초록 ▼

연구 목적
1. 항암활성을 갖는 구조가 간단한 benzimidazole유도체의 합성 및 topoisomerase Ⅰ 효소 저해 활성에 대한 구조활성관계 연구.
2. Benzimidazole유도체들의 tepoisomerase Ⅰ 저해 활성외의 기전 연구 (NFκ-β활성등 검색)
3. Benzimidazole 유도체들의 물리화학적인 성질과 세포독성 및 효소활성간의 정량적 구조 활성관계(QSAR) 연구로 보다 효과적인 항암제의 개발.
연구개발내용 및 방법
1. Benzimidazole유도체의 합성: Topoi

연구 목적
1. 항암활성을 갖는 구조가 간단한 benzimidazole유도체의 합성 및 topoisomerase Ⅰ 효소 저해 활성에 대한 구조활성관계 연구.
2. Benzimidazole유도체들의 tepoisomerase Ⅰ 저해 활성외의 기전 연구 (NFκ-β활성등 검색)
3. Benzimidazole 유도체들의 물리화학적인 성질과 세포독성 및 효소활성간의 정량적 구조 활성관계(QSAR) 연구로 보다 효과적인 항암제의 개발.
연구개발내용 및 방법
1. Benzimidazole유도체의 합성: Topoiosmerase Ⅰ에 강력한 저해 활성 및 세포독성을 나타낸 terbentimidazole들의 중간물질인 benzimidazole들, 그리고 유사한 benzimidazole 유도체들을 phenylene diamine과 benzaldehyde의 coupling 반응으로 합성. 구조는 NMR, Mass, IR등의 분광학적인 방법으로 확인하며 known compound 인 경우는 문헌의 melting point를 참고하여 확인함.
2. Benzimidazole들의 RPMI 8402 cell에서의 세포 독성 측정: Topoisomerase Ⅰ 억제 활성과 가장 좋은 상관관계를 보이는 것으로 알려진 RPMI 8402 세포를 이용하여 MTT assay를 실시하여 $IC_{50}$ 값을 구함.
3. Topoisomerase Ⅰ 억제 활성 측정: E.coli에서 expressed 된 human topoisomerase Ⅰ을 이용한 topoisomerase Ⅰ mediated DNA cleavage assay실시. Camptothecin 및 Hoechst 33342를 positive control로 하여 상대적 활성 관찰.
4. Topoisomerase Ⅰ 저해 활성외의 생리활성 측정:
1) 4가지의 암 세포에 대한 항암활성을 growth inhibition 값 ($GI_{50}$)으로 측정.
2) NFκ-β활성 검색
3) tyrosinase 억제 활성 검색
5. 구조활성관계 연구:
1) 물리화학적 parameter (Hansch coefficient)들 선정: Craig Plot 참고
2) HPLC를 이용한 capacity factor로 lipophilicity 측정
3) 정량적인 상관관계식 및 상관계수 구함
연구결과
