보고서 정보
주관연구기관 |
세종대학교 Sejone university |
연구책임자 |
김양희
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참여연구자 |
임하나
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발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2004-05 |
주관부처 |
보건복지부 |
사업 관리 기관 |
세종대학교 Sejone university |
등록번호 |
TRKO200400001819 |
DB 구축일자 |
2013-04-18
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키워드 |
신경세포사멸.아연.이온채널.세포신호전달.신경성장인자.neuronal death.tPA.ion channel.cell signaling.nerve growth factor.
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초록
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I. 연구목표
tissue plasminogen activator (tPA)에 의해 배양된 대뇌피질 신경세포에서 유발된 아연독성이 거의 완벽하게 억제되며 kainate sezure에 의한 신경세포사멸도 현저하게 감소됨. 본 과제에서는 tPA에 의한 신경세포 사멸 억제기전을 규명하고자 하였으며 이 때 중요한 역할을 수행하는 세부 도메인 구조를 밝히고 이를 기초로 하며 필수구조로만 이루어진 mini-tPA를 뇌손상 치료제로 개발하고자 함.
II. 연구내용 및 범위
제1세부과제에서는 배양된 대뇌피질 신경세포에서 tPA
I. 연구목표
tissue plasminogen activator (tPA)에 의해 배양된 대뇌피질 신경세포에서 유발된 아연독성이 거의 완벽하게 억제되며 kainate sezure에 의한 신경세포사멸도 현저하게 감소됨. 본 과제에서는 tPA에 의한 신경세포 사멸 억제기전을 규명하고자 하였으며 이 때 중요한 역할을 수행하는 세부 도메인 구조를 밝히고 이를 기초로 하며 필수구조로만 이루어진 mini-tPA를 뇌손상 치료제로 개발하고자 함.
II. 연구내용 및 범위
제1세부과제에서는 배양된 대뇌피질 신경세포에서 tPA의 아연독성 억제 기전을 규명하고 tPA 변이주들의 세포 보호 효과를 연구하며 허혈 동물 모델에서 tPA와 tPA 변이주들의 신경세포 사멸 억제 효과를 연구함.
제2세부과제에서는 다양한 도메인 구조를 지리는 tPA 변이주들을 제조하여 분리정제하고, 단백질 특성을 분석하며, 세포 보호 효과에 필수적인 세부 구조를 규명하고, 단백질 구조와 기능의 상관관계를 분석함
III. 연구결과
1. tPA에 의한 아연독성 억제기전에서 단백질 분해효소로서의 역할 가능성 연구
tPA의 활성 억제제인 plasminogen activator inhibitor-1을 함께 처리하여도 tPA의 아연독성, 억제효과가 여전히 나타나며 catalytic serine을 alanine으로 치환하여 단백질 분해효소 기능을 없애 준 변이주 tPA (S478A-tPA)도 마찬가지로 세포 독성 억제 효과를 나타냄. 따라서 단백질 분해효소 기능은 tPA의 신경세포 독성 억제 기전에 중요하지 않음.
2. tPA와 공통된 도메인을 가지는 단백질들의 신경세포 사멸 억제 효과 연구
tPA는 아미노말단부터 finger-domain, EGF-doamin, 2개의 kringle-domain, serine pretense-domain으로 구성되어 있음. 이와 유사한 도메인 구조를 가지는 EGF, 키모트립신,플라스민, 유로키나아제, factor IX, 플라스미노젠, HGF 등을 아연독성이 유발된 배양된 신경세포에 처리함으로써 세포 보호 효과를 관찰하였음. 단백질 분해효소 도메인과 kringle 구조를 2개 이상 가지고 있는 HGF와 tPA만이 효과를 나타내었으며, 플라스미노젠의 경우 5개의 kringle 도메인을 가지고 있으나 세포 보호 효과를 보이지 않았음. 상기한 1번의 결과와 kringle 간의 아미노산 서열 다양성을 고려할 때, 특정 kringle 구조가 중요하게 작용할 가능성이 있음.
