초록 ▼

1. 연구개발 결과
곤충유래 유용물질 탐색 및 자원화 기술 개발을 위하여 본 연구에서는 다양한 종류의 곤충으로부터 유용 물질의 탐색을 실시하였으며 그 중 다수의 생리활성물질, 항생활성물질 또는 효소을 확보, 생산하였다. 그 결과를 요약하면 다음과 같다.
가. 한국산 곤충유래 항생물질을 포함한 유용물질의 탐색 개발
1) 잣나무넓적잎벌 (A cantholyda park i)로부터 항생활성물질 p- hydroxycinnamaldehyde의 분리 및 대량생산공정 개발
잣나무넓적잎벌의 유충으로부터 그람양성균, 그람음성균

1. 연구개발 결과
곤충유래 유용물질 탐색 및 자원화 기술 개발을 위하여 본 연구에서는 다양한 종류의 곤충으로부터 유용 물질의 탐색을 실시하였으며 그 중 다수의 생리활성물질, 항생활성물질 또는 효소을 확보, 생산하였다. 그 결과를 요약하면 다음과 같다.
가. 한국산 곤충유래 항생물질을 포함한 유용물질의 탐색 개발
1) 잣나무넓적잎벌 (A cantholyda park i)로부터 항생활성물질 p- hydroxycinnamaldehyde의 분리 및 대량생산공정 개발
잣나무넓적잎벌의 유충으로부터 그람양성균, 그람음성균 및 fungi에 대한 항생활성이 우수한 저분자 (분자량 148.05 Da)의 항생활성물질 p- hydrox ycinnamaldehyde를 분리하였으며 그 구조를 해명하였다. 또 이의 대량생산을 위한 유기화학적인 합성 공정을 개발하였으며 합성된 물질이 천연에서 분리된 물질과 동일한 활성을 나타냄을 확인하였다.
2) 말매미에서 분리된 cryptonin의 작용기작 해명
cryptonin은 말매미에서 분리된 항생활성펩타이드로서 24개의 아미노산으로 구성되어 있으며 그람양성균, 그람음성균 및 일부 fungi에 대한 높은 항생활성을 가지고 있다. cryptonin의 항생활성기작을 해명하기 위하여 N- 말단과 C- 말단으로부터 deletion을 실시하였으며 양친매성 α- helix가 활성에 중요한 역할을 담당하고 있음을 밝혔다. 또 confocal lasers canning micrope를 이용한 형광표지관찰을 통하여 이 펩타이드의 작용부위가 세포외피에 있음을 조사하였고 FACS를 이용하여 PI의 유입율을 조사하여 cryptonin이 대장균에서 세포막의 투과성을 교란함으로서 그 활성을 나타낸다는 것을 해명하였다.
3) 곤충공생미생물 유래 단백질 분해효소의 분리 및 특성과 대량생산
한국산 무당거미(N ephila clavata)의 장으로부터 분리한 단백질 분해효소 생산 미생물은 eubacteria, gamma- s ubdiv is ion, enterobacteriaceae에 속하는 기존에 전혀 보고된 적이 없는 새로운 미생물인 것이 밝혀 졌으며 (특허균주 기탁 0268BP) 이를 A ranicola proteolyticus로 명명하였다. 본 균주로부터 단백질 분해효소 51.5 kDa의 단백질 분해효소를 분리, 정제하였으며 그 구조적 특성분석을 위해 부분 아미노산 서열을 분석한 결과, S erratia m arces cens로부터 보고된 s rralys in(EC. 3. 4. 24. 40)과 높은 상동성을 나타내었다. 또한 단백질 분해효소의 유전자로부터 code되는 단백질의 아미노산 서열을 기존에 알려진 metalloprtease의 아미노산서열과 비교 하였다. 대부분의 metalloprotease에 보존되는 Zn 결합부위와 효소활성 부위의 아미노산 서열이 A . proteolyticus HY- 3 단백질 분해효소의 유전자의 아미노산 서열에서도 보존되는 것이 확인 되었으며 유전자로부터 code되는 단백질이 Zn를 갖는 metalloproteas e임을 알 수 있었다. 또한 생산된 단백질 분해효소를 분리 정제하는 sys tem을 확립할 수 있었으며 효소학적인 특성을 조사해본 결과, 저온에서 상대적으로 높은 활성을 유지하고 있었으며 넓은 범위의 pH에서 단백질 분해활성을 나타내었다. 발효조 대량 배양의 진행과정을 확립하여 산업적으로 이용 가치를 확인하였다.
4) 벌독으로부터 ACAT 와 CET P 활성저해물질의 분리
