초록 ▼

재조합 당단백질의 당화구조는 약물의 효력, 약효 지속기간, 안정성 등에 중요한 역할을 하고 있는 중요한 인자로서 공정 및 품질의 평가에 반드시 고려되어야 한다.
이에 재조합 당단백질 의약품의 개발 과정에서 당화 부위의 확인, Isoform 분포, Sialic acid를 포함한 단당류 함량, 올리고당 프로파일, 당쇄 구조, 기타 당 변형 그리고 당의 구조와 역가의 상관성 등에 대한 연구 등이 수행되어야 할 것이다.
본 연구에서는 유전자 재조합 당단백질 의약품의 당 구조 규명 및 평가 방법으로 향후 일반화할 수 있는 아래 분

재조합 당단백질의 당화구조는 약물의 효력, 약효 지속기간, 안정성 등에 중요한 역할을 하고 있는 중요한 인자로서 공정 및 품질의 평가에 반드시 고려되어야 한다.
이에 재조합 당단백질 의약품의 개발 과정에서 당화 부위의 확인, Isoform 분포, Sialic acid를 포함한 단당류 함량, 올리고당 프로파일, 당쇄 구조, 기타 당 변형 그리고 당의 구조와 역가의 상관성 등에 대한 연구 등이 수행되어야 할 것이다.
본 연구에서는 유전자 재조합 당단백질 의약품의 당 구조 규명 및 평가 방법으로 향후 일반화할 수 있는 아래 분석법들을 대표적 당단백질인 재조합 인 에리스로포이에틴을 이용하여 평가하고 이들 중 단당류 조성 분석법과 올리고당 조성 분석법의 표준 작업 절차(SOP)를 최종적으로 확립하였다.
1) Endo- 및 exo-glycosidase들의 조합을 이용한 differential de-glycosylation 방법으로 SDS-PAGE에서 N-glycosylation, O-glycosylation, sialic acid 등의 존재를 확인하는 방법
2) 단당류의 상대적 조성비를 평가하는 당단백질의 단당류 조성 분석법 구축물 위하여 당의 가수분해 조건 및 HPLC를 이용한 분리 조건들에 대한 최적화 연구
3) N-glycan 또는 O-glycan 등 올리고당 구조체를 분리하고 MS 분석을 통하여 올리고당의 분자량 및 다양성 확인
4) 일반 범용 HPLC를 이용한 N-glycan의 올리고당 분포 화인
5) 겔 전기영동법 또는 모세관 전기영동법을 이용한 당단백질의 동형체 분석과 동형체 분포 구성비와 생물학적 활성과의 상호 연관성
6) 당쇄의 서열 확인과 관련된 시험법
상기 열거한 다수의 시험법들 중, 특히 올리고당 조성 분석법은 static acid 함량 시험 및 isoform 분포 시험 등과 함께 배치별 일관성을 검증하는 시험법으로 매우 중요하며 이들 시험법들과 연계할 때 재조합 인 에리스로포이에틴의 생물학적 역가를 간접적으로 추론할 수 있는 중요한 분석법으로서 향후 다기관 협동 연구의 형태로 보완 발전시킬 필요성이 있는 것으로 판단된다.

Abstract ▼

Carbohydrate structures in the recombinant glycoproteins play important roles in efficacy, half-life and stability of the pharmaceuticals and should be regarded as a critical parameter in the evaluation of the process and quality.
So it is recommended to carry out the following characterization i

Carbohydrate structures in the recombinant glycoproteins play important roles in efficacy, half-life and stability of the pharmaceuticals and should be regarded as a critical parameter in the evaluation of the process and quality.
So it is recommended to carry out the following characterization items in the development of recombinant glycoprotein pharmaceuticals; localization of the glycosylation, isoform distribution, content of monosaccharides including sialic acid, oligosaccharide profile, the structure of carbohydrate chains, unusual carbohydrate modification(s), and correlation between structure and potency.
In this study, we reviewed the analytical methods which could be generally used to determine and evaluate the carbohydrate structures in the recombinant glycoprotein pharmaceuticals as follows, and finally established standard operating procedure for the monosaccharide compositional analysis and oligosaccharide profiling analysis, respectively.
1) the method to identify the N-glycosylation, O-glycosylation and sialylation of the protein in SDS-PAGE after differential de-glycosylation with combination of endo- and exo-glycosidases.
2) the characterization and optimization study of the hydrolysis procedure and separation condition in HPLC to establish the method for monosaccharide compositional analysis.
3) the isolation of N-glycan and O-glycan peptides and determination of the molecular weight, and the identification of diversities in N-glycan and O-glycan structures using MS analysis.
4) the oligosaccharide profiling of N-glycans with general-purpose HPLC system.
5) the correlation between isoform compositions and biological activities after determination of the isoform distribution by IEF or CZE method.
6) the review of the method regarding the carbohydrate sequencing of oligosaccharide
The oligosaccharide profiling is considered as especially useful method to evaluate the batch-to-batch consistency and the biological potency of the recombinant human erythropoietin together with the methods for isoform distribution and sialic acid determination. So we propose a kind of multi-center collaborative study to evaluate and develop the oligosaccharide profiling method further.

목차 Contents

• 용역연구개발사업최종보고서 ...1
• 표지 ...3
• 제출문 ...5
• 연구사업 최종보고서 요약문 ...7
• Project Summary ...8
• 목차 ...9
• 제1장 서론 ...11
• 가. 재조합 당단백질 의약품의 개발 현황 및 전망 ...11
• 나. 재조합 당단백질 의약품의 평가 방법 구축 필요성 ...11
• 제2장 국내·외 기술개발 현황 ...15
• 가. 재조합 당단백질의 당구조 분석의 일반적 흐름 및 난제 ...15
• 나. 국외 현황 ...17
• 다. 국내 현황 ...17
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ...19
• 가. 연구개발 수행 내용 요약 ...19
• 나. Differential deglycosylation을 통한 당화 특성의 확인 ...19
• 다. 단당류 조성 분석법의 확립 ...20
• 라. 올리고당 조성 분석법의 확립 ...33
• 마. 동형체 분포와 생물학적 활성의 연관성 탐색 ...38
• 바. 당쇄의 서열 확인 관련 시험법 제안 ...39
• 별첨 1. 단당류 조성 분석 표준 작업 절차 ...40
• 별첨 2. 올리고당 조성 분석 표준 작업 절차 ...45
• 제4장 연구개발 목표 달성도 및 대외기여도 ...50
• 가. 달성도 ...50
• 나. 대외 기여도 ...50
• 제5장 연구개발 결과의 활용성과 및 계획 ...51
• 가. 계량적 성과 ...51
• 나. 성과내용기술 ...51
• 다. 활용계획 ...51
• 제6장 기타 중요변경사항 ...52
• 제7장 참고문헌 ...53
• 총괄 연구과제 요약 ...55