3. tPA의 아연 독성 억제 기전 연구
tPA가 low-density lipoprotein receptor-related protein (LRP)과 mannose receptor (MR)에 결합한다고 알려져 있었으나 아연독성 억제 기전에서 이들 수용체의 역할을 중요하지 않으며, 다른 receptor tyrosine kinase의 작용 가능성을 확인하였음. tPA는 세포 내 유입된 아연농도를 급속히 낮춰줌으로써 아연독성을 억제하는데 이는 아연의 세포 밖 방출이 증가되어 나타나는 현상임. 이 때 $Na^{+}/Ca^{2+}$ exchanger (NCX)가 중요한 역할을 하고 있음을 NCX 특이적인 억제제 처리와 세포 밖 $Na^{+}$ion 제거를 통해 확인할 수 있었음.
4. 허혈 동물 모델에서 tPA 보호 효과 연구
쥐의 permanent middle cerebral artery occlusion 모델에서 뇌척수액으로 직접 주입된 tPA와 S478A-tPA 변이주가 모두 현저하게 infarct의 크기와 부피를 감소시킴. 뇌졸중 치료제로써 tPA와 변이주 tPA의 개발 필요성 제시.
5. 각 도메인을 제거하거나 중복시킨 변이주 tPA 제조, 발현, 정제 및 구조적 안정성 연구
tPA 각 세부구조의 역할을 연구하기 위하여, 다양한 조합의 도메인을 지니는 tPA 변이주들을 생산하여 대장균에서 발현 정제함. 전체적인 구조가 불안정화된 tPA 변이주는 각 부위에 특징적인 기능을 알려주는 것이 아니라 단순한 단백질 불활성화를 나타내므로, 획득된 변이주들이 전체적으로 안정된 구조를 나타내는 지를 규명함.
6. 환원제 처리로 disulfide bonds에 의한 효과 연구
시스테인은 disulfide 결합을 형성하여 단백질이 특정 3차 구조를 형성 또는 유지하게 함. tPA도 시스테인들을 지니며 구조적 기능적 역할을 할 가능성이 있음. 환원제인 DTT 처리 시 disulfide 결합을 풀어 주어 단백질이 풀리며 신경세포 보호 작용을 수행하지 못하였으므로 disulfide-bond가 구조적, 기능적으로 중요한 역할을 함.
7. 변이주 tPA의 세포 독성 억제 연구
두 개의 kringle 도메인을 가지는 K1K2 변이주가 철 이온에 의한 산화성 손상으로부터 세포 보호하는 효과를 보임. 환원제를 처리하여 disulfide-bond를 풀어주면 이러한 효과가 나타나지 않음. 즉, K1K2 도메인의 전체적인 conformation이 중요함을 알 수 있음.
8. 신경성장인자로써 tPA의 역할 연구
배양된 대뇌피질 신경세포에 tPA를 처리하면 neurite outgrowth가 유발됨, 이때도 tPA의 단백질 분해효소 기능이 중요하게 작용하지 않으며 receptor tyrosine kinase의 연관성을 이들 특이적인 억제제 처리에 의해 확인할 수 있었음. tPA에 의한 neurite outgrowth 과정에 Src, Raf, ERK 등의 kinase 활성이 관찰되었으며 이들 각각의 특이적인 억제제를 처리하면 neurite outgrowth 효과가 사라짐. 이는 tPA가 중추신경계 발생과정동안 neurite 길이 신장과 시냅스 형성과정에 관련되어 있을 가능성을 의미함.
IV. 결론
1. tPA는 NCX 활성을 증가시킴으로써 아연의 세포 방출을 촉진하고 그 결과 아연독성 억제 효과가 나타남.
2. 허혈 동물 모델에서 tPA와 단백질 분해효소 기능이 제거된 변이주 S478A-tPA에 의해 infarct 형성이 현저하게 감소됨.