꿀벌독의 추출물이 acyl- CoA : choles terio acyltrans feras e (ACAT )와 choles teryl es ter trans fer protein (CET P)에 대한 강한 저해활성을 나타내었고, 역상 HPLC를 이용하여 이로부터 ACAT 와 CET P의 활성저해물질을 분리하였다. 매트리스보조레이저 탈착 질량분석기를 이용한 이온화법으로 분자량을 측정한 결과, 16,148±200 임을 아 수 있었고, 단백질 서열결정법을 이용하여 분리된 N- 말단 아미노산 서열 분석 결과 phos pholipas e A2와 높은 상동성을 보였다. 쥐간의 microsomal ACAT 와 사람의 CET P를 이용한 효소활성 분석에서 이 물질의 IC50치는 각각 3.9 ug /ml와 1.3 ug /ml 이었다.
5)흰점박이꽃무지의 대량인공사육 및 신기능 소재로의 활용에 대한 연구
민간생약곤충으로 이용되어지는 흰점박이꽃무지의 실내사육을 위한 인공사료를 개발하였으며 이를 이용하여 실내사육 및 대량사육을 실시하였다. 또 전통생약재료로서의 흰점박이꽃무지의 효능을 검정하기 위하여 간질환과 관련된 동물실험을 실시한 결과 현저한 간보호기능을 확인하였다.
나. 한국산거미류의 신기능성 단백질 분해효소 특성 및 이용
무당거미(N ephila clavata)로부터 tryps in유사 단백질분해효소를 정제하기 위하여 aceton fractionation, DEAE- Sepharose 및 SBT I- Sepharos e affinity chromatography의 과정을 통하여 정제하였다. 정제된 단백질분해효소의 분자량은 Superose 12HR을 이용한 F PLC와 SDS- PAGE로 확인한 결과 24- 25KDa의 s ing le polypeptide였다. 정제된 효소의 최적pH 및 pI값은 각각 pH 8.0 및 pH 4.0 이였고 정제효소의 효소능은 pH8.0 및 30- 50˚C에서 안정하였으며 전형적인 s erine protease 억제제인 APMSF , benzamidine, LBT I, SBT I 및 T LCK등으로 억제되었다. 이러한 결과로 미루어 정제된 단백질분해효소는 serine protease라고 생각된다.
한편 정제된 효소와 16종류의 synthetic peptide유도체 기질과의 반응결과 Z- Arg - Gly- Arg- pNA(S- 2765)및 Benz- Ile- pyroGlu- Gly- Arg - pNA(S- 2222)등에서 기질특이성을 나타냈으며 정제된 효소는 prothrombin을 thrombin으로 매우 원활히 전환시키는 특성을 갖고 있었다.
다. 생약곤충으로부터 생리활성물질 개발
1) 선퇴로부터 CET P 저해제의 분리 및 동정
한방제료로 이용되어지는 선퇴의 아세톤 추출물로부터 CET P에 대한 저해활성을 가진 물질을 분리하였다. 구조분석 결과 분리된 물질은 dioctyl phthalate로 판명되었으며, 이 화합물과 그 유도체들을 이용하여 CET P 활성에 대한 저해효과를 조사한 결과 dioctyl butalate의 경우 IC50치가 5.7 uM이었으며 dibutyl phthalate, dicyclohexyl phthalate와 benzyl butyl phthalate의 IC50치는 각각 30.8, 36.0, 126.5 μM로 비교적 강한 억제 활성을 나타내었다.
2) Pancreatic lipase 및 α- g lucos idase 저해활성물질의 탐색
여러 가지 생약곤충 시료로부터 pancreatic lipas e 및 α- glucos idase에 대한 저해활성물질을 탐색하였으며 그 중 전갈과 흰개미의 메탄올추출물에서 α- glucos idase에 대한 활성저해물질을 탐색하여 정제를 실시하였으며, 꿀벌의 독, 백강잠 및 동충하초의 메탄올 추출물로부터 pancrdatic lipas e 저해활성을 보이는 물질을 탐색하고 특히 꿀벌독으로부터 높은 저해활성물질을 분리하여 구조분석을 시도하였다.
2. 연구개발 결과의 활용 계획
본 연구결과를 통하여 관련 기초연구에 활용 및 유용곤충의 대량 사육등을 통한 농가의 소득 증대, 관련 신 산업군 창출이 가능하며 환경친화적 생물자원 이용기술 개발 효과와 관련 특허 및 결과 이용으로 국가 산업 경쟁력 강화에 활용할 계획이다.