1) Terbenzimidazole들의 항암활성 및 탁월한 topoisomerase Ⅰ 저해 활성은 이미 밝혀져있음. 이들의 중간물질로 합성되었던 비교적 간단하면서도 rigid한 구조의 benzimidazole 유도체들의 항암 기전 중 topoisomerase Ⅰ 저해 활성이 terbenzimidazole과는 다른 망상을 보이므로 구조적인 상관관계를 밝힘으로 terbenzimidazole과는 다른 class의 항암제를 개발할 수 있을 것으로 생각됨. Terbenzimidazole과는 달리 5위치와 2위치의 치환기 조건이 매우 rigid하여 작은 변화에도 예민하게 활성의 차이를 보임. 특히 5위치의 경우는 electronic 또는 lipophilic 인자보다는 H-결합 능력이 활성 유지에 중요하며 2위치의 경우 aromatic ring의 존재가 활성에 필수적임을 알 수 있었음. 이것은 phenyl ring 대신 propyl group을 치환하여 확인하였음.
2) RPMI 8402 cell 에서의 항암활성은 topoisomerase Ⅰ의 구조적인 조건과는 다른 양상을 보였으며, 5위치든 2위치든 lipophilic한 moiety가 존재할 때 유지됨을 알 수 있었음. 암세포에서의 항암활성은 2위치의 phenyl ring의 para 위치에 치환기가 있을 때 좋은 편이었으며 정확한 구조 상관관계를 규명하기는 어려됐으나, Cl 유도체가 가장 좋은 활성을 보였음. 5위치의 치환기에 대한 구조활성관계를 4가지의 암 세포에 대한 성장억제 활성으로 살펴본 경우는 CH₃또는 CF₃가 치환된 경우 특정 암세포에 대한 선며 tyrosinase 활성도 보기 힘들었음. Topoisomerase Ⅰ 저해 활성을 보이지 않으며 항암활성을 보이는 benzimidazole의 경우는 앞으로 명확한 기전을 밝힐 필요가 있음.
3) 합성방법은 기존의 합성 방법 외에 Sm 또는 SnCl₂를 이용한 환원방법을 적용시켜 효율적으로 phenylenediamine 전구물질들을 얻을 수 있었음. 상대적인 지용성 인자는 capacity factor log k′로 구할 수 있었으며 Hansch의 π 값과 좋은 상관관계를 보였음.
결론
항암활성이 있는 benzimidazole 유도체들의 정확한 기전은 밝혀지지 않았으나 구조활성관계 연구를 통해 상당히 rigid한 요건을 충족해야한다는 사실을 알 수 있었음. 본 연구에서는 선택적인 활성을 갖는 5-methyl 및 5-trifluorornethyl 유도체들을 얻었다는데 의의를 둘 수 있으며, 앞으로는 이두 화합물의 화학적 물리적 성질을 좀 더 상세하게 분석하여 효율적인 항암제로의 개발을 고려할 것임. 이들 구조가 간단한 후보 물질들은 항암제의 장기 사용으로 인한 내성의 문제를 해결할 수 있는 새로운 계열의 항암제로 개발될 수 있으므로 항암 병용 요법에 활용가능하며 비교적 간단한 구조를 가진 물질이므로 대량 생산이 용이할 것으로 생각됨.