3. K1K2 도메인을 포함하는 mini-tPA 제조.
4. tPA에 의한 neurite outgrowth 효과 관찰 및 세포 신호전달 체계 규명.
Abstract
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I. Objectives
Tissue plasminogen activator (tPA) markedly attenuated zinc-induced cell death in cortical cultures. tPA also reduced kainate seizure-induced hippocampal neuronal death in adult rats, when injected into cerebrospinal fluid. However, the mechanism of tPA neuroprotection remains unkno
I. Objectives
Tissue plasminogen activator (tPA) markedly attenuated zinc-induced cell death in cortical cultures. tPA also reduced kainate seizure-induced hippocampal neuronal death in adult rats, when injected into cerebrospinal fluid. However, the mechanism of tPA neuroprotection remains unknown. Aims of present study are to investigate the mechanism of neuroprotection at the molecular level and to identify the essential domain(s) of tPA protein responsible for neuroprotective effects. The ultimate goal is production of a mini-tPA consisted of minimum effective domains, for a therapeutical application for brain injury.
II. Research Contents and ScopeThe
molecular mechanism of neuroprotection by tPA is studied using cortical cultures. Neuroprotective effects of tPA were also examined in an animal model of ischemic injury. To identify essential domains responsible for protection, tPA mutants with various combinations of domains were produced and their cellualr protective effects were examined.
III. Results
1. Neuroprotection by tPA is independent of its proteolytic activity.Protective effect of tPA was eliminated neither in a proteolytically inactive mutant S47BA-tPA, nor by excessive amounts of plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1). The results indicate that tPA protection against zinc toxicity is independent of its pretense activity.
2. Neuroprotective effects of other proteins containing common structural domainstPA is composed of five domains, the N-terminal finger-domain, a EGF-doamin, two kringle-domains, and a serine protease-domain. We examined relationship between the specific domain structure(s) and the neuroprotective function against zinc toxicity. Only tPA and HGF, containing two kringle domains and a protease domain in common, showed the protection against oxidative injury, suggesting that kringles are essential for protection. Although plasminogen has 5 kringles, it did not diminish oxidative demage. Considering sequence variations among kringle domains, there is a possibility that specific sequence or conformation of tPA kringle domain(s) plays a key role in neuroprotection.
3. Molecular mechanism of neuroprotection against zinc toxicity
Since tPA binds to low-density lipoprotein receptor-related protein (LRP) and mannose receptor (MR), a significant role of either receptor in the tPA protection has been suggested. However, a LRP function-blocking antibody, a MR function-blocking antibody, or excess mannose, did not abolish the protective effect of tPA. Instead, involvement of a receptor tyrosine kinase, like a EGFR family protein, is proposed by this study, tPA expedited recovery from cellular zinc overload by increasing zinc efflux in a tyrosine kinase-dependent manner. Inhibition of $Na^{+}/Ca^{2+}$ exchanger blocked both the recovery from zinc overload and the cytoprotection, suggesting that $Na^{+}/Ca^{2+}$ exchanger is the actual effector of tPA protection against zinc toxicity.
목차 Contents
- Ⅱ. 총괄연구개발과제 연구결과...8
- 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...8
- 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...19
- 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...29
- 5. 총괄연구개발과제의 연구성과...32
- 6. 연구개발결과의 파급효과...42
- 7. 첨부서류...43
- Ⅲ. 제 1 세부연구개발과제 연구결과...73
- 1. 제 1 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...74
- 2. 제 1 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...78
- 3. 제 1 세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...79
- 4. 제 1 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...88
- 5. 제 1 세부연구개발과제의 연구성과...90
- 6. 참고문헌...96
- Ⅳ. 제 2 세부연구개발과제 연구결과...98
- 1. 제 2 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...99
- 2. 제 2 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...102
- 3. 제 2 세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...104
- 4. 제 2 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...108
- 5. 제 2 세부연구개발과제의 연구성과...110
- 6. 참고문헌...118
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