Abstract ▼

1) An antibacterial subs tance was purified from larvae of the saw fly, Acantholyda parki S., and identified its molecular structure as p-hydroxycinnamaldehyde. We then synthes ized it by reduction of p- hydrox ycinnamic acid. The antibacterial activity of the synthetic p- hydroxycinnamaldehyde was

1) An antibacterial subs tance was purified from larvae of the saw fly, Acantholyda parki S., and identified its molecular structure as p-hydroxycinnamaldehyde. We then synthes ized it by reduction of p- hydrox ycinnamic acid. The antibacterial activity of the synthetic p- hydroxycinnamaldehyde was equal to that of the authentic subs tance. This molecule was found to have a broad antibacterial spectrum against not only Gram-negative, but also Gram-pos itive bacteria. Furthermore, it showed antifung al activity against Candida albicans . We sugges t that this subs tance may play arole in the defense system of this insect. This is the first report of p-hydroxycinnamaldehyde of animal origin.
2) We inevestigated the mecha nism of a ction of cry ptonin and compared it with the membr ane- activ e a ntimicrobial peptide magainin II. The amphipathic α- helix was impor tant for the a nt imicrobial act iv ity . To monitor the activesite of cry pton in in E . coli, biotin - labeled cry ptonin an d ma gain in II were in cub ated E . coli, and their localizat ion . b acterial cell sur face wasv is ualized using strepta vidin- FITC. Cell membr an e- permeab ilizin g phen omen on w as int es tig at ed u s in g flow cy tometr ic a nalysis . This results uggestthat the a ction mode of cry pton in might be, a membr an e- permeab ilizin g pept ide. Theser esults may provide new insight in to designing peptides with even higher antimicrobial a ctiv ity an dunderstan ding of molecu lar mech an ism of cell- killing action of an timicrob ial peptide.

목차 Contents

• 제출문 ...1
• 요약문 ...2
• SUMMARY ...11
• CONTENTS ...14
• 목차 ...15
• 제 1 장 서 론 ...16
• 제 2 장 한국산 곤충유래 항생물질을 포함한 유용물질의 탐색 개발 ...17
• 제 1 절 잣나무넓적잎벌로부터 항생활성물질 p- hydrox ycinnamaldehyde의 분리 ...17
• 제 2 절 말매미에서 분리한 항생활성물질 cryptonin의 작용양식 규명 ...29
• 제 3 절 곤충공생미생물 유래 단백질분해효소 분리 및 특성과 대량생산 ...48
• 제 4 절 벌독으로부터 ACAT 와 CET P 활성저해물질의 분리 ...82
• 제 5 절 흰점박이꽃무지의 대량인공사육 및 신기능 소재로의 활용에 대한 연구 ...94
• 제 3 장 한국산 거미류의 신기능성 단백질 분해효소 특성 및 이용 ...96
• 제 1 절 서 론...96
• 제 2 절 연구재료 및 방법...99
• 제 3 절 연구 결과...103
• 제 4 장 생약곤충으로부터 생리활성물질 탐색, 개발 ...122
• 제 1 절 선퇴로부터 CET P inhibitor의 분리 ...122
• 제 2 절 곤충유래 α- glycosidase 저해활성물질의 분리, 정제 및 특성분석 ...133
• 제 3 절 곤충유래 pancreatic lipase 저해활성물질 분리, 정제 및 특성분석 ...136
• 제 4 장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ...141
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ...143