
• 4.총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...17
• 5.총괄연구개발과제의 활용계획...20
• 6.첨부서류...20
• 제1세부연구개발과제 연구결과...39
• 1.제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...40
• 2.제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...40
• 3.제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...42
• 4.제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...48
• 5.제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...49
• 6.제1세부연구개발과제의 활용계획...50
• 7.참고문헌...51
• 제2세부연구개발과제 연구결과...53
• 1.제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...54
• 2.제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...54
• 3.제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...55
• 4.제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...59
• 5.제2세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...60
• 6.제2세부연구개발과제의 활용계획...61
• 7.참고문헌...61
• 제3세부연구개발과제 계획...62
• 1.제3세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...63
• 2.제3세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...63
• 3.제3세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...64
• 4.제3세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...68
• 5.제3세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...69
• 6.제3세부연구개발과제의 활용계획...70
• 7.참고문헌...70