초록 ▼

1. 연구의 최종목표
굴로부터 노로바이러스의 존재 여부를 신속히 확인할 수 있는 분석방법을 확립.
1) 1차년도에 개발된 굴로부터 노로바이러스를 검출하는 방법을 현장에 적용.
2) 현장적용 과정 중에 개선 할 점이 있으면 공정을 개선하여 검출방법을 확립.
3) 다른 패류에 개발된 검출법의 적용.
4) 1차년도의 연구를 통해 분석된 노로바이러스 염기서열에 기초한 real-time RT-PCR 진단기법 확립.
2. 연구내용 및 결과
제1세부과제
본 연구과제의 금년도 과제는 1) 1차년도에 개발

1. 연구의 최종목표
굴로부터 노로바이러스의 존재 여부를 신속히 확인할 수 있는 분석방법을 확립.
1) 1차년도에 개발된 굴로부터 노로바이러스를 검출하는 방법을 현장에 적용.
2) 현장적용 과정 중에 개선 할 점이 있으면 공정을 개선하여 검출방법을 확립.
3) 다른 패류에 개발된 검출법의 적용.
4) 1차년도의 연구를 통해 분석된 노로바이러스 염기서열에 기초한 real-time RT-PCR 진단기법 확립.
2. 연구내용 및 결과
제1세부과제
본 연구과제의 금년도 과제는 1) 1차년도에 개발된 굴로부터 노로바이러스를 검출하는 방법을 현장에 적용하여보고 2) 이 과정 중에 개선 할 점이 있으면 공정을 개선하여 검출방법을 확립하고 3) 다른 패류에 개발된 검출법을 적용해 보는 것이다. 본 연구팀의 결과에 따르면 Genogroup I의 경우 전체 조사대상 156개 시료 중 19개가 노로바이러스에 오염된 것으로 나타나 12.2%의 오염율을 보였다. Genogroup II의 경우 156개중 3개의 시료가 오염되어 1.9%의 오염율을 보였다. GI의 경우 구입지역별로 보면 부산이 36개중 6개로 가장 많았고 경주가 47개중 5개, 고흥은 19개중 4개, 서산은 42개중 4개 였다. 부산의 경우 검출된 6개 시료 중 1개는 통영산 이었고 다른 1개는 거제산으로 확인되었으나 나머지 4개는 재래시장에서 판매되고 있는 것으로 산지를 확인할 수 없었다. 경주의 경우 검출된 5개 시료 중 통영산이 2개, 고성산이 1개였고 나머지 2개는 재래시장에서 판매되고 있는 것이었다. 고흥 4개와 서산 4개는 산지로부터 직접 구입한 것이었다. GII의 경우 거제산 2개와 서산산 1개에서 노로바이러스를 확인할 수 있었다. 검출방법의 확립을 위해서는 검출법을 쉽게 적용할 수 있게 하기 위해 polyethylene glycol (PEG) 침전을 위한 PEG8000의 농도를 1차침전의 경우 11%, 2차침전의 경우 13%로 고정하였고 편이를 위해 과정을 단순화시켰다. 본 연구진이 키조개에 개발된 검출법을 적용해 본 결과 GI의 경우 초기감염 5 RT-PCR unit, GII의 경우 8 RT-PCR unit 까지 검출이 가능하였다. 이는 전년도 굴에서 확인한 것과 비슷한 수준으로 판단되어 굴과 키조개 간에 차이는 없는 것으로 판단되었다.
제2세부과제
1차년도를 통해 국내 노로바이러스의 유전자 검출의 최적부위라고 검정된 DRF1과 DRF2의 연결부위를 표적유전자로 설정하였다. 본 실험실에 확보된 노로바이러스 양성 검체로부터 각각 GI, GII의 표적유전자 부위를 증폭한 후 cDNA를 합성하고 이를 in vitro transcription system에 삽입하여 원하는 RNA제조를 할 수 있었다. 노로바이러스가 아닌 다른 enteric virus들 (astrovirus, enterovirus, rotavirus, sapovirus 등)을 대상으로 real-time RT-PCR을 수행한 후 노로바이러스에 대한 특이성을 검정하였다. 제조된 표준 RNA를 단계별로 희석하여 준비한 후 각각 진단방법을 통해 민감도를 분석하여 검출한계를 결정할 수 있었다. 전국에서 수집된 설사환자 검체 200개를 대상으로 검출시험을 수행하고 기존의 방법과 비교해 본 바 월등히 검출한계가 높아짐을 확인할 수 있었다.