Abstract ▼

Aim of Project
1. To synthesize simple structured-benzimidazoles which possess antitumor activity and to evaluate their structure-activity relationships as topoisomerase Ⅰ poisons.
2. Evaluation of possible mechanisms other than topoisomerase Ⅰ inhibition of benzimidazole derivatives (eg- NFκ-

Aim of Project
1. To synthesize simple structured-benzimidazoles which possess antitumor activity and to evaluate their structure-activity relationships as topoisomerase Ⅰ poisons.
2. Evaluation of possible mechanisms other than topoisomerase Ⅰ inhibition of benzimidazole derivatives (eg- NFκ-β activity).
3. Examination of physicochemical properties of the benzimidazole derivatives and QSAR study as cytotoxic or enzyme inhibiting compounds in order to develop more effective antitumor agents.
Details and Methods of Project
1. Synthesis of benzimidazole derivatives: Benzimidazoles which have been prepared as intermediates for the potent topoisomerase I poisons, terbenzimidazoles, and related benzimidazole derivatives have been synthesized by coupling the respective phenylene diamines and benzaldehydes. Structures of novel analogues have been identified by NMR, Mass, and IR analysis while known compounds by comparing the melting points with those reported in literature.
2. Cytotoxicity of benzimidazoles in RPMI 8402 cells: MTT assay using RPMI 8402 cells, which are known to show the best correlation with topoisomerase Ⅰ inhibition activity, was performed to determine the $IC_{50}$ values of the analogues.
3. Topoisomerase I inhibition assay: Human topoisomerase Ⅰ expressed in E.coli was used for the topoisomerase Ⅰ mediated DNA cleavage assay. Camptothecin and Hoechst 33342 were used as the positive controls to examine the relative activity of the analogues.
4. Evaluation of biological activities other than topoisomerase Ⅰ inhibition:
1) Growth inhibition ($GI_{50}$) in 4 different cancer cell lines were determined.
2) NFκ-β activity evaluation.
3) Tyrosinase inhibition activity determined.
5. Structure-Activity Relationship:
1) Analogues selected based on physicochemical parameters (Hansch coefficient) : refered to Craig Plot.
2) Lipophilicity determined as capacity factor using HPLC.
3) Quantitative structure-activity relationship study and determination of correlation coefficients.
Summary of Results
1) The potent topoisomerase Ⅰ inhibition activity of terbenzimidazoles have been reported. The intermediates prepared for these terbenzimidazoles are of simple and rigid structured benzimidazoles which have revealed topoisomerase Ⅰ inhibition activity although showing different cleavage patterns from the terbenzimidazoles, suggesting them to be a new class of potential antitumor agents. Unlike terbenzimidazoles, the simple benzimidazoles possess a strict structural requirement for maintenance of biological activity. Neither . electronic nor lipophilic factors of functional groups at the 5 position seems to effect the topoisomerase I inhibition activity. H-bonding capability seems to be the determining factor at this position. The 2 position, on the other hand, needs an aromatic ring to maintain activity as exemplified in the activities of the 2-propyl and 2-phenyl analogues.
2) The structural requirement for cytotoxicity in RPMI 8402 cells were different from that of topoisomerase I inhibition. Lipophilic moiety at either the 5 or 2 position was necessary for cytotoxic activity. Better activity was observed for compounds substituted at the para position of the 2-phenyl ring. Although a definite structural requirement could not be obtained, the Cl derivative was the most potent. When SAR of analogues substituted at the 5 position was done in 4 different cancer cell lines, selective activiy was observed for the 5-CH₃ or 5- CF₃ analogue, suggesting that these two compounds need to be further studied. None of the compounds evaluated showed NFκ-β or tyrosinase inhibition. Future studies should be conducted to determine the exact mechanism of analogues which are cytotoxic but do not possess topoisomerase Ⅰ inhibition activity.
3) Unlike previous synthetic methods where Pd/C was used for the hydrogenation reactions, the use of Sm or SnCl₂in reduction reactions were effective methods for obtaining phenylenediamine intermediates. Relative lipophilicity was determined by reversed phase HPLC as log k′ values and showed a good correlation with the Hansch π values.
Conclusion
Although the exact mechanims of the cytotoxic benzimidazoles have not been determined yet, the structure-activity relationships study suggest a rigid structural requirement for these benzimidazole analogues. The significance of this project is in the discovery of novel potential anticancer agents which are the 5-methyl and 5-trifluoromethyl analogues of 2-(methoxyphenyl)benzimidazole. Future studies should follow in a more careful evaluation of the physicochemical properties of these simple compounds to further develop them into clinical agents. The development of these agents could bring about novel anticancer compounds that could contribute in solving the problem of multidrug resistance as well as be utilized in combination chemotherapy as a new class of antitumor agents. Moreover, an advantage of these analogues include a facile mass production system due to their simple chemical structure.

목차 Contents

• 표지 ...1
• 제출문 ...2
• 목차 ...3
• 연구개발사업 최종보고서 요약문 ...4
• Project Summary ...6
• Ⅱ. 총괄연구개발과제 연구결과...8
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...8
• 1-1. 연구배경...8
• 1-2. 연구목적...11
• 1-3. 연구범위...12
• 1-4. 연차별 추진계획...13
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...14
• 2-1. Benzimidazole 유도체의 선정 및 합성...14
• 2-2. 합성한 화합물들의 topoisomerase Ⅰ 저해 활성...15
• 2-3. 합성한 화합물들의 세포독성 (MTT assay)...16
• 2-4. 구조활성관계 (SAR) 연구...17
• 2-5. Benzimidazole 유도체의 추가 합성...18
• 2-6. Topoisomerase Ⅰ 이외의 기전 연구...21
• 2-7. 구조활성관계 연구...24
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...27
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...28
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획...31
• 6. 참고문헌...32
• 7. 첨부서류...33