Abstract ▼

1. Title of the project:
Establishment of detection method for noroviruses
2. Results
Part 1.
1) Survey for oysters collected from 6 locations (Gyeongju, Pohang, Busan, Daegu, Goheung, Seosan) between Feb 13 to April 7 was carried out utilizing the norovirus detection procedure developed

1. Title of the project:
Establishment of detection method for noroviruses
2. Results
Part 1.
1) Survey for oysters collected from 6 locations (Gyeongju, Pohang, Busan, Daegu, Goheung, Seosan) between Feb 13 to April 7 was carried out utilizing the norovirus detection procedure developed in this project (RT-PCR/nested PCR). Nineteen of 156 oyster samples (12.2%) were norovirus genogroup I positive, whereas norovirus genogroup II was detected in 3 out of 156 (1.9%) oyster samples. 2) The norovirus detection procedure was modified for easy application. The polyethylene glycol 8000 (PEG) concentration was adjusted to 11% for the 1st precipitation , while the concentration was adjusted to 13% for the 2nd precipitation. The procedure was simplified for convenience. 3) The procedure was applied to the comb pen shellfish. As a result , the detection limit was 5 RT-PCR unit/25 g comb pen shellfish for genogroup I, and 8 RT-PCR unit/25g comb pen shellfish for genogroup II.
Part 2.
The region which connects the ORF 1 and ORF 2 was utilized as a target gene. We amplified the target region using the norovirus positive stool sample and constructed cDNA. The cDNA was cloned into the in vitro transcription system. Real-time RT-PCR was performed with other enteric viruses (astrovirus, enterovirus, rotavirus, sapovirus etc.) and found that it is specific to noroviruses. We could determine the detection limit by using the serially diluted reference RNA. We compared the detection limit for the norovirus using the 200 patient stool sample with conventional RT-PCR, and concluded that real-time RT-PCR detects much better than the conventional one.

목차 Contents

• 연구결과보고서 ...1
• 제출문 ...2
• 목차 ...3
• I. 연구개발결과 요약문 ...4
• 국문요약문 ...4
• 영문요약문 ...5
• II. 총괄연구개발과제 연구결과 ...6
• 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...6
• 1.1 총괄연구개발과제의 목표 ...6
• 1.2 총괄연구개발과제의 목표달성도 ...8
• 1.3 국내·외 기술개발 현황 ...8
• 제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ...10
• 제1세부과제 ...10
• 1. 연구내용...10
• 2. 연구방법...10
• 제2세부과제 ...12
• 1. Real-time RT-PCR 진단기법 확립...12
• 제3장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...14
• 제1세부과제 ...14
• 제2세부과제 ...20
• 1. Real-time RT-PCR진단기법 확립...20
• 2. Conventional RT-PCR과 확립된 real-time RT PCR의 민감도 비교...26
• 3. 확립된 real-time RT-PCR 진단기법 적용...27
• 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...30
• 제1세부과제 ...30
• 제2세부과제 ...31
• 제5장 총괄연구개발과제의 연구성과 ...33
• 5.1 활용성과 ...33
• 5.2 활용계획 ...34
• 제6장 기타 중요변경사항 ...35
• 제7장 참고문헌 ...36
• 제8장 첨부서류 ...40
• III. 제1세부연구개발과제 연구결과 ...41
• 제1장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...42
• 1.1 세부연구개발과제의 목표 ...42
• 1.2 세부연구개발과제의 목표달성도 ...43
• 1.3 국내·외 기술개발 현황 ...44
• 제2장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ...45
• 1. 최종연구개발의 내용 ...45
• 2. 연구방법 ...45
• 제3장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...48
• 1) 현장시료에 노로바이러스 검출법의 적용 ...48
• 2) 전년도 과제에서 개발된 오염된 굴로부터 바이러스 농축 방법의 보완 ...51
• 3) 노로바이러스 검출법 적용대상의 확대 ...52
• 제4장 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...54
• 제5장 세부연구개발과제의 연구성과 ...56
• 5.1 활용성과 ...56
• 5.2 활용계획 ...57
• 제6장 기타 중요변경사항 ...58
• 제7장 참고문헌 ...59
• 제8장 첨부서류 ...62
• 세부 연구과제 요약 ...63
• IV. 제2세부연구개발과제 연구결과 ...65
• 제1장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...66
• 1.1 세부연구개발과제의 목표 ...66
• 1.2 세부연구개발과제의 목표달성도 ...69
• 1.3 국내·외 기술개발 현황 ...70
• 제2장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ...71
• 2.1 Real-time RT-PCR 진단기법 확립 ...71
• 2.2 Real-time RT PCR법과 기존의 RT-PCR법과의 비교분석 ...71
• 2.3 개발된 real-time RT-PCR 진단기법 적용 ...71
• 제3장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...72
• 3.1 Real-time RT-PCR 진단기법 확립 ...72
• 3.2 Conventional RT-PCR과 확립된 real-time RT-PCR의 민감도 비교 ...77
• 3.3 확립된 real-time RT-PCR 진단기법 적용 ...78
• 제4장 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...81
• 제5장 세부연구개발과제의 연구성과 ...82
• 5.1 활용성과 ...82
• 5.2 활용계획 ...82
• 제6장 기타 중요변경사항 ...83
• 제7장 참고문헌 ...84
• 제8장 첨부서류 ...85
• 세부 연구과제 요약 ...86
• 총괄 연구과제 요약 